專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物及其檢測(cè)方法、試劑盒和生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人血清/血漿中微小核糖核酸分子的分離、定性和定量分析，同時(shí)也涉及結(jié)直腸癌的各種臨床指征。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是一種檢測(cè)結(jié)直腸癌 病人血清/血漿中微小核糖核酸的方法，通過(guò)結(jié)直腸癌病人血清/血漿中微小核糖核酸的 變化，在體外診斷結(jié)直腸癌，判斷結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程，預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌并發(fā)癥的發(fā)生和結(jié)直腸 癌復(fù)發(fā)的幾率、以及結(jié)直腸癌的預(yù)后，并分析藥效和療效。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于胃癌和食道癌。在我國(guó)常見(jiàn)惡 性腫瘤死亡中，結(jié)直腸癌患者在男性占第五位，女性占第六位。近二十年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病 率在逐漸增加，同時(shí)，其發(fā)病年齡趨向老齡化。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的 第二位惡性腫瘤。不同國(guó)家的發(fā)病率相差60倍。好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界 處，占60%。發(fā)病多在60 70歲，50歲以下不到20%。結(jié)直腸癌的診斷主要依據(jù)直腸指檢、直腸鏡或乙狀結(jié)腸鏡檢查以及鋇劑灌腸、纖 維結(jié)腸鏡檢查結(jié)果。結(jié)直腸癌早期癥狀不典型，甚至無(wú)癥狀，經(jīng)常會(huì)被誤診，誤診率高達(dá) 30%。因此，尋找結(jié)直腸癌標(biāo)記物并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)已經(jīng)成為結(jié)直腸癌的早期診斷和治 療的極其緊迫和重要的前提條件。盡管越來(lái)越多的疾病標(biāo)記物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床疾病的普查、診斷和療效的 監(jiān)控，但是它們的臨床應(yīng)用效果還存在著明顯不足。例如，腫瘤標(biāo)記物、乳酸脫氫酶、癌胚抗 原等已被廣泛應(yīng)用于臨床，但是這些疾病標(biāo)記物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)癌癥早期診斷的需要， 其主要原因有兩個(gè)方面(1)上述疾病標(biāo)記物的靈敏度和特異性相對(duì)較低，它們的檢測(cè)結(jié) 果還不能作為疾病確診的指標(biāo)；(2)疾病的早期診斷率應(yīng)與治療的效果呈現(xiàn)正相關(guān)，而上 述任何一種疾病標(biāo)記物還難以滿足疾病早期診斷的這種要求。以癌癥為例，由于存在著腫 瘤分化類(lèi)別特異性過(guò)強(qiáng)、腫瘤整體敏感性較低、送檢標(biāo)本難以反復(fù)采取、標(biāo)本保存要求條件 高等缺陷，同時(shí)價(jià)格昂貴，因此在現(xiàn)有條件下難以廣泛推廣應(yīng)用現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物。而一些 傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)手段，如組織細(xì)胞檢測(cè)存在著其固有的缺陷，取材位置不當(dāng)、組織細(xì)胞標(biāo)本材料不 足或人為經(jīng)驗(yàn)不足等都將導(dǎo)致誤診。其它技術(shù)例如影像學(xué)雖然已被廣泛應(yīng)用于疾病的檢查 和診斷，但其在疾病程度的定性上仍存在著很大的局限性。因此目前非常有必要尋找能夠 彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)記物的上述缺陷的新型、靈敏并且應(yīng)用方便的疾病檢測(cè)標(biāo)記物。微小核糖核酸，英文名為microRNA，是一類(lèi)長(zhǎng)約19至23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 小核糖核酸分子。它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守，并與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)，如生物個(gè)體發(fā) 育、組織分化、細(xì)胞調(diào)亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著 緊密的聯(lián)系。最近的研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中的幾種微小核 糖核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)(Lawrie CH, Gal S, Dunlop HM et al. Detection of elevated levels of tumor-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B—cell lymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)；分析比較人月市癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有若干組織特異性微小核糖核酸的表達(dá)水 平相對(duì)于正常組織發(fā)生了變化(Garofalo M, Quintavalle C, Di Leva G et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene 2008)。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的 發(fā)生和發(fā)展，并且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)(Tryndyak VPiRoss SA，Belmd FA, Pogribny IP. Down-regulation of the microRNAs miR_34a，miR-127，and miR_200b in rat liver during hepatocarcinogenesis induced by a methyl-deficient diet. Mol Carcinog. 