專利名稱：：一種白腐真菌及其選育方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613，同時(shí)還涉及該菌株的誘變選育方法，特別涉及利用該菌株生產(chǎn)漆酶的方法。
背景技術(shù)：
：漆酶是一種氧化還原酶，其作用主要是催化氧化還原反應(yīng)，因此漆酶能把分子氧直接還原為水，在沒有過氧化氫和其它次級代謝產(chǎn)物存在下，可催化大量的酚類和芳香胺類化合物的氧化。一些漆酶能高效地氧化抗壞血酸，另外一些真菌漆酶還能催化木質(zhì)素和甲氧基酚酸的脫甲基反應(yīng)。漆酶作用的底物相當(dāng)廣泛，包括多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其他容易氧化的化合物，還有許多與對二酚結(jié)構(gòu)類似的化合物，如氨基苯酚，鄰、對苯二酚，多酚，多胺，木質(zhì)素和芳基二胺等。由于具有相當(dāng)廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，漆酶在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、環(huán)境監(jiān)測等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。漆酶的抑制劑大多是銅離子螯合劑,有鹵化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等；離子強(qiáng)度的不同會影響酶的活力，不同來源的漆酶最適pH范圍也會不同。漆酶的應(yīng)用研究現(xiàn)主要集中于生物造紙、環(huán)境污染治理、食品工業(yè)應(yīng)用、有機(jī)合成、生物及免疫檢測等。對漆酶的研究早在上世紀(jì)60年代就己開始，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型、不同功能的漆酶。漆酶制漿造紙工業(yè)、食品工業(yè)、能源工業(yè)中都顯示出廣闊的應(yīng)用前景。漆酶是以農(nóng)副產(chǎn)品為原料，經(jīng)微生物純種發(fā)酵提取而制得的一種新型酶制劑。漆酶也是繼纖維素,酶，木聚糖酶等新品種酶制劑開發(fā)之后的又一重要品種，是國家大力提倡i展的新型酶制劑產(chǎn)品之一。隨著國民經(jīng)濟(jì)的持續(xù)健康發(fā)展，人民的生活水平的逐步提高對漆酶的需求越來越大，這是社會發(fā)展的需要，也是開展該項(xiàng)目研究的重要意義之一。第二，從目前國內(nèi)酶制劑行業(yè)發(fā)展情況來看，漆酶研究雖起步較早，但發(fā)展緩慢。因此適時(shí)開發(fā)漆酶即可以提高競爭，有可以部分取代進(jìn)口產(chǎn)品，滿足國內(nèi)市場需求。第三，該項(xiàng)目的研究開發(fā)對于調(diào)整工業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)具有重要作用。第四，發(fā)展漆酶的開發(fā)研制，不但可以滿足國內(nèi)市場的需求，而且可以出口國外，為國家創(chuàng)造大量的外匯，同時(shí)可以與纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、糖化酶、果膠酶等配制成符合酶制劑，以滿足不同行業(yè)的要求。目前如何獲得大批量、低成本、高品質(zhì)的漆酶已經(jīng)成為制約和影響我國漆酶產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵因素。而解決這個問題需要從兩方面著手菌種的選育及發(fā)酵工藝的優(yōu)化。目前，國內(nèi)漆酶的研究大多還處在實(shí)驗(yàn)室階段研發(fā)階段，沒有進(jìn)入工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，其根本的原因在于一是菌種的產(chǎn)酶水平較低，經(jīng)濟(jì)效益差，無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；二是菌種規(guī)模生產(chǎn)的工藝不成熟。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS_L613。同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的誘變選育方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，以大大提高漆酶的產(chǎn)率。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613,其由以下方法誘變選育而制得，以白腐真菌為出發(fā)菌株，采用以UV、6°C0、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。同時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的誘變選育方法，以白腐真菌為出發(fā)菌株,采用以UV、，0、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。具體方法包括以下步驟(1)出發(fā)菌種，以白腐真菌YS菌株為出發(fā)菌種，4-C保藏于CPDA斜面；(2)培養(yǎng)基①斜面培養(yǎng)基(CPDA)為每20Q/。土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgS047H201—2g、KH2P042—4g、VB11—3mg、瓊脂粉13—16g;②搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200,1—lmg、ZnS047H200.1—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04'H2090—llOmg、KH2P040.1—lg、CaCl28—12mg、VB148—52mg、KraftLignin(堿溶木素)0.1—lg;③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1—3%、MgS047H200.1—1%、KH2P040.1—0.5%，VB12X1(T4%,土豆汁20%，其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208_12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS04'7H2O0.5—lmg、CuS04'51120l—3mg、NaHP04'I^O90—110mg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(堿溶木素)0.5—lg，pH8.5;(3)種瓶制備:取保藏的真菌斜面進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取適量菌絲塊于250mL的三角瓶中(內(nèi)裝50mL液體培養(yǎng)基)，于30。