本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnas的引物和試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和死亡率均居男、女惡性腫瘤的第三位，嚴重威脅人類健康。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個涉及遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)異常的復(fù)雜過程，雖然經(jīng)過長期研究，至今仍未能建立易于推廣的有效診斷手段，導(dǎo)致大部分患者就診時己處于中晚期，喪失了治愈的最佳時機。目前可用于結(jié)直腸癌早期診斷的手段非常有限，如結(jié)直腸鏡檢查、糞便隱血實驗、影像學(xué)檢查、血腫瘤標志物檢測等，因依從性差、敏感性和/或特異性不高等原因，臨床應(yīng)用還存在不足。因此，尋找并鑒定與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的新型分子標志物用于結(jié)直腸癌的早期診斷仍是目前臨床關(guān)注的焦點。

長鏈非編碼rnas(lncrnas)參與調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，并且在不同腫瘤中存在各自的表達模式，有望成為一類重要的腫瘤標志物。近年研究顯示，lncrnas可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)修飾、x染色體沉默、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ling等研究發(fā)現(xiàn)，lncrnaccat2在微衛(wèi)星穩(wěn)定的結(jié)直腸癌組織中呈過表達，能夠促進腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移和染色質(zhì)不穩(wěn)定(ling,h.etal(2013)genomeresearch,23:1446-1461)。takahashi等發(fā)現(xiàn)lncrnapvt-1可通過抑制tgf-β信號通路和凋亡信號來促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，是預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的一項良好指標(takahashi,y.etal(2014)britishjournalofcancer,110:164-171)。ji等研究發(fā)現(xiàn)，lncrnamalat1能夠激活結(jié)直腸癌細胞中的wnt/β-catenin信號途徑，從而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲(ji,q.etal(2013)plosone,8:e78700)。nissan等采用代表性差異分析法發(fā)現(xiàn)了一種與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的lncrna——ccat1，進一步研究顯示ccat1在結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段就明顯升高，有望成為一種潛在的結(jié)直腸癌早期診斷標志物(nissan,a.etal(2012)internationaljournalofcancer,130:1598-1606)。近年來關(guān)于lncrnas的研究進展迅猛，各類lncrnas被大量發(fā)現(xiàn)，大部分臨床研究主要集中在結(jié)直腸癌組織，如何利用無創(chuàng)性診斷手段對lncrnas進行分析，已成為腫瘤診斷領(lǐng)域關(guān)注的焦點。近年來，外泌體(exosomes)的出現(xiàn)成為液態(tài)活檢的主要檢測物，為腫瘤的無創(chuàng)檢測提供了一條新的途徑。

目前實時熒光定量pcr方法是檢測lncrnas的主要方法，但由于血清外泌體中l(wèi)ncrnas的豐度較低，臨床應(yīng)用易出現(xiàn)假陰性，因此有必要開發(fā)一種敏感性高的血清分泌型lncrnas的檢測方法，為結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)提供幫助。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnas的引物和試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供血清分泌型lncrnaloc100130899作為結(jié)直腸癌診斷標志物在制備結(jié)直腸癌診斷試劑中的用途。

所述血清分泌型lncrnaloc100130899是genebank數(shù)據(jù)庫上報的核苷酸序列nr_039988.1。

進一步的，本發(fā)明還提供檢測血清分泌型lncrnaloc100130899的試劑在制備結(jié)直腸癌診斷試劑中的用途。

本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測上述血清分泌型lncrnaloc100130899的引物。

本發(fā)明的引物包括：一對outer引物和一對inner引物；所述outer引物的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述inner引物的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。具體如下：

outer-f：5’-agaacaggcagtatgtccgc-3’；(seqidno.1)

outer-r：5’-aagccactggaggtcacaac-3’；(seqidno.2)

inner-f：5’-agtgctgtgggtacaagcaa-3’；(seqidno.3)

inner-r：5’-cccagcaaatatccaccgga-3’；(seqidno.4)

上述的引物在制備檢測結(jié)直腸癌的試劑和/或試劑盒中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測結(jié)直腸癌的試劑盒，所述試劑盒中包括：seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物，和seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物。

