本發(fā)明屬于微生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于快速檢測多種臨床常見真菌并鑒定菌種的試劑盒的引物，分子信標(biāo)及試劑盒。
背景技術(shù)：
：真菌病是由真菌為病原體所引起的一種疾病，它不僅包括侵犯表皮角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板的淺部真菌感染，也包括侵犯真皮、皮下組織和內(nèi)臟器官的深部真菌病。近幾年來，隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和各種醫(yī)學(xué)導(dǎo)管的大量使用，器官移植手術(shù)的開展及長期的慢性病治療如腫瘤治療，使得免疫低下人群和醫(yī)院內(nèi)部侵襲性真菌感染的發(fā)病率有明顯的上升趨勢，主要為假絲酵母菌屬、隱球酵母菌屬和曲霉菌屬所致的感染，一些少見真菌及條件致病性真菌如毛霉菌屬和青霉菌屬引起的感染逐漸增多。早期的抗真菌治療能極大改善真菌病患者的預(yù)后，目前臨床抗真菌治療常被推遲到血液培養(yǎng)的真菌菌群分離后(>12小時(shí))，這是這類感染死亡率較高的原因之一，因此早診斷早治療是降低深部真菌感染死亡率的有效方式。實(shí)驗(yàn)室檢查是臨床診斷真菌感染的重要依據(jù)，常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括直接鏡檢法和培養(yǎng)法，血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。直接鏡檢法和培養(yǎng)檢查法是形態(tài)學(xué)檢查的基本方法。直接鏡檢是真菌學(xué)檢查最經(jīng)典的方法，具有快速、簡便的特點(diǎn)，但陽性率較低，并且取材直接涂片法的漏診率高達(dá)45％，因此陰性結(jié)果不能排除真菌感染，與培養(yǎng)檢查結(jié)合才能確診。培養(yǎng)檢查法可進(jìn)一步提高病原體檢出的陽性率，驗(yàn)證直接鏡檢的結(jié)果同時(shí)確定致病菌的種類，但是大部分真菌生產(chǎn)緩慢，因此培養(yǎng)法耗時(shí)長，確診慢，容易延誤病情。血清學(xué)診斷方法在國內(nèi)外開展了數(shù)十年，該方法可快速得出結(jié)果，近年來檢測真菌抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)方法已廣泛用于臨床。目前主要檢測烯醇化酶、葡聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖和隱球菌莢膜多糖抗原等。但是存在的問題是引起假陽性的因素較多，如內(nèi)毒素污染，溶血和一些抗腫瘤藥物的使用都可使檢測呈假陽性。近年來，分子生物學(xué)方法已成功應(yīng)用于某些深部真菌感染的檢測，如pcr技術(shù)，由于該方法可在極短的時(shí)間內(nèi)檢測出極微量的真菌，故使真菌感染的早期診斷成為可能，為一些難以靠形態(tài)學(xué)檢查來確診的深部真菌感染開辟了新的診斷途徑。然而用傳統(tǒng)pcr技術(shù)診斷真菌感染存在局限性，擴(kuò)增的dna產(chǎn)物極易造成實(shí)驗(yàn)室污染，極微量的污染可造成假陽性以及難以區(qū)分定植菌和感染菌使其特異性不高。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)(simultaneousamplificationandtesting，簡稱sat)是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。其原理為在41℃恒溫條件下，首先由m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生模板核酸(rna)的一個(gè)雙鏈dna拷貝，然后利用t7rna聚合酶從該dna拷貝上產(chǎn)生多個(gè)(100～1000個(gè))反義rna拷貝；每一個(gè)產(chǎn)生的rna拷貝又被逆轉(zhuǎn)錄酶作為模板核酸進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)探針和這些擴(kuò)增出來的rna拷貝特異性結(jié)合，產(chǎn)生熒光。熒光檢測儀器對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)捕獲，實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。