C，150r/min，振蕩培養(yǎng)3d;發(fā)酵培養(yǎng)將種瓶培養(yǎng)物勻漿后接入發(fā)酵瓶，于30'C，150r/min，培養(yǎng)5天；(4)菌懸液的制備將培養(yǎng)4—5d斜面菌種，有無菌的生理鹽水洗下菌絲體，經(jīng)玻璃珠打散，制成含菌體106—108的懸液；①紫外線誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于直徑為9cm的平皿中，磁力攪拌，于20W紫外線燈15—20cm處，照射l一10min;②亞硝基胍(NTG)誘變:用pH6.0、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成的菌懸液于同樣的磷酸鹽緩沖液的NTG液等量混合，分別以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG濃度，30。C溫度，誘變20min，稀釋法終止反應(yīng)；③幼CoY-射線輻射誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于無菌試管中，分別以8萬、10萬、倫琴進(jìn)行60CoY-射線輻射；@離子束注入誘變處理取純種斜面加入10mL無菌水洗脫菌絲體，并稀釋成一定濃度的菌絲體懸液；取O.lmL菌懸液于無菌空平皿中涂均勻，用無菌風(fēng)吹干，然后放入離子注入機(jī)的靶室進(jìn)行離子注入，注入完畢后，用無菌水洗脫，稀釋涂平皿，等單單菌落生成后，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上；⑤微波誘變吸取制得菌懸浮液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的菌液為10ml，調(diào)整微波爐(格蘭仕)功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，輻照處理20s、40s、60s、80s、100s，其中每輻照10s，要冷卻10s，然后適當(dāng)稀釋涂分離平板；.(5)突變株分離上述各誘變處理的菌懸液，取O.lml涂布與分離培養(yǎng)基上30'C，培養(yǎng)4一5天(紫外線誘變平板避光培養(yǎng))，挑取單菌落，培養(yǎng)3—4天(6)篩選，對誘變?nèi)牒蟮木赀M(jìn)行篩選時(shí)，突變株酶活力高于對照菌株5%的突變株為正突變，而低于5%的菌株稱為負(fù)突變，在±5%之間作為未突變菌株。所述步驟(6)的篩選包括初篩和復(fù)篩，其中初篩是各誘變處理后，從30'C培養(yǎng)12小時(shí)以上生長的菌落，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)有針對性地大量挑取可能與產(chǎn)酶能力有關(guān)的形態(tài)變異性突變菌株，逐步捉高產(chǎn)酶菌株的定向篩選范圍，并傳接斜面2-3代確保菌種性能穩(wěn)定；然后，直接接入發(fā)酵瓶，進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌株接到一個發(fā)酵瓶。挑取正突變的菌株，選3-10株進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩是將初篩得到的高產(chǎn)酶菌株經(jīng)斜面活化后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)測定酶活力。再者，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，包括以下步驟將培養(yǎng)成熟的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌懸液，接入裝有種子發(fā)酵培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐培養(yǎng),溫度29—31°C，罐壓O.06-0.08mpa(表)，通風(fēng)量30—90m7hr，培養(yǎng)約30hr接入35ii^大發(fā)酵罐(裝料系數(shù)70%)，溫度控制在29—3rC，罐壓0.06—0.08即a(表)，通風(fēng)量400—1000m7hr,pH值8.3—8.8;發(fā)酵成熱醪液打入回收罐后，加入O.2~0.5%抑菌劑，然后直接進(jìn)行過濾，濾液經(jīng)二濾后進(jìn)入超濾膜過濾，經(jīng)超濾濃縮后可直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和包裝入庫，即制得液體酶制品。所述的液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1—3%、MgS04*7H200.1—1%、KH2P040.1_0.5%,VB12X10-4°/。，土豆汁20%,其余為水。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每L中含有玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H20O,l—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS047H200.5—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04'112090—llOmg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(堿溶木素)0.5—lg，pH8.5。所述的抑菌劑優(yōu)選為苯甲酸鈉。所述的二濾工藝采用的為二濾板框過濾機(jī)。所述的過濾后的濾渣經(jīng)干燥后可以用做填充料或飼料。本發(fā)明通過離子注入、紫外線、誘變劑等物理化學(xué)處理方法，進(jìn)行選育工作，最終篩選得到一種產(chǎn)漆酶較高的菌種YS-L613，并采用小試自動化控制工藝對菌種的發(fā)酵控制工藝技術(shù)和提取工藝技術(shù)，開發(fā)出漆酶產(chǎn)品。選育的白腐真菌(編號YS—L613)應(yīng)用于漆酶的生產(chǎn)，利用深層液體發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)的漆酶。此種菌種產(chǎn)酶水平穩(wěn)定，周期較短，酶系較純，利用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)漆酶，在發(fā)酵方法上采用了稀醪發(fā)酵，適時(shí)限量補(bǔ)料，輔助pH值控制方法，使產(chǎn)酶菌能夠較長時(shí)間處于產(chǎn)酶旺盛期。