所述試劑盒中還包括：內(nèi)參基因gapdh的一對outer引物和一對inner引物，內(nèi)參基因ubc的一對outer引物和一對inner引物，以及pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液；

所述內(nèi)參基因gapdh的outer引物的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；內(nèi)參基因gapdh的inner引物的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；

所述內(nèi)參基因ubc的outer引物的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；內(nèi)參基因ubc的inner引物的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)液由dna聚合酶、dntps、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。

優(yōu)選的，所述qpcr反應(yīng)液由sybergreenⅰ熒光染料、dna聚合酶、dntps、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。

優(yōu)選的，上述試劑盒中，seqidno.1-seqidno.12所示引物的濃度均為10nm；dna聚合酶的濃度為100u/ml；dntps的濃度為0.2mm；氯化鎂的濃度為6mm；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的濃度為16.5mm；氯化鉀的濃度為89.3mm。

上述引物或試劑盒在定性或定量檢測血清分泌型lncrnaloc100130899表達量中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnaloc100130899表達量的方法，包括如下步驟：

(1)提取血清分泌型rnas；

(2)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna；

(3)以cdna為模板進行巢氏實時定量pcr擴增；同時將內(nèi)參基因gapdh、ubc進行逆轉(zhuǎn)錄巢氏實時定量pcr擴增；

(4)采用2^-△△cq法計算lncrnaloc100130899的相對表達量。

步驟(1)中，提取血清分泌型rnas采用的方法為：將血清與exoquick^tmexosomeprecipitationsolution試劑混勻，室溫靜置；然后離心，棄上清，加入trizol試劑混勻，室溫靜置，加入氯仿，劇烈震蕩，室溫靜置，離心，取上清加入異丙醇，室溫靜置，離心，棄上清，加入75％乙醇洗滌，離心，棄上清，加depc水溶解備用。

步驟(2)中，逆轉(zhuǎn)錄的條件為：37℃15min、85℃5s。

步驟(3)中，以cdna為模板進行巢氏實時定量pcr擴增包括兩階段pcr反應(yīng)，第一階段pcr反應(yīng)：以cdna為模板，以seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物作為擴增引物，在pcr反應(yīng)液中進行反應(yīng)；第二階段pcr反應(yīng)：以第一階段的pcr產(chǎn)物為模板，以seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物作為擴增引物，在qpcr反應(yīng)液中進行反應(yīng)。

優(yōu)選的，第一階段pcr反應(yīng)中，反應(yīng)的條件為：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min進行25個循環(huán)，最后72℃10min。

優(yōu)選的，第二階段pcr反應(yīng)中，反應(yīng)的條件為：首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s進行35個循環(huán)，記錄cq值。

步驟(3)中，內(nèi)參基因gapdh、ubc進行巢氏實時定量pcr擴增也包括兩階段pcr反應(yīng)，擴增所采用的引物分別如seqidno.5-seqidno.12所示，擴增條件與以cdna為模板進行巢氏實時定量pcr擴增的條件相同。

步驟(4)中，lncrnaloc100130899的相對表達量的計算方法為：△cq＝[cq(待測樣本)-cq(校對樣本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(內(nèi)參基因)，cq(內(nèi)參基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

本發(fā)明的上述檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnaloc100130899表達量的方法并不是以疾病的診斷和治療為目的。

上述技術(shù)方案具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一種新的結(jié)直腸癌的診斷標志物——血清分泌型lncrnaloc100130899，并對該診斷標志物的診斷價值進行了評估，結(jié)果表明：血清分泌型lncrnaloc100130899對結(jié)直腸癌的診斷效能為0.839(95％ci0.786-0.884)，明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標志物cea的診斷效能0.624(95％ci0.558-0.687，p<0.001)。

(2)針對新發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌的診斷標志物，本發(fā)明采用的巢氏實時定量pcr對該診斷標志物進行檢測，巢氏實時定量pcr擴增為兩次pcr擴增反應(yīng)過程，第一階段的pcr反應(yīng)是對原始cdna模板進行擴增，避免了血清分泌型rna豐度較低的問題，使得痕量rna即可被擴增檢測到，大大提高了檢測的靈敏度。