2008 Oct 21)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)及特異性變化與疾病發(fā)生 和發(fā)展之間存在著必然聯(lián)系。由于微小核糖核酸在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它 與疾病存在以下的關(guān)聯(lián)性首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种?因子以及促進(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表 達(dá)，比如本來(lái)抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的 微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通 路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結(jié)果，這是 因?yàn)楫?dāng)疾病(如癌癥)發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇 烈擴(kuò)增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。 因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類(lèi)新的疾病標(biāo)記物，它的特異性變化必然 與疾病產(chǎn)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。同時(shí)微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制疾 病過(guò)程中上調(diào)的微小核糖核酸或過(guò)表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的 發(fā)生和發(fā)展。國(guó)內(nèi)目前已有以微小核糖核酸作為疾病標(biāo)記物的相關(guān)研究，如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) CN100999765A和CN101298630A，它們均選取占惡性腫瘤發(fā)病率第4位的結(jié)腸癌作為研究對(duì) 象，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸良性息肉發(fā)展成惡性腫瘤期間，一些微小核糖核酸分子都存在著特 異性變化，并據(jù)此通過(guò)測(cè)定微小核糖核酸的特異性變化已經(jīng)建立起一種更敏感、更精確的 早期確診結(jié)腸癌的方法。然而由于組織標(biāo)本的取材不容易使這種方法在臨床上的廣泛應(yīng)用 受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
為克服此缺陷，本申請(qǐng)人將研究目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收集 到的血液。由于血液會(huì)循環(huán)至全身所有組織，并向細(xì)胞輸送營(yíng)養(yǎng)并清除廢物，因此血液能 夠反映出整個(gè)機(jī)體的生理病理狀況，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)人體健康具有指導(dǎo)意義。已知血清/血 漿中存在著多種蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白等，多種脂質(zhì)，如HDL膽固醇、三甘油脂等， 多種糖質(zhì)，色素，電解質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，多種酶，如淀粉酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、膽素脂酶、 醛縮酶等，同時(shí)還匯集了來(lái)自全身組織器官的多種信號(hào)分子，如細(xì)胞因子，激素等。目前，對(duì) 疾病的診斷僅僅局限于血清/血漿中的上述生化指標(biāo)，尚無(wú)血清/血漿微小核糖核酸的報(bào) 道。人們傳統(tǒng)觀念中認(rèn)為血清/血漿中沒(méi)有核糖核酸分子，即使有也會(huì)很快被核糖核酸酶 降解為小分子片段而檢測(cè)不到。但是，由于微小核糖核酸分子是由19至23個(gè)核苷酸單元 組成，具有結(jié)構(gòu)上的特殊性和相對(duì)穩(wěn)定性，它們極有可能存在于血清/血漿中。本申請(qǐng)發(fā)明人之一張辰宇教授的前期研究已經(jīng)證實(shí)，血清/血漿中穩(wěn)定地存在微小核糖核酸，且每一 禾中雙胃·胃?jìng)€(gè)生白勺(Chen et al :Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 2008 Oct ；18(10) 997)。為尋找結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，申請(qǐng)人基于已有的研究成果， 進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究(1)研究結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中血清/血漿微小核糖核酸的特異性變化；(2)通過(guò)用于檢測(cè)血清/血漿微小核糖核酸的生物芯片和測(cè)序技術(shù)測(cè)定結(jié)直腸癌 血清/血漿微小核糖核酸的變化；(3)將篩選到的在結(jié)直腸癌及正常生理狀態(tài)下表達(dá)差異程度大的一類(lèi)血清/血漿 微小核糖核酸分子應(yīng)用于血清/血漿微小核糖核酸檢測(cè)技術(shù)，制備應(yīng)用于結(jié)直腸癌診斷等 領(lǐng)域的生物芯片和診斷試劑盒。通過(guò)上述對(duì)血清/血漿微小核糖核酸與結(jié)直腸癌的相關(guān)性的研究，申請(qǐng)人提出了 以血清/血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸作為結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物，建立一種體外檢 測(cè)血清/血漿中穩(wěn)定存在的特定微小核糖核酸的方法，通過(guò)檢測(cè)特定微小核糖核酸的特異 性變化來(lái)進(jìn)行結(jié)直腸癌的早期診斷，疾病鑒定和病程監(jiān)控，復(fù)發(fā)及預(yù)后、并發(fā)癥發(fā)生的預(yù) 測(cè)，同時(shí)可以進(jìn)一步進(jìn)行藥效判定、用藥指南、個(gè)體化治療、中藥有效成份篩選、種群分類(lèi)等 研究。