經(jīng)過小試、中試并擴(kuò)大至工業(yè)化生產(chǎn)，利用35噸發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，平均放罐酶活力90322u/L，最高達(dá)104284u/L。本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)漆酶工業(yè)化生產(chǎn)，發(fā)酵放罐酶活力水平己達(dá)國內(nèi)領(lǐng)先水平。同時(shí)對成熟發(fā)酵液進(jìn)行濃縮提純處理試驗(yàn)，在參照其它酶提純工業(yè)藝基礎(chǔ)上，把二濾和精濾技術(shù)應(yīng)用于漆酶生產(chǎn)工藝中，成功提純漆酶產(chǎn)品，產(chǎn)品綜合回收率達(dá)60%以上，形成一套完整的漆酶提純工藝技術(shù)，達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。本發(fā)明的方法形成了一套完整的微生物菌株選育、發(fā)酵、酶制劑提純工藝技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了利用液體深層發(fā)酵在35噸罐中進(jìn)行漆酶工業(yè)化生產(chǎn)。另外，在發(fā)酵工藝中，本發(fā)明選用了以二級發(fā)酵菌懸液接種代，采用了稀醪發(fā)酵，適時(shí)限量補(bǔ)料,控制pH的辦法，使發(fā)酵單位提高20%，縮短發(fā)酵周期34hr。在提取工藝中，按照國家標(biāo)準(zhǔn),在總結(jié)國內(nèi)酶生產(chǎn)提取工藝基礎(chǔ)上，利用二濾、超濾工藝技術(shù)處理漆酶產(chǎn)品，產(chǎn)品質(zhì)量經(jīng)檢測完全符合國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)漆酶在紙漿漂白、纖維改性和紙漿脫墨的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在造紙工業(yè)中利用漆酶，能夠改善紙章的品質(zhì)，減少環(huán)境污染，節(jié)約成本。圖l為本發(fā)明的菌種誘變選育方法流程圖；圖2為菌體放入真空靶室內(nèi)不同時(shí)間的存活曲線；圖3為N+注入能量對A3存活率的影響；圖4在10keV能量不同劑量下的存活率；圖5為N+注入劑量與突變率間的關(guān)系；圖6為紫外線照射下菌體的存活曲線；圖7為Y射線輻下菌體的存活曲線；圖8為漆酶產(chǎn)生菌篩選譜系；圖9為傳代實(shí)驗(yàn)流程圖；圖10為漆酶液體發(fā)酵工藝流程圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613菌種，其由以下方法誘變選育而制得，以白腐真菌為出發(fā)菌株，采用以UV、6°C0、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。所需要的材料與制備方法如下-1.1出發(fā)菌種白腐真菌YS菌株，本室篩選并初步鑒定產(chǎn)漆酶菌株，4'C保藏于CPDA斜面。1.2培養(yǎng)基1.2.1斜面培養(yǎng)基(CPDA):葡萄糖20g,MgS04'7H201.5g，KH2P043g，VB12mg,瓊脂粉15g，20。/。土豆汁1000mL。1.2.2搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g，天冬酰胺2.5g,MgS047H200.5g，F(xiàn)eSQ4*7H2010mg，MnS04'4H20lmg，ZnS04'7H20lmg，CuS045H202mg，NaHP04H20100mg，KH2P04l.Og，CaC1210mg,VB150mg,KraftLignin(堿溶木素)lg，定容到1000mL。1.2.3液體種子培養(yǎng)基葡萄糖2%，MgS04*7H200.5%g，KH2P040.3%:VB12X10-4%,土豆汁20%。1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉30g(酶解)，天冬酰胺2.5g,MgS047H200.5g，F(xiàn)eS047H2010mg，MnS044H20lmg，ZnS047H20lmg，CuS045H202mg,NaHP04H20勵mg，KH2P04l.Og，CaCl210mg,VB150mg，KraftLignin(堿溶木素)lg,pH8.5。1.3方法1.3.1種瓶制備取保藏的真菌斜面進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取適量菌絲塊于250mL的三角瓶中(內(nèi)裝50mL液體培養(yǎng)基)，于30。C，150r/min，振蕩培養(yǎng)3d。1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)將種瓶培養(yǎng)物勻漿后按一定的接種量接入發(fā)酵瓶，于30°C，150r/min，培養(yǎng)5天。1.3.3l噸種子罐發(fā)酵條件用接種鋼瓶接入菌種懸浮液，溫度3o士rc，通風(fēng)量30—90mVh，pH為8.3—8.8。35噸發(fā)酵罐發(fā)酵條件采用二級發(fā)酵溫度30士rC，風(fēng)量400—900mVh，pH值8.3—8.8。1.3.4粗酶液制備發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過濾，于室溫，12000r/min離心30min，取上清液，適當(dāng)稀釋后用于酶活測定。1.3.5漆酶活力測定以2，2'連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(以下簡稱ABTS)為底物，反應(yīng)總體積為3mL。取2.85mL0.5mol/L的酒石酸鹽緩沖液(pH4.0)，加入100uL15mmol/L的ABTS和50yL適當(dāng)稀釋的酶樣液，混合，于30'C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min,迅速測定OD420值。定義每分鐘氧化lixmolABTS所需的酶量為一個酶活單位。每樣品做3個重復(fù)，其平均偏差小于10%。1.3.6總糖測定采用3，5-二硝基水楊酸方進(jìn)行測定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液，用7230G分光光度計(jì)測反應(yīng)液A590值，計(jì)算樣品中總糖含量。1.3.7生物量測定發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)過濾脫水后，用蒸餾水洗滌兩次，于干燥箱中80'C恒溫干燥48h,用分析天平測定菌絲體干重。1.3.8pH測定精密酸度計(jì)法。1.4誘變育種程序與方法1.4.1誘變育種程序(見圖l)1.4.2誘變方法1.4.2.1菌懸液的制備將培養(yǎng)4—5d斜面菌種，有無菌的生理鹽水洗下菌絲體，經(jīng)玻璃珠打散，制成含菌體106—108的懸液。