本發(fā)明采用outer引物和inner引物進行兩次pcr反應(yīng)，inner引物擴增的模板是outer引物擴增的產(chǎn)物，因此第二階段反應(yīng)也是對第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，能夠更好的保證反應(yīng)的準確性，避免一次pcr反應(yīng)非特異性擴增的引發(fā)的假陽性。

本發(fā)明建立的結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnaloc100130899檢測方法，為結(jié)直腸癌的輔助診斷提供了重要的參考依據(jù)。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限定。

圖1：本發(fā)明試劑盒敏感性評價結(jié)果；

圖2：本發(fā)明試劑盒特異性評價結(jié)果；

圖3：血清分泌型lncrnaloc100130899在結(jié)直腸癌患者中的表達；

圖4：血清分泌型lncrnaloc100130899對結(jié)直腸癌的診斷價值。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當理解的是，當在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，由于血清exosomes中l(wèi)ncrnas的豐度較低，臨床應(yīng)用實時熒光定量pcr進行檢測易出現(xiàn)假陰性?；诖?，本發(fā)明首次提出了一種采用巢氏實時熒光定量pcr方法檢測lncrnas的方法。

在本申請的一種實施方案中，提供了一種巢氏實時熒光定量pcr方法檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnaloc100130899的引物，包括一對outer引物和一對inner引物，引物序列如下所示：

loc100130899-outer-f：5’-agaacaggcagtatgtccgc-3’；(seqidno.1)

loc100130899-outer-r：5’-aagccactggaggtcacaac-3’；(seqidno.2)

loc100130899-inner-f：5’-agtgctgtgggtacaagcaa-3’；(seqidno.3)

loc100130899-inner-r：5’-cccagcaaatatccaccgga-3’；(seqidno.4)。

在本申請的另一種實施方案中，提供了一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnas的的試劑盒，所述試劑盒中包括：上述seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物，和seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物；內(nèi)參基因gapdh的一對outer引物和一對inner引物，內(nèi)參基因ubc的一對outer引物和一對inner引物，以及pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液；

所述內(nèi)參基因gapdh的outer引物的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；內(nèi)參基因gapdh的inner引物的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；

所述內(nèi)參基因ubc的outer引物的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；內(nèi)參基因ubc的inner引物的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。具體如下：

gapdh-outer-f：5’-tcaaggctgagaacgggaag-3’；(seqidno.5)

gapdh-outer-r：5’-tgatggcatggactgtggtc-3’；(seqidno.6)

gapdh-inner-f：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’；(seqidno.7)

gapdh-inner-r：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’；(seqidno.8)

ubc-outer-f：5’-tcggccttagaaccccagta-3’；(seqidno.9)

ubc-outer-r：5’-gagatccctccgcagaatcg-3’；(seqidno.10)

ubc-inner-f：5’-acgggacttgggtgactcta-3’；(seqidno.11)

ubc-inner-r：5’-atcgccgagaagggactact-3’；(seqidno.12)

作為優(yōu)選的方案，所述試劑盒中各物質(zhì)的濃度如下：

loc100130899-outer-f：10nm；loc100130899-outer-r：10nm；loc100130899-inner-f：10nm；loc100130899-inner-r：10nm；gapdh-outer-f：10nm；gapdh-outer-r：10nm；gapdh-inner-f：10nm；gapdh-inner-r：10nm；ubc-outer-f：10nm；ubc-outer-r：10nm；ubc-inner-f：10nm；ubc-inner-r：10nm；dna聚合酶：100u/ml；dntps：0.2mm；氯化鎂：6mm；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽：16.5mm；氯化鉀：89.3mm；1×sybergreenⅰ熒光染料。

在本申請的又一種實施方案中，提供了一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnaloc100130899表達量的方法，步驟如下：

(1)提取血清分泌型rnas：取250μl血清與63μlexoquick^tmexosomeprecipitationsolution試劑混勻，室溫靜置30min；然后1500g離心30min，棄上清，加入750μltrizol試劑混勻，室溫靜置5min，加入200μl氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，12000g離心15min，取上清加入500μl異丙醇，室溫靜置10min，12000g離心10min，棄上清，加入1ml75％乙醇洗滌，7500g離心5min，棄上清，加10μldepc水溶解備用。