分子信標(biāo)(molecularbeacon)是一種在自身5’和3’末端形成一個(gè)6～8個(gè)堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，分子信標(biāo)的一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)分子信標(biāo)呈現(xiàn)莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，5’和3’末端緊緊靠近，發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光基團(tuán)熒光被淬滅；當(dāng)分子信標(biāo)的環(huán)狀序列與靶標(biāo)核苷酸鏈互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，5’和3’末端分離，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)核苷酸鏈的量呈正比，因此可以用于靶標(biāo)核苷酸鏈的實(shí)時(shí)定量分析。高分辨率熔解曲線(high-resolutionmelting，hrm)是一種基于寡核苷酸鏈熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析技術(shù)，具有極高的靈敏度，可以檢測出單個(gè)堿基的差異，并且通量高、速度快、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測位點(diǎn)的局限。hrm技術(shù)可以應(yīng)用于基因突變檢測、單核苷酸多態(tài)性分析、基因分型、序列匹配、甲基化后修飾等方面的研究。hrm技術(shù)的基本原理為雙鏈寡核苷酸鏈的熱穩(wěn)定性受其堿基組成和核苷酸鏈長度的影響，堿基序列的不同會(huì)導(dǎo)致在升溫變性過程中雙鏈核苷酸的解鏈行為的不同。運(yùn)用分子信標(biāo)探針與恒溫?cái)U(kuò)增所得的反義rna拷貝互補(bǔ)結(jié)合，可以實(shí)時(shí)定量rna拷貝數(shù)，擴(kuò)增完成后通過hrm技術(shù)可以獲得不同rna拷貝序列的不同形態(tài)的熔解曲線，用以對(duì)原始模板核酸進(jìn)行基因分型分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡便的新型檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床常見真菌的快速檢測與鑒定，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測方法的不足。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：用于快速檢測多種真菌并鑒定菌種的引物和探針，它包括如下序列：(1)擴(kuò)增18sv2區(qū)的引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno.：1～2所示；(2)擴(kuò)增18sv9區(qū)的引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno.：3～4所示；(3)檢測18sv2區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)，其核苷酸序列如seqidno.：5所示；(4)檢測18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)，其核苷酸序列如seqidno.：6所示；(5)檢測18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)，其核苷酸序列如seqidno.：7所示；上述2對(duì)引物對(duì)和3條分子信標(biāo)在一次檢測中共同使用。上述用于快速檢測多種真菌并鑒定菌種的引物和探針在制備真菌檢測試劑盒中的應(yīng)用。用于快速檢測真菌檢測與鑒定的試劑盒，該試劑盒包括如下試劑：(1)擴(kuò)增反應(yīng)試劑：ph＝8.001mtris-hcl緩沖液、2mkcl、1.2mmgcl2、dntps、ntps、seqidno.：1～7所示的引物和分子信標(biāo)；(2)5×q-solution：該反應(yīng)液中含有2.7m甜菜堿、55ug/mlbsa、31.5mmdtt和6.7％dmso；(3)酶反應(yīng)液：該反應(yīng)液中含有5.5ug/mlbsa、逆轉(zhuǎn)錄酶和t7rna聚合酶；(4)陽性對(duì)照：分別含有8種念珠菌(白色念珠菌，熱帶念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌)，1種隱球菌(新型隱球菌)，1種曲霉菌(煙曲霉)，1種毛霉菌(總狀毛霉)和1種青霉菌(繩狀青霉)rna的水溶液；(5)陰性對(duì)照：去rna酶的水。上述用于快速檢測多種臨床常見真菌并鑒定菌種的試劑盒，其特征在于，陽性對(duì)照中，每一種真菌rna濃度為30ng/μl。上述用于快速檢測真菌檢測與鑒定的試劑盒在檢測臨床真菌中的應(yīng)用。