1.4.2.2紫外線誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于直徑威為9cm的平皿中，磁力攪拌，于20W紫外線燈15—20cm處，照射1—10min。1.4.2.3亞硝基胍(NTG)誘變用pH6.0、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成的菌懸液于同樣的磷酸鹽緩沖液的NTG液等量混合，分別以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG濃度，30'C溫度，誘變20min，稀釋法終止反應(yīng)。1.4.2.460CoY-射線輻射誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于無菌試管中，分別以8萬、IO萬、倫琴進(jìn)行60CoY-射線輻射(委托省科學(xué)院同位素輔助中心處理)。1.4.2.5離子束注入誘變處理誘變裝置為50keV離子注入機(jī)，等離子體物理研究所離子束生物工程實(shí)驗(yàn)室自行研制生產(chǎn)。注入方式取純種斜面加入10mL無菌水洗脫菌絲體，并稀釋成一定濃度的菌絲體懸液。取0.1mL菌懸液于無菌空平皿中涂均勻，用無菌風(fēng)吹干。然后放入離子注入機(jī)的耙室進(jìn)行離子注入。注入完畢后，用無菌水洗脫，稀釋涂平皿，等單單菌落生成后，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上。1.4.2.6微波誘變吸取制得菌懸浮液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的菌液為10ml，調(diào)整微波爐(格蘭仕)功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，輻照處理20s、40s、60s、80s、100s，其中每輻照10s，要冷卻10s，然后適當(dāng)稀釋涂分離平板。1.4.2.7突變株分離上述各誘變處理的菌懸液，取0.1ml涂布與分離培養(yǎng)13基上3(TC，培養(yǎng)4一5天(紫外線誘變平板避光培養(yǎng))，挑取單菌落，培養(yǎng)3-4天備用。1.5篩選方法1.5.1篩選標(biāo)準(zhǔn)對誘變?nèi)牒蟮木赀M(jìn)行篩選時(shí)，突變株酶活力高于對照菌株5%的突變株為正突變，而低于5%的菌株稱為負(fù)突變，在±5%之間作為未突變菌株。1.5.2初篩各誘變處理后，從3(TC培養(yǎng)12小時(shí)以上生長的菌落，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)有針對性地大量挑取可能與產(chǎn)酶能力有關(guān)的形態(tài)變異性突變菌株，逐步捉高產(chǎn)酶菌株的定向篩選范圍，并傳接斜面2-3代確保菌種性能穩(wěn)定。然后，直接接入發(fā)酵瓶，進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌株接到一個發(fā)酵瓶。挑取正突變的菌株，選3-10株進(jìn)行復(fù)篩。1.5.3復(fù)篩初篩得到的高產(chǎn)酶菌株經(jīng)斜面活化后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)測定酶活力。每個高產(chǎn)菌株接三瓶發(fā)酵瓶，最后挑選最高的菌株作為下一輪誘變的菌株。1.6遺產(chǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在斜面培養(yǎng)基上將高產(chǎn)的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，聯(lián)系培養(yǎng)6-7次后接種到發(fā)酵瓶中檢測酶活。2、結(jié)果與討論2.1離子束注入漆酶產(chǎn)生菌的誘變選育2丄1注入離子的選擇注入所選用的離子包括金屬離子和非金屬離子。實(shí)驗(yàn)常用的離子為非金屬離子(如H"、N"和Ar+)。但就rr、N"和Ar+這三種常用類型的離子而言，不同的研究報(bào)道有所差異，有人認(rèn)為在其它條件不變的情況下H+N+和Ar+三種離子的致死關(guān)系為H+〉N+〉A(chǔ)r+;也有人認(rèn)為三種離子在致死率上存在的關(guān)系應(yīng)為Ar〉N+〉H+。雖然研究人員就三種離子在致死率關(guān)系上存有分歧，但是在其誘變效率上卻存在著共識，普遍認(rèn)為N+的誘變效率最高，H+次之，Ar+的誘變效率最低。因?yàn)镹+為組成DNA堿基的重要元素之一，N+注入不僅可以直接引起前堿基分子結(jié)構(gòu)的變化，還可以參與細(xì)胞的重組和修復(fù)，產(chǎn)生的誘變突變較多，因此常用于微生物和植物誘變育種?；谏鲜龅难芯拷Y(jié)果本發(fā)明選用了N+對黑曲霉A3處理，開展誘變選育的工作。2丄2真空對存活率的影響在離子注入過程中，所有的處理樣品都要放在靶室里，處在真空中，因此樣品都要受到真空的影響，而真空對白腐真菌存活率影響，是研究離子注入條件下黑曲霉A3孢子存活率的基礎(chǔ)。所以在不同劑量的離子處理樣品的過程中，均在靶室中放入了未接受注入的真空對照樣品。圖2是菌體放入真空靶室內(nèi)不同時(shí)間的存活曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白腐真菌的存活率隨著放入真空中時(shí)間的延長而呈現(xiàn)由快到慢的下降態(tài)勢。滯留6分鐘后只有大約20%的孢子存活，8分鐘后致死率在98%以上，有時(shí)甚至達(dá)到100%。這可能是當(dāng)細(xì)胞突然暴露于真空靶室時(shí)，水分不斷蒸發(fā)，帶走了大量的汽化熱，菌體界面溫度迅速下降，由于細(xì)胞內(nèi)的熱傳導(dǎo)，一段時(shí)間內(nèi)，整個菌體內(nèi)部形成冰晶，使孢子大量死亡。2丄3能量對存活率的影響在離子注入過程中，除離子種類對誘變效率密切相關(guān)外，注入劑量率、能量和劑量等注入?yún)?shù)對此也有很大的影響，近年來的研究報(bào)道指出正突變較多發(fā)生在低致死率的誘變劑量中，存活率在20%—30%時(shí)，誘變效果較好。因此如何尋找合適的誘變參數(shù)成為實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的問題。本發(fā)明選用2.6X1013iOnS/cm2中等劑量率對白腐真菌進(jìn)行處理，著重對N^注入的能量和劑量進(jìn)行了研究。從圖3中可以看出，在注入劑量為15.6X10'5ions/cm2時(shí)，菌體的存活率呈現(xiàn)出肩型曲線。在較低的能量下菌體存活率呈現(xiàn)出急劇的下降趨勢，當(dāng)能量繼續(xù)增大到10keV以上時(shí)，其存活率下降速度有明顯減慢，致死率保持在一個水平狀態(tài)。在誘變選育工作中為了確保有一定的存活率和較多的正突變，因此選取10keV的能量對菌株進(jìn)行離子注入處理。