本發(fā)明的目的首先是提供一種結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物，所述標(biāo)記物包括以下在人體 血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的微小核糖核酸成熟體(Mature microRNA)中的任意一種 或一種以上(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、、4、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85或86種)，優(yōu)選任意兩種或兩種以上let-7b> let_7c、 miR—122、 miR-125a-5p> miR-125b> miR-128a> miR-128b> miR-133a> miR—134、miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-221> miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR-30d> miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-432> miR-433> miR-486-3p> miR-495> miR-543> miR-574-3p> miR-584> miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b、 let-7f、let-7g、miR-100、miR_106a、miR_106b、miR-142_3p、miR-144、miR_148a、miR-15a、 miR-16> miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR-194> miR_19b、miR-20a> miR_20b、 miR-29b、miR-340、miR-362-5p、miR-374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。上述血清/血漿可以來(lái)源于人體活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)上述結(jié)直腸癌標(biāo)記物的方法，通過(guò)該方法可以進(jìn) 一步評(píng)價(jià)人體乳腺癌的狀態(tài)。上述檢測(cè)方法選自反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(Real-time PCR)、Northern印跡雜交方法(Northern blotting)、核糖核酸酶保護(hù)分析方法(RNase protection assay)、Solexa 測(cè)序技術(shù)(Solexa sequencing technology)或生物芯片方法。上述RT-PCR方法為優(yōu)選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者收集受試者的血清/血漿樣本，以血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果；上述Real-time PCR方法為另一優(yōu)選方法，包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試者的血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)制備cDNA 樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物；3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)檢測(cè)并比較血清/血漿樣本相對(duì)于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變 化。上述Northern blotting方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)；2)進(jìn)行變性PAGE電泳和膜轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)；3)制備同位素標(biāo)記微小核糖核酸探針；4)進(jìn)行膜雜交反應(yīng)；5)同位素信號(hào)檢測(cè)，如磷屏掃描檢測(cè)結(jié)果。上述RNase protection assay方法包括如下步驟1)進(jìn)行反義RNA探針的合成，同位素標(biāo)記與純化；2)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)；3)將提取后的RNA溶解在雜交緩沖液中并加入反義RNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；4)加入RNase消化液進(jìn)行反應(yīng)；5)進(jìn)行電泳與放射自顯影；6)分析結(jié)果。上述 Solexa sequencing technology 方法包括如下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)；2)進(jìn)行PAGE電泳回收17_27nt RNA分子；34)將adaptor prime酶聯(lián)在小RNA分子的3’與5’端；4)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)后進(jìn)行測(cè)序；5)數(shù)據(jù)分析與處理。上述生物芯片方法包括如下步驟1)將人體血液/血漿中全部一千多種微小核糖核酸成熟體庫(kù)點(diǎn)陣并制備生物芯片；2)提取受試者的血清/血漿總RNA (例如通過(guò)Trizol試劑提取)；3)通過(guò)柱分離來(lái)分離微小核糖核酸；4)利用T4 RNA連接酶進(jìn)行微小核糖核酸熒光標(biāo)記；5)與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)；6)數(shù)據(jù)檢測(cè)與分析。上述方法中所使用的血清/血漿來(lái)源于受試者活體、組織、器官和/或尸體。本發(fā)明通過(guò)上述方法可以分析在結(jié)直腸癌發(fā)生中血清/血漿微小核糖核酸的變 化趨勢(shì)及變化量，以及它們與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。