因?yàn)檎婢纳L繁殖速度相對(duì)其他真核生物很快，其基因組也經(jīng)常會(huì)發(fā)生變異而具有異質(zhì)性，包含本發(fā)明所述的白色念珠菌，熱帶念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌，新型隱球菌，煙曲霉，黃曲霉，總狀毛霉，卷枝毛霉臨床致病菌和橘青霉，繩狀青霉條件致病菌的不同臨床隔離菌株所含的基因dna序列會(huì)有所差異，本發(fā)明通過從ncbi的基因序列庫中比對(duì)多種菌及臨床隔離株的基因序列，在保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物和探針能擴(kuò)增和檢測并鑒定臨床常見致病真菌的18sv2及v9區(qū)。有益效果：(1)通過在ncbi的基因序列庫中比對(duì)多種菌及臨床隔離株18s基因序列，在保守位點(diǎn)處設(shè)計(jì)的特異性引物，能夠?qū)εR床常見致病真菌18sv2區(qū)和v9區(qū)進(jìn)行特異性擴(kuò)增。(2)使用一種穩(wěn)定性強(qiáng)、雙鏈結(jié)合特異性高、對(duì)核酸恒溫?cái)U(kuò)增抑制小的特異性檢測并鑒定真菌的分子信標(biāo)探針對(duì)臨床常見的八種念珠菌，一種隱球菌，曲霉菌屬，毛霉菌屬和青霉菌屬進(jìn)行檢測和鑒定。(3)本發(fā)明所述的臨床常見真菌快速檢測與鑒定的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、成本低廉及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于輔助臨床快速診斷致病性真菌的感染情況，為臨床治療提供參考依據(jù)。附圖說明圖1為12種真菌陽性對(duì)照品fam通道檢測結(jié)果圖。圖2為12種真菌陽性對(duì)照品hex通道檢測結(jié)果圖。圖3為12種真菌陽性對(duì)照品cy5通道檢測結(jié)果圖。圖4為白色念珠菌陽性對(duì)照品檢測結(jié)果圖，a為fam通道檢測圖，fam探針的tm值為61.0；b為hex通道檢測圖，hex探針的tm值為68.8；c為cy5通道檢測圖，cy5探針的tm值為73.5。圖5為陰性對(duì)照品檢測結(jié)果圖，a為fam通道檢測圖，b為hex通道檢測圖，c為cy5通道檢測圖，三個(gè)信號(hào)通道均無tm峰。圖6為臨床樣本檢測結(jié)果圖，a為fam通道檢測圖，b為hex通道檢測圖，c為cy5通道檢測圖，fam探針的tm值為59.8，hex探針的tm值為67.8，cy5探針的tm值為72.5。圖7為臨床樣本檢測結(jié)果圖，a為fam通道檢測圖，b為hex通道檢測圖，c為cy5通道檢測圖，fam通道不出峰，hex探針的tm值為65.5，cy5探針的tm值為67.8。圖中英文字母對(duì)應(yīng)的中文名稱為：fluorescence熒光值；temperature溫度，meltingpeaks熔解峰。具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1：擴(kuò)增和檢測鑒定臨床常見真菌的核酸序列，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成：擴(kuò)增真菌18sv2區(qū)的引物對(duì)：f1(seqidno.1)：5′-gtggtaattctagagctaataca-3′，r1(seqidno.2)：5′-aattctaatacgactcactataggggcagaaatttgaatgaasca-3′；擴(kuò)增真菌18sv9區(qū)的引物對(duì)：f2(seqidno.3)：5′-ttgctcttcaacgaggaat-3′，r2(seqidno.4)：5′-aattctaatacgactcactatagggacggaaaccttgttacgact-3′；檢測真菌18sv2區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)：seqidno.5：5′fam-cggcgatcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgccg-dab3′；檢測真菌18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)：seqidno.6：5′hex-cgcgcgttgtgttgattacgtccctgccctttgtacgcgcg-dab3′；檢測真菌18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)：seqidno.7：5′cy5-cggcgctactaccgattgaatggcttagtgaggcctccggagcgccg-dab3′。實(shí)施例2：試劑盒的制備方法。