2.1.4不同的劑量對菌體存活率的影響在選定N"的注入能量后，對注入劑量和各個劑量下的存活率進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，它的存活曲線呈現(xiàn)出特異的雙峰；這種特異的存活曲線圖與紫外線和Y-射線等其他射線輻照生物有機(jī)體后呈現(xiàn)"肩型"或"直線型"的存活曲線相比有明顯不同；與曾報(bào)道過的"馬鞍型"曲線也不完全相同。盡管"雙峰曲線"與"馬鞍型"曲線不同，但是它的確能夠反映離子束這種特異的誘變源所具有的獨(dú)特的誘變效果，說明離子束獨(dú)特的誘變效應(yīng)具有其普遍性，即出現(xiàn)反常損傷；這也進(jìn)一步證實(shí)離子束在誘變機(jī)理上與其它的輻射誘變源相比確有差異，因?yàn)殡x子注入除了具有能量沉積效應(yīng)外，還有動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷的中和與交換等效應(yīng)存在。2.1.5不同劑量下的突變率當(dāng)N+注入能量為10kev時(shí)，注入劑量從10x2.6xl014120x2.6xl014ions/s'cn^等幾組不同劑量，對菌體進(jìn)行注入，它們的突變率情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖5。從圖中可以看到，在10、20和60x2.6x1014的注入劑量下，正突變率要比負(fù)突變高，在40x2.6xl0"的劑量下負(fù)突變稍微比正突變高一些。而在80、100和120x2.6xl0"的劑量下負(fù)突變率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正突變。因此在選用注入劑量的情況下，既要考慮突變菌株的存活率，也要考慮正突變率。所以在離子注入誘變選育中，本發(fā)明選用10，20、40、60x2.6xl014這四個劑量作為常用的誘變注入劑量。注圖5中①各個劑量突變率是以隨機(jī)挑取的100200個左右的單菌落來統(tǒng)計(jì)；②計(jì)算正負(fù)突變時(shí)以高出和低于對照組5%為標(biāo)準(zhǔn)。2.26°Co_Y射線輻照和紫外線照射對菌體存活率和誘變效果的影響用Y射線輻照和紫外線照射漆酶產(chǎn)生菌菌體，照射后菌體的存活曲線見圖6、7。結(jié)果顯示，紫外線和6°0)-Y射線輻照的存活曲線都呈現(xiàn)單方向下降趨勢，不過紫外線照射的存活曲線，在隨著照射時(shí)間的增加迅速下降，在照射3min后，存活率降低較慢；而6nCo-Y射線輻照時(shí)，在低劑量下，菌體死亡較少，但用高劑量的射線進(jìn)行照射時(shí)，存活率迅速下降，其存活曲線與拋物線相近。16表1紫外線照射和600)Y輻照對菌體的影響IrradiationSurvivalMutationPositiveNegativedoserate%rate%mutationrate%mutationrate%UV(2min)28.9113.78.15.6UV+LiCl32.1719.811.58.3(2min)UV+LiCl9.1222.113.98.2(4min)60Co12.1420.59.211.3(0.6kGy)60Co0.91131.74.926.8(1.2kGy)表1為Y射線和紫外線對漆酶產(chǎn)生菌菌體的誘變結(jié)果。它表明，菌體隨著Y射線處理劑量的增大，存活率在下降而菌株的總突變率卻顯著增加；與此同時(shí)，正變率大幅度降低，產(chǎn)量負(fù)變率大幅度上升。紫外線照射4min和用0.6kGy的y射線處理的存活率和總突變率相當(dāng)，但是Y射線處理的正突變效應(yīng)小于負(fù)突變效應(yīng)；而紫外處理的正突變效應(yīng)卻大于負(fù)突變效應(yīng)。雖然通過降低Y射線的輻照劑量，來提供正突變率，但是仍然不能改變，用Y射線輻照產(chǎn)生的正突變小于負(fù)突變這個事實(shí)。紫外線+LiCl的復(fù)合誘變處理效果明顯好于單一紫外線的處理。復(fù)合誘變不僅提高了菌體的總突變率，而且還提高了正變率和正變幅度。并且從表l可以看到，隨著紫外線照射的延長，雖然菌體存活率下降，但是總突變率提高，且正突變率大于負(fù)突變率。2.3篩選譜系在誘變選育實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過初篩和復(fù)篩得到所需要的產(chǎn)漆酶的高產(chǎn)菌株。圖8為整個誘變過程中的誘變篩選圖譜。在圖譜中所用的字母如A、B17等為誘變的次序，字母后的數(shù)字為菌株的編號，括號內(nèi)的數(shù)字為該菌株在發(fā)酵過程中每毫升發(fā)酵液中的酶活單位。通過各種誘變手段最終得到幾株漆酶的高產(chǎn)菌株。本發(fā)明對高產(chǎn)菌株YS-L613的遺產(chǎn)穩(wěn)定性以及搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行研究，目的是確定YS-L613菌株是否適宜工業(yè)化生產(chǎn)漆酶。2.4高產(chǎn)菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性考察在工業(yè)生產(chǎn)中所用到的菌株，必須具備較穩(wěn)定的遺產(chǎn)特性。通過選育得到的L613菌株，為了考察它是否具有較好的遺產(chǎn)穩(wěn)定性，通過對該菌株傳代分離純化檢測漆酶的酶活性是否保持在一個較為穩(wěn)定的水平；其實(shí)驗(yàn)流程圖和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9和表2，從流程圖9和實(shí)驗(yàn)結(jié)果上本發(fā)明可以看出，YS-L613很好的保持了較高的穩(wěn)定產(chǎn)酶能力，搖瓶發(fā)酵，產(chǎn)酶水平基本維持在31900U/L左右。表2高漆酶產(chǎn)生菌YS-L613傳代結(jié)果菌株YS-L613FlF2F3F4F5F6漆酶酶活(U/L)3189831817319213179331879319242.5l噸發(fā)酵罐試驗(yàn)將突變株YS-L613菌株茄子瓶斜面2-3瓶，稀釋成菌懸浮液接入lm3發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，罐內(nèi)裝料體積0.6r^溫度為30土rC，通風(fēng)量30-90mVhr，罐壓0.06-0.08mpa，pH值8.3-8.8,連續(xù)發(fā)酵5批，結(jié)果如表3。表3:11113中試發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號罐號消后pH消后DE值放罐D(zhuǎn)E值放罐pH放罐酶發(fā)酵周(mg/ml)(mg/ml)活(u/L)期(hr)1皿8.40.420.276.1631249421038.30.400.255.7596378731048.50.380.206.5615979041068.40.350.195.6593938551028.50.400.236.4698159318以上結(jié)果表明選育的YS-L613菌株能夠用于中試工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。