(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃15min、85℃5s。

(3)巢氏實時定量pcr擴增：取1:10稀釋cdna為模板，加入outer引物和pcr反應(yīng)液，進行第一階段pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min進行25個循環(huán)，最后72℃10min。取1:10稀釋的第一階段pcr產(chǎn)物，加入inner引物和qpcr反應(yīng)液，進行第二階段pcr反應(yīng)，首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s進行35個循環(huán)，記錄cq值。內(nèi)參基因gapdh、ubc的逆轉(zhuǎn)錄巢氏實時定量pcr擴增，除引物外，其它方法相同；

(4)數(shù)據(jù)分析：lncrnaloc100130899的相對表達量采用2^-△△cq法計算，△cq＝[cq(待測樣本)-cq(校對樣本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(內(nèi)參基因)，cq(內(nèi)參基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

本發(fā)明實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

(1)試劑盒的組成及配制：

本申請在試驗過程中發(fā)現(xiàn)了一種新的結(jié)直腸癌的診斷標志物—血清分泌型lncrnaloc100130899。本申請的試劑盒是專門針對該診斷標志物的檢測而進行設(shè)計的。

本申請的試劑盒中包含：檢測血清分泌型lncrnaloc100130899的引物。

所述引物是根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上報的核苷酸序列nr_039988.1為模板而進行優(yōu)化設(shè)計的，優(yōu)化設(shè)計后的引物序列見表1。

表1引物序列及pcr產(chǎn)物長度

由于血清外泌體中l(wèi)ncrna非常容易降解，因此對血清外泌體中l(wèi)ncrna檢測的難度很大。我們試驗過程中針對lncrnaloc100130899基因不同區(qū)域設(shè)計了多組引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其擴增效果差異很大。表2給出的是我們在試驗過程中針對lncrnaloc100130899基因三個區(qū)域設(shè)計outer引物進行pcr擴增，發(fā)現(xiàn)第三對引物具有較好的擴增效果，因此采用第三對引物作為后續(xù)巢氏實時定量pcr的outer引物。

表2引物序列的優(yōu)選及相應(yīng)的擴增區(qū)域

所述專用試劑盒還包括內(nèi)參基因gapdh的一對outer引物和一對inner引物以及內(nèi)參基因ubc的一對outer引物和一對inner引物和pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液。pcr反應(yīng)液由dna聚合酶、dntps、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。qpcr反應(yīng)液由sybergreenⅰ熒光染料、dna聚合酶、dntps、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成。

所述內(nèi)參基因gapdh-outer-f引物：5’-tcaaggctgagaacgggaag-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因gapdh-outer-r引物：5’-tgatggcatggactgtggtc-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因gapdh-inner-f引物：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因gapdh-inner-r引物：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因ubc-outer-f引物：5’-tcggccttagaaccccagta-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因ubc-outer-r引物：5’-gagatccctccgcagaatcg-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因ubc-inner-f引物：5’-acgggacttgggtgactcta-3’；10nm。

所述內(nèi)參基因ubc-inner-r引物：5’-atcgccgagaagggactact-3’；10nm。

所述sybergreenⅰ熒光染料在pcr反應(yīng)液為1×sybergreenⅰ熒光染料。

所述dna聚合酶在pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液中的終濃度為100u/ml。

所述dntps在pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液中的終濃度為0.2mm。

所述氯化鎂在pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液中的終濃度為6mm。

所述三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽在pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液中的終濃度為16.5mm。

所述氯化鉀在pcr反應(yīng)液和qpcr反應(yīng)液中的終濃度為89.3mm。

(2)病例資料：

2016年1月至2016年6月期間山東大學(xué)齊魯醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者132例，男75例，女56例，年齡27～85歲，中位年齡56歲，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診，且為初次診斷，之前未接受任何治療。同時選擇同期在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院查體的健康體檢者100例作為對照，男59例，女41例，年齡25～81歲，中位年齡53歲，所有受試者均未合并疾病，肝心腎功能正常，既往無腫瘤病史。兩組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。