(1)擴(kuò)增反應(yīng)液：該反應(yīng)液中含有ph＝8.001mtris-hcl緩沖液、k+、mg2+、dntps(購于thermoscientific)、ntps(購于thermoscientific)、引物和分子信標(biāo)(核苷酸序列交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，用depc水溶解)，-20℃保存；(2)5×q-solution：該反應(yīng)液中含有甜菜堿、bsa、dtt和dmso，-20℃保存；(3)酶反應(yīng)液：該反應(yīng)液中含有bsa、逆轉(zhuǎn)錄酶和t7rna聚合酶，-20℃保存；(4)陽性對(duì)照：分別抽提8種念珠菌，1種隱球菌，1種曲霉菌，1種毛霉菌和1種青霉菌的rna，每一種真菌rna的濃度最終稀釋為30ng/μl，-20℃保存；(5)陰性對(duì)照：去rna酶的蒸餾水，-20℃保存。實(shí)施例3：檢測方法。儀器：核酸純化儀，roche480熒光定量pcr檢測儀，beckman22r臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)，eppendorf5810r臺(tái)式冷凍離心機(jī)，太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司wh-866型渦旋振蕩器。(1)真菌rna模板的制備：參考公開的文獻(xiàn)，不同種類的臨床標(biāo)本，采用相應(yīng)的前處理方法，痰液等粘液首先利用裂解液水化，無菌體液直接高速離心收集菌體，去除上清，加100ul生理鹽水重懸。按照真菌核酸抽提試劑盒說明書制備真菌rna，作為核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)模板備用。(2)以步驟(1)得到的真菌rna為模板，利用2對(duì)特異性引物和3條特異性分子信標(biāo)進(jìn)行臨床致病真菌的擴(kuò)增檢測與鑒定，具體包括如下步驟；(2a)反應(yīng)液配制：從-20℃冰箱取出實(shí)施例2中的各組分，室溫融化。加樣前10分鐘之內(nèi)，按檢測樣本數(shù)配置反應(yīng)液xμl：x＝(4μl5×q-solution+6μl擴(kuò)增反應(yīng)液)×(n份樣本+1份陽性對(duì)照+1份陰性對(duì)照+1份空白對(duì)照)。振蕩混勻后，2000rpm離心5s，按每孔10μl分裝到8連孔反應(yīng)管中，轉(zhuǎn)至樣本制備區(qū)備用。(2b)加樣：向分裝好試劑的反應(yīng)孔中，分別加入待測真菌樣本rna模板5μl(若樣本裂解產(chǎn)物保存在-20℃，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心2min)，陽性對(duì)照孔加入5μl陽性對(duì)照，陰性對(duì)照孔加入5μl陰性對(duì)照，空白對(duì)照孔加入5μldepc水。蓋好管蓋，微震混勻，2000rpm離心5s，然后放入roche480熒光定量pcr檢測儀中預(yù)變性處理65℃3mins，41℃3mins后取出。(2c)加酶反應(yīng)液：向每個(gè)反應(yīng)孔中加入酶反應(yīng)液5μl，2000rpm離心5s。(2d)擴(kuò)增檢測：將反應(yīng)管放入roche480熒光定量pcr儀中進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件如下：41℃1min，60個(gè)循環(huán)；65℃2mins，40℃2mins，連續(xù)升溫至80℃，熒光采集點(diǎn)在41℃和升溫過程，檢測模式設(shè)置為探針法，反應(yīng)體積設(shè)置為20。保存文件，運(yùn)行。(2d)結(jié)果分析，具體包括如下步驟：roche480熒光pcr檢測儀點(diǎn)擊分析，選取tmcalling分析模式，進(jìn)入分析窗口，依次選取fam,hex,cy5通道，點(diǎn)擊計(jì)算，計(jì)算得到每個(gè)測試的三個(gè)tm值。(2e)陰陽性對(duì)照品結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)及處理，具體按照如下步驟判定：陰性對(duì)照品的熔解曲線無tm值峰；陽性對(duì)照品的熔解曲線有明顯的tm值峰。(3)步驟(2)所得的樣本檢測結(jié)果判斷，具體按照如下標(biāo)準(zhǔn)：(3a)如果三個(gè)信號(hào)通道都無tm峰，則判樣本結(jié)果為陰性。(3b)如果三個(gè)信號(hào)通道有tm峰出現(xiàn)，則按以下方法判斷：表1常見真菌tm值參考范圍對(duì)照表菌種/菌屬famhexcy5白色念珠菌58.88-61.3366.96-69.8971.72-74.55熱帶念珠菌62.00-64.1067.06-69.2567.07-69.17近平滑念珠菌59.21-60.8867.48-69.4867.37-69.25光滑念珠菌57.06-57.7167.22-68.2163.56-64.56克柔念珠菌47.14-49.0166.77-69.6065.24-67.89季也蒙念珠菌56.68-58.4366.85-68.4571.44-72.52葡萄牙年念珠菌46.80-48.7266.12-68.1771.22-73.04乳酒念珠菌60.20-62.2866.66-68.4363.15-64.78新型隱球菌-66.27-69.2863.64-65.89曲霉菌屬-62.83-65.3163.36-65.24毛霉菌屬-67.78-70.6556.43-57.91青霉菌屬-63.00-65.3065.92-67.12注：三個(gè)通道出現(xiàn)tm峰，但峰值不在上表范圍內(nèi)的為其他臨床少見真菌。