2.6工業(yè)生產(chǎn)(35噸發(fā)酵罐進(jìn)行工業(yè)化試生產(chǎn))將培養(yǎng)成熟的YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌懸液，用接種鋼瓶接入裝有0.71113種子發(fā)酵培養(yǎng)基的lm3種子發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度30土rC，罐壓0.06-0.08mpa(表)，通風(fēng)量30-90mVhr，培養(yǎng)約30hr接入35n^大發(fā)酵罐(裝料系數(shù)70%)，溫度控制在30±1°C，罐壓0.06-0.08mpa(表)，通風(fēng)量400-1000mVhr，pH值8.3-8.8，于53，pH低于8.3時(shí)通氨，高于8.8時(shí)加時(shí)酸回調(diào)至8.8，當(dāng)DE下降至0.4時(shí)補(bǔ)料,補(bǔ)料要少補(bǔ)、勤補(bǔ)。連續(xù)試驗(yàn)時(shí)8批次,發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表4。表4:連續(xù)8批次發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果序號罐號消后消后DE首次通放罐D(zhuǎn)E放罐放罐酶活發(fā)酵周pH值氨時(shí)間值pH(u/L)期(hr)(mg/ml(hr)(mg/ml))13038.30.61100.158.5798429623048.50.62120.138.58329710033058.60.57110.188.49824010543088.70.54130.208.39463110953078.50.55130.198.28945310263068.40.60110.118.410428411073038.60.61120.138.59127610783028.70.58100.208.681757102平均0.5850.168.4290322.5103.88以上結(jié)果表明通過對發(fā)酵過程的控制，采用適時(shí)限量補(bǔ)料，調(diào)控pH值的辦法，使YS-L613菌株在深層液體發(fā)酵中產(chǎn)酶能力有極大提高。8批次35罐噸生產(chǎn)平均產(chǎn)酶90322.5U/L，最高罐產(chǎn)酶104284U/L，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并為工19業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。3.結(jié)論以白腐真菌為出發(fā)菌株,采用以UV、6°C0、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613，產(chǎn)酶水平較出發(fā)菌株提高85.6y。倍，達(dá)到31898u/L，并經(jīng)中試，工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn),其中5批次中試平均產(chǎn)酶62713u/L，35噸罐8批次平均產(chǎn)酶90322.5U/L，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定不易退化。本發(fā)明是將微波誘變、離子束注入和常規(guī)誘變技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于漆酶高產(chǎn)菌株選育并進(jìn)行大膽嘗試，離子束、微波誘變作為新興的微生物育種技術(shù),在世界各地己廣泛進(jìn)行,并有一定成果，但它們與傳統(tǒng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合誘變處理在國內(nèi)并不多見。在傳統(tǒng)工業(yè)微生物誘變育種工作中，單因子誘變篩選突變株效果不理想，本發(fā)明通過多因子不同劑量復(fù)合誘變和微波、離子束注入誘變處理相結(jié)合誘變方法,可有效改善菌株對誘變劑的敏感性，提高變異率，逐步提高突變株的產(chǎn)酶水平，達(dá)到誘變篩選的最終目的。2、漆酶生產(chǎn)工藝技術(shù)路線的確定在國內(nèi)酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)中，一般有固態(tài)發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法之分法之分。固態(tài)發(fā)酵法又稱曲法培養(yǎng)，往往是混雜有其它雜菌菌株混合發(fā)酵，不能達(dá)到純種發(fā)酵，酶分離提純難度大，發(fā)酵提取易感染雜菌，勞動強(qiáng)度大，難于對工藝參數(shù)進(jìn)行合理控制，只能生產(chǎn)工業(yè)用酶，而液體深層發(fā)酵法機(jī)械化程度高，發(fā)酵條件易控制(部分發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)自動化控制)，而且酶的產(chǎn)率高、質(zhì)量好，可達(dá)到生產(chǎn)要求。本發(fā)明按照液體發(fā)酵法的條件和要求,本發(fā)明篩選出了適合液體發(fā)酵的生產(chǎn)菌株(見第一部分)和配套的發(fā)酵提取工藝技術(shù)。在發(fā)酵工藝技術(shù)中，本發(fā)明選用了二級發(fā)酵，菌體懸浮液直接接種和采用稀醪發(fā)酵，適時(shí)限量補(bǔ)料，控制pH值的辦法作為研究對象；在提取工藝上，以板框過濾,超濾膜濃縮為基礎(chǔ)，增加二濾和精濾技術(shù)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量符合國家要求。3、漆酶生產(chǎn)工藝流程漆酶生產(chǎn)工藝流程見圖IO。204、發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)酶結(jié)果影響研究酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有高度催化活性的特殊蛋白質(zhì)。酶的發(fā)酵技術(shù)是以優(yōu)良菌株為基礎(chǔ),通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行擴(kuò)大繁殖和酶的大量積累的過程。微生物產(chǎn)酶的發(fā)酵是一個十分復(fù)雜的過程,既有菌體的生長，又有產(chǎn)酶的分泌過程，影響因素諸多，各種因素之間相互影響，相互制約。選擇優(yōu)良的菌株和恰當(dāng)?shù)漠a(chǎn)酶條件對酶制劑生產(chǎn)來說已顯得十分重要。