因此，以上檢測(cè)人體血清/血漿中穩(wěn)定存 在且可檢測(cè)的86種微小核糖核酸的方法可以進(jìn)一步評(píng)價(jià)人體結(jié)直腸癌的狀態(tài)，進(jìn)而可以 為人們提供一種預(yù)測(cè)、診斷、鑒別和/或評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌的方法，該方法主要通過(guò)檢測(cè)受試者 血清/血漿中86種特定微小核糖核酸即所謂的結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn).本發(fā)明的又一目的是提供上述結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物在制備、預(yù)測(cè)、診斷、鑒別和/ 或評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌的試劑或工具中的應(yīng)用，包括制備相應(yīng)的試劑盒和生物芯片。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物的微小核糖核酸探針組合，也 即預(yù)測(cè)、診斷和/或評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌的微小核糖核酸探針組合，所述探針組合包括以下核苷 酸序列所示的探針中的任意一種或一種以上(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、、4、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85 或 86 種)，優(yōu)選任意兩種 或兩種以上let-7b> let_7c、 miR—122、 miR-125a-5p> miR-125b> miR-128a> miR-128b> miR-133a> miR—134、miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-221> miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR-30d> miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-432> miR-433> miR-486-3p> miR-495> miR-543> miR-574-3p> miR-584> miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let-7f、let-7g、miR-100、miR-106a、miR-106b、miR-142-3p、miR-144、miR-148a、miR-15a、 miR-16> miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR-194> miR_19b、miR-20a> miR_20b、 miR-29b、miR-340、miR-362_5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
權(quán)利要求
一種結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物，其特征在于所述標(biāo)記物包括以下在人體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上let 7b、let 7c、miR 122、miR 125a 5p、miR 125b、miR 128a、miR 128b、miR 133a、miR 134、miR 139 3p、miR 139 5p、miR 145、miR 146a、miR 150、miR 152、miR 193a 5p、miR 197、miR 199a 3p、miR 199a 5p、miR 199b 3p、miR 22、miR 221、miR 222、miR 223、miR 23a、miR 23b、miR 24、miR 25、miR 27a、miR 27b、miR 28 3p、miR 29a、miR 30d、miR 320、miR 323 3p、miR 330 3p、miR 339 3p、miR 339 5p、miR 342 3p、miR 342 5p、miR 361 5p、miR 382、miR 423 3p、miR 423 5p、miR 361 5p、miR 382、miR 423 3p、miR 423 5p、miR 432、miR 433、miR 486 3p、miR 495、miR 543、miR 574 3p、miR 584、miR 598、miR 744、miR 766、miR 92a、miR 92b、miR 99a、miR 99b、let 7f、let 7g、miR 100、miR 106a、miR 106b、miR 142 3p、miR 144、miR 148a、miR 15a、miR 16、miR 17、miR 182、miR 183、miR 18a、miR 194、miR 19b、miR 20a、miR 20b、miR 29b、miR 340、miR 362 5p、miR 374a、miR 424、miR 451、miR 454、miR 7和miR 96。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物，其特征在于所述標(biāo)記物包括以下在人 體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的微小核糖核酸成熟體中的任意兩種或兩種以上let-7b、let-7c、miR-122、miR-125a_5p、miR_125b、miR_128a、miR_128b、miR_133a、 miR-134> miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-22U miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR_30d、 miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p、miR-432、miR-433、miR-486_3p、miR-495、miR-543、miR-574_3p、miR-584、 miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let—7f、 let—7g、 miR-100>miR-106a>miR-106b>miR-142-3p>miR-144>miR-148a>miR-15a>miR-16>miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR—194、miR—19b、miR-20a> miR—20b、miR-29b> miR—340、 miR-362-5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中所述的結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物，其特征在于所述血清/血漿來(lái) 源于人體活體、組織、器官和/或尸體。