實(shí)施例4：臨床患者細(xì)菌樣品檢測。將本發(fā)明所述的試劑盒用于40例真菌感染者的樣本的檢測，檢測方法按照實(shí)施例3中的步驟實(shí)施，檢測結(jié)果與微生物培養(yǎng)法對(duì)40例樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，檢測結(jié)果表2所示：表2樣品檢測結(jié)果對(duì)照表利用本發(fā)明提供的臨床常見真菌快速檢測與鑒定的試劑盒分析40例真菌感染患者的樣本得到的檢測結(jié)果與微生物培養(yǎng)法得到的檢測結(jié)果一致。圖4～7為利用本發(fā)明提供的試劑盒檢測上述40例樣品時(shí)的部分結(jié)果圖。其中，圖4為陽性對(duì)照品檢測結(jié)果圖；圖5為陰性對(duì)照品檢測結(jié)果圖；圖6為檢測結(jié)果圖，患者樣本號(hào)“1”，fam探針的tm值為59.8，hex探針的tm值為67.8，cy5探針的tm值為72.5，結(jié)果為白色念珠菌；圖7為檢測結(jié)果圖，患者樣本號(hào)“13”，fam通道不出峰，hex通道tm值為65.5，cy5通道tm值為67.8，結(jié)果為青霉菌。本發(fā)明能檢測的真菌菌株主要包括白色念珠菌，熱帶念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌八種常見念珠菌，新型隱球菌，曲霉，毛霉和青霉。檢測準(zhǔn)確率為100％。本試劑盒具有操作簡便快捷，靈敏、特異，成本低廉，能對(duì)常見臨床真菌進(jìn)行快速檢測并鑒定菌種，用于臨床能有利于醫(yī)師進(jìn)行快速診斷，改善治療方案，減少抗生素藥物的濫用。該技術(shù)方案技術(shù)門檻低，從樣本到出檢測結(jié)果時(shí)間為2小時(shí)，易于推廣，具有較好的應(yīng)用前景。sequencelisting<110>杭州迪安生物技術(shù)有限公司、杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>用于快速檢測多種真菌并鑒定菌種的引物和探針及其應(yīng)用<130>sg20170205<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>擴(kuò)增真菌18sv2區(qū)上游引物f1<400>1gtggtaattctagagctaataca23<210>2<211>45<212>dna<213>artificialsequence<220><223>擴(kuò)增真菌18sv2區(qū)的下游引物r1<400>2aattctaatacgactcactataggggcagaaatttgaatgaasca45<210>3<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>擴(kuò)增真菌18sv9區(qū)上游引物f2<400>3ttgctcttcaacgaggaat19<210>4<211>45<212>dna<213>artificialsequence<220><223>擴(kuò)增真菌18sv9區(qū)的下游引物r2<400>4aattctaatacgactcactatagggacggaaaccttgttacgact45<210>5<211>47<212>dna<213>artificialsequence<220><223>檢測真菌18sv2區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)<400>5cggcgatcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgccg47<210>6<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>檢測真菌18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)<400>6cgcgcgttgtgttgattacgtccctgccctttgtacgcgcg41<210>7<211>47<212>dna<213>artificialsequence<220><223>檢測真菌18sv9區(qū)擴(kuò)增子的分子信標(biāo)<400>7cggcgctactaccgattgaatggcttagtgaggcctccggagcgccg47當(dāng)前第1頁12