(3)血清標本采集：血清收集于促凝管內(nèi)，4℃1600×g離心10min，然后進一步4℃16000×g離心10min，收集血清，置-80℃凍存待測。

(4)提取血清分泌型rnas：取250μl血清與63μlexoquick^tmexosomeprecipitationsolution試劑混勻，室溫靜置30min；然后1500g離心30min，棄上清，加入750μltrizol試劑混勻，室溫靜置5min，加入200μl氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，12000g離心15min，取上清加入500μl異丙醇，室溫靜置10min，12000g離心10min，棄上清，加入1ml75％乙醇洗滌，7500g離心5min，棄上清，加10μldepc水溶解備用。

(5)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃15min、85℃5s。

(6)巢氏實時定量pcr擴增：取1:10稀釋cdna為模板，加入outer引物和pcr反應(yīng)液，進行第一階段pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min進行25個循環(huán)，最后72℃10min。取1:10稀釋的第一階段pcr產(chǎn)物，加入inner引物和qpcr反應(yīng)液，進行第二階段pcr反應(yīng)，首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s進行35個循環(huán)，記錄cq值。內(nèi)參基因gapdh、ubc的逆轉(zhuǎn)錄巢氏實時定量pcr擴增，除引物外，其它方法相同；

(7)數(shù)據(jù)分析：lncrnaloc100130899的相對表達量采用2^-△△cq法計算，△cq＝[cq(待測樣本)-cq(校對樣本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(內(nèi)參基因)，cq(內(nèi)參基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

(8)檢測結(jié)果：

1)試劑盒敏感性評價

提取ht29結(jié)直腸癌細胞系總rna，逆轉(zhuǎn)錄為cdna，然后進行10倍倍比梯度稀釋，得到10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍稀釋的cdnas，采用該試劑盒及方法檢測lncrnaloc100130899，并與傳統(tǒng)實時熒光定量pcr方法比較。結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，采用該試劑盒及方法lncrnaloc100130899檢測限可達到10⁷倍稀釋；而傳統(tǒng)方法檢測限僅可達到10⁴倍稀釋，表明本試劑盒及方法的靈敏度比傳統(tǒng)方法高1000倍。

2)試劑盒特異性評價

對最終pcr的產(chǎn)物進行正向和反向測序，其中正向測序序列為：

5’-tccatccccgactttcctgtttcctcatgtgtcaaatggggatgatctcgagacgactctccagagtaaccacgtgaagcacctagcacaggggctgacgcaaacagctgggcatcggaggagcctccagggttgtgacctccagtggctt-3’；

反向測序序列為：

5’-atcaggccagctgtttgcgtcagcccctgtgctaggtgcttcacgtggttactctggagagtcgtctcgagatcatccccatttgacacatgaggaaacaggaaagttcggggatgtgaaattgcttgctggggtcattagctgttcggtggcagaga-3’。

將正、反向測序序列進行拼接，經(jīng)blast分析，發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物與genebank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中l(wèi)ncrnaloc100130899序列完全匹配，說明本試劑盒擴增的最終pcr產(chǎn)物確為lncrnaloc100130899分子。結(jié)果見圖2。

3)血清分泌型lncrnaloc100130899在結(jié)直腸癌患者中的表達

采用該試劑盒及方法對132例結(jié)直腸癌患者和100例健康體檢者血清中分泌型lncrnaloc100130899進行檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血清分泌型lncrnaloc100130899的中位表達水平為0.334(0.021-0.659)，明顯高于健康體檢者水平[0.151(0.090-0.390)]，兩組經(jīng)mann-whitneyu檢驗比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)果見圖3。

4)血清分泌型lncrnaloc100130899對結(jié)直腸癌的診斷價值

以132例結(jié)直腸癌患者作為陽性組，100例健康體檢者作為陰性組，medcalc9.3.9.0統(tǒng)計軟件的受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)分析，結(jié)果見圖4，由圖4可知，血清分泌型lncrnaloc100130899對結(jié)直腸癌的診斷效能為0.839(95％ci0.786-0.884)，明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標志物cea的診斷效能0.624(95％ci0.558-0.687，p<0.001)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東大學(xué)齊魯醫(yī)院

<120>一種檢測結(jié)直腸癌血清分泌型lncrnas的引物和試劑盒

<130>2017

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aagccactggaggtcacaac20

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