4.權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)所述的結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)方法，其特征在于選自 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、Northern印跡雜交方法、 核糖核酸酶保護(hù)分析方法、Solexa測(cè)序技術(shù)或生物芯片方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法包括 以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；4)EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法包括以下步驟1)提取受試者的血清/血漿總RNA，通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到CDNA樣品；或者以受試 者的血清/血漿樣本作為緩沖液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)制備cDNA樣品；2)用微小核糖核酸設(shè)計(jì)引物；3)加入熒光探針進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)檢測(cè)并比較血清/血漿樣本相對(duì)于正常血清/血漿中微小核糖核酸的量的變化。
7.一種預(yù)測(cè)、診斷和/或評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌的方法，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)以下人 體血清/血漿中穩(wěn)定存在且可檢測(cè)的微小核糖核酸成熟體中的任意一種或一種以上let-7b、let-7c、miR-122、miR-125a_5p、miR_125b、miR_128a、miR_128b、miR_133a、 miR-134> miR-139-3p> miR-139-5p> miR-145> miR-146a> miR—150、miR-152> miR-193a-5p> miR-197> miR-199a-3p> miR-199a-5p> miR-199b-3p> miR-22> miR-22U miR-222> miR-223> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-27a> miR-27b> miR-28-3p> miR-29a> miR_30d、 miR-320> miR-323-3p> miR-330-3p> miR-339-3p> miR-339-5p> miR-342-3p> miR-342-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p> miR-361-5p> miR-382> miR-423-3p> miR-423-5p、miR-432、miR-433、miR-486_3p、miR-495、miR-543、miR-574_3p、miR-584、 miR-598> miR-744> miR-766> miR-92a> miR-92b> miR-99a> miR-99b> let—7f、 let—7g、 miR-100>miR-106a>miR-106b>miR-142-3p>miR-144>miR-148a>miR-15a>miR-16>miR-17> miR-182> miR-183> miR-18a> miR—194、miR—19b、miR-20a> miR—20b、miR-29b> miR—340、 miR-362-5p、miR_374a、miR-424、miR-451、miR-454、miR-7 和 miR-96。
8.權(quán)利要求1或2所述的結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物在制備預(yù)測(cè)、診斷、鑒別和/或評(píng)價(jià)結(jié)直 腸癌的試劑或工具中的用途。
9.一種用于檢測(cè)結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物的微小核糖核酸探針組合，其特征在于所述組合 包括以下探針序列中的任意一種或一種以上
10.一種用于檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)記物的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含檢測(cè)權(quán)利要 求1或2所述檢測(cè)標(biāo)記物的工具。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述工具包括權(quán)利要求9所述的探針組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述工具還包括DNA聚合酶和/或脫 氧核糖核苷酸混合物。
13.一種用于檢測(cè)結(jié)直腸癌檢測(cè)標(biāo)記物的生物芯片，其特征在于所述生物芯片包含檢 測(cè)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)標(biāo)記物的元件。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的元件包括權(quán)利要求 9所述的探針組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用人體血清/血漿中穩(wěn)定存在的86種特定微小核糖核酸作為結(jié)直腸癌的檢測(cè)標(biāo)記物以及檢測(cè)該標(biāo)記物的方法、相關(guān)試劑盒及生物芯片。能夠用于結(jié)直腸癌的診斷與鑒別診斷、疾病并發(fā)癥的發(fā)生和復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)、療效評(píng)價(jià)，以及藥物活性成分的篩選、藥效評(píng)價(jià)等方面，具有檢出譜系廣、靈敏度高、檢測(cè)成本低、取材方便、樣本易存放等優(yōu)點(diǎn)，該方法可廣泛用于結(jié)直腸癌普查等相關(guān)工作，改進(jìn)單一的標(biāo)記物所難以克服的個(gè)體差異所帶來(lái)的低特異性和低靈敏度，顯著提高結(jié)直腸癌的臨床檢出率，成為早期診斷結(jié)直腸癌的有效手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101988060SQ201010238448
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者張辰宇, 曾科, 李海進(jìn) 申請(qǐng)人:江蘇命碼生物科技有限公司