為使菌體極大限度地產(chǎn)酶,本發(fā)明在對漆酶產(chǎn)酶條件研究基礎(chǔ)上，重點(diǎn)選取產(chǎn)酶主要影響因素進(jìn)行重點(diǎn)討論，主要因素有接種量與接種方式，濃醪發(fā)酵與稀醪發(fā)酵，補(bǔ)料與不補(bǔ)料，PH控制與不控制等四個方面。其試驗(yàn)結(jié)果如下表5。表5發(fā)酵工藝條件對產(chǎn)酶影響試驗(yàn)結(jié)果ABCD消后pH8.38.55.68.7消后DE(mg/ml)0.480.750.550.62發(fā)酵酶活(u/L)73214827949191299824放罐pH8.48.38.58.4放罐D(zhuǎn)E(mg/ml)0.26.0.190.180.16首次通氨時(shí)間(hr)3335359發(fā)酵周期(hr)861059590工業(yè)參數(shù)控制溫度30±1'C罐壓0.06-0.08Mpa通風(fēng)量400—1000mVhrPh8.3-8.8備注稀醪發(fā)酵稀醪發(fā)酵稀醪發(fā)酵稀醪發(fā)酵不補(bǔ)料，不補(bǔ)料，適時(shí)限量補(bǔ)料，適時(shí)限量補(bǔ)控制調(diào)節(jié)pH控制調(diào)節(jié)pH控制pH料，菌懸液接種菌懸液接種菌懸液接種控制pH值二級發(fā)酵21從表5可以看出(1)法方A:直接利用稀醪發(fā)酵，未進(jìn)行補(bǔ)料，控制pH值范圍，周期86hr，但產(chǎn)酶相對較低,與中試不控制pH相比產(chǎn)酶有了提高。(2)法方B:在保持C/N不比變情況下，增加C源和N源的實(shí)際投料置，產(chǎn)酶平均82794U/L，較A法提高高酶活力139&,但105hr的發(fā)酵周期太長，經(jīng)效益不入晳n異o(3)方法C:在A法基礎(chǔ)上應(yīng)用補(bǔ)料工藝，產(chǎn)酶有一定提高，較B方法提高1W。，大發(fā)酵周期也較長達(dá)95hr。(4)方法D:在C方法基礎(chǔ)上利用二級發(fā)酵菌懸液接種，采用稀醪補(bǔ)料工藝，并控制pH值方法，產(chǎn)酶達(dá)99824U/L，較(:法提高9%，較C法縮短同期5hr，單位時(shí)間產(chǎn)酶效果較明顯。通過對發(fā)酵過程的動態(tài)分析和上述試驗(yàn)，本發(fā)明得出如下經(jīng)驗(yàn)結(jié)論(1)本發(fā)明在試驗(yàn)中利用二級發(fā)酵，菌懸液接種(接種量2.5-3%)取得了顯著效果。這種接種方式周期短、產(chǎn)酶高,是因?yàn)榻臃N量大,菌體很快迸入對數(shù)生長產(chǎn)酶期，從第一次通氨時(shí)間也可說明菌體生長情況。菌懸液接種第一次通氨時(shí)間為9小時(shí)。(2)中間補(bǔ)料能延長發(fā)酵產(chǎn)物的分泌期，推遲菌種的自溶期，保持較高的發(fā)酵產(chǎn)物增長幅度，并增加發(fā)酵體積，使單罐產(chǎn)量大幅度上升。漆酶發(fā)酵過程中的補(bǔ)料既包括營養(yǎng)物質(zhì)C、N源的補(bǔ)入，也包括無機(jī)鹽(氨水、硫酸)的補(bǔ)入。氨水、硫酸的補(bǔ)入在于維持pH穩(wěn)定在8.3-8.8之間，以利于菌株產(chǎn)酶。營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)入在于及時(shí)補(bǔ)充菌體代謝活動和合成酶所需的C/N源及合適C/N比例。補(bǔ)料要根據(jù)菌體生長代謝規(guī)律和產(chǎn)酶合成途徑,采取少補(bǔ)、勤補(bǔ)的原則,一般DE值低于O.4時(shí)補(bǔ)料時(shí)較為合適。補(bǔ)入量一般確保DE值達(dá)到O.5為宜，從補(bǔ)料結(jié)果看，補(bǔ)料與不補(bǔ)料相比，可以調(diào)酶活力33%，時(shí)適限量補(bǔ)料對漆酶生產(chǎn)來說十分重要。(3)采用稀醪低濃度發(fā)酵更有利于菌體生長產(chǎn)酶，可避免原料中營養(yǎng)物質(zhì)降解過量而引起分解代謝阻遇，有利于pH值控制,延長產(chǎn)酶期，提高產(chǎn)量。從22表5中可知，A方法86hr酶產(chǎn)73214U/L，而方法B，105hr產(chǎn)酶82794U/L,濃醪發(fā)酵比稀醪發(fā)酵單位時(shí)間產(chǎn)酶率低,周期長。5.提取濃縮工藝技術(shù)研究生產(chǎn)工業(yè)用酶制劑，不僅菌種要嚴(yán)格控制，而且要選好原料，防止有害物質(zhì)的污染，還要選擇合適的提取工藝，這對生產(chǎn)符合國家酶制劑標(biāo)準(zhǔn)的要求，安全的酶制劑是十分必要的。本發(fā)明不但選育了適合生產(chǎn)的安全菌株，而且對提取工藝做了詳細(xì)研究,在充分分析了國內(nèi)其它酶制劑產(chǎn)品生產(chǎn)工藝?yán)浊疤嵯?，結(jié)合漆酶的實(shí)際情況，在提取工藝上增加二濾和相關(guān)工藝，充分保證成品酶制劑中不含發(fā)酵液殘?jiān)瑢?shí)現(xiàn)工業(yè)漆酶的生產(chǎn)。5.1二濾設(shè)備的選擇及二濾工藝液體酶的生產(chǎn)，本發(fā)明需要的是濾液。因此,濾液的清濁直接影響液體酶品質(zhì)及超濾設(shè)備的使用。發(fā)酵成熱醪液打入回收罐后，加入0.2%的苯甲酸鈉抑菌劑，防止提純過程中雜菌生長，然后直接進(jìn)入大板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾(簡稱粗濾或一濾)。在粗濾過程中，往往由于設(shè)備原因及人為原因造成渾液少量誤流入清液中，不但達(dá)不到分離的效果，而且影響產(chǎn)品的質(zhì)量，影響后續(xù)工藝超過濾膜通透性及使用壽命。為此,在工藝制定中增加二濾設(shè)備，并連接了相關(guān)管道。二濾板框過濾機(jī)采用浙江杭洲興源板框過濾機(jī)廠生產(chǎn)的XAG20/80uk(型過濾面積20m2)，濾液經(jīng)二濾后進(jìn)入超濾膜過濾。5.2超濾濃縮工藝研究.超濾濃縮工藝是液體酶制劑生產(chǎn)中的一個關(guān)鍵工序，發(fā)揮著重要作用。超濾的工作原理是在一定壓力作用下，把大分子溶質(zhì)阻留在膜的一側(cè)(留在原來溶液中)，而小分子溶質(zhì)透過至膜的另一側(cè)，從而達(dá)到分離純化，濃縮的目的。漆酶超濾濃縮結(jié)果見表6(漆酶提取工藝試驗(yàn)結(jié)果)。按照酶的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法，超濾濃縮后可直接加入防腐劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和包裝入庫，該方法生產(chǎn)的酶制劑成品酶活力符合標(biāo)準(zhǔn)要求。表6漆酶提純試驗(yàn)結(jié)果罐酶活(u/L)放罐體(m3)濃縮后酶活濃縮后體積(m3)產(chǎn)品回收率％23(u/L)832972510697391.46759824025.512024581.507294631269582631.9074894532410102921.537210428424.511442451.63736本發(fā)明的漆酶在造紙工業(yè)中的應(yīng)用1)漆酶在紙漿漂白中的應(yīng)用漆酶是一種含銅的酶蛋白，它的氧化還原勢較低，只能氧化降解酚型的木素結(jié)構(gòu)單元，而不能氧化降解在植物纖維木素結(jié)構(gòu)中占主要的非酚型單元。漆酶/HBT與氧脫木素的桉木硫酸鹽漿作用，接著進(jìn)行堿抽提，卡伯值由10.5降至6.6，若漆酶與木聚糖酶共用，卡伯值降至5.9。采用L(E0)LQ(P0)流程，紙漿可以漂至89呢IS0的白度，而撕裂強(qiáng)度與D(EO)DD漂白漿相同。表72為含酶漂白的幾種流程的漂白結(jié)果。表7為酶漂白的幾種流程的漂白結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>上述試驗(yàn)結(jié)果表明，LMS在合適的介體和處理?xiàng)l件下，有顯著的脫木素和漂白作用?？ú递^低的松木和桉木硫酸鹽漿，經(jīng)漆酶/介體漂段和堿抽提，再經(jīng)過氧化氫或壓力過氧化氫漂段，可達(dá)到85y。ISO以上的白度。2)漆酶在纖維改性方面的應(yīng)用漆酶能活化木素改進(jìn)紙漿濕強(qiáng)度特性，選用的漿料為高得率未漂硫酸鹽槳。由于這種紙漿含有較多的木素，為漆酶催化木素氧化、促進(jìn)纖維間交聯(lián)提供了可能。采用2種試驗(yàn)途徑(l)在富含木素的抽出液中，用漆酶氧化未漂硫酸鹽漿；(2)應(yīng)用漆酶LMS.介體系統(tǒng)氧化未漂硫酸鹽漿。其結(jié)果如表8所示。表8經(jīng)漆酶和介體氧化的未漂硫酸鹽漿的干濕抗張強(qiáng)度濕抗張強(qiáng)度千抗張強(qiáng)度介j本種類緊度/gnr3N,mg-iN.nig4S=0.12S=0.12空白*0.6922.473.84PFT0.6834.571.6MS0.6923.472,5NHAO.柳2.570,8ABTS0.6704.9議0HBT0.6852.371.6注用漆酶處理，漆酶用量為30U/g，介體濃度為25umol/L從上述結(jié)果中可以看出，經(jīng)漆酶和PPT、MS、ABTS等介體處理后試樣的濕強(qiáng)度明顯提高。漆酶催化木質(zhì)纖維中的木素或氧化溶于液相中的木素，生成酚氧自由基，發(fā)生自由基聚合反應(yīng)，MartinLund認(rèn)為自由基聚合的木素包圍著紙中纖維，其作用相當(dāng)于紙張濕強(qiáng)劑。各種可以提高紙張濕強(qiáng)度的高分子，其作用原理就是在纖維間形成交聯(lián)網(wǎng)，該網(wǎng)可以阻止纖維潤脹，保護(hù)氫鍵不被破壞，在未漂硫酸鹽漿中加入富含木素的抽提液，其濕抗張強(qiáng)度增加幅度最大。3)漆酶在紙漿脫墨中的應(yīng)用目前我國制漿造紙工業(yè)面臨著原料短缺、污染嚴(yán)重和能源緊張等問題，脫墨廢紙漿作為一種二次纖維用于造紙生產(chǎn)，不但可以減輕環(huán)境污染，節(jié)約能源，更可以部分解決我國森林資源貧乏、紙漿緊缺的問題。與傳統(tǒng)的化學(xué)法脫墨相比，酶法脫墨能降低能耗，減輕環(huán)境污染，脫墨效率高。目前用于脫墨研究的酶制劑有脂肪酶、果膠酶、淀粉酶、半纖維素酶、纖維素酶和漆25酶等。廢紙的纖維素酶和半纖維素酶酶法脫墨已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。漆酶可以通過氧化降解紙漿表面的木素來達(dá)到脫除油墨的目的，這對于舊報(bào)紙漿脫墨很有優(yōu)勢。最后所應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。2權(quán)利要求1、一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613，其特征在于其由以下方法誘變選育而制得，以白腐真菌為出發(fā)菌株，采用以UV、60CO、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。2、一種如權(quán)利要求l所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的誘變選育方法，其特征在于以白腐真菌為出發(fā)菌株，采用以UV、6°C0、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的誘變選育方法，其特征在于具體方法包括以下步驟(1)出發(fā)菌種，以白腐真菌YS菌株為出發(fā)菌種，4'C保藏于CPDA斜面；(2)培養(yǎng)基①斜面培養(yǎng)基(CPDA)為每20。/。土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgS047H201—2g、KH2P042—4g、VB11—3mg、瓊脂粉13一16g;②搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.1—lmg、ZnS047H200.1—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04H2090—llOmg、KH2P040.1—lg、CaCl28—12mg、VB148—52mg、KraftLignin(堿溶木素)0.1—lg;③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1一3%、MgS04'7H200.1—1°/。、KH2P040.1—0.5%、VB12X1(T4%、土豆汁20%、其余為水；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS04'7H2O0.5—lmg、CuS04*5H201—3mg、NaHP04*H20%—llOmg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(堿溶木素)0.5—lg，pH8.5;(3)種瓶制備:取保藏的真菌斜面進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取適量菌絲塊于250mL的三角瓶中(內(nèi)裝50mL液體培養(yǎng)基)，于30'C,150r/min，振蕩培養(yǎng)3d;發(fā)酵培養(yǎng)將種瓶培養(yǎng)物勻漿后接入發(fā)酵瓶，于3(TC，150r/min，培養(yǎng)5天；(4)菌懸液的制備將培養(yǎng)4一5d斜面菌種，有無菌的生理鹽水洗下菌絲體，經(jīng)玻璃珠打散，制成含菌體106-108的懸液；①紫外線誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于直徑為9cm的平皿中，磁力攪拌，于20W紫外線燈15—20cm處，照射l一10min;②亞硝基胍(NTG)誘變用pH6.0、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液制成的菌懸液于同樣的磷酸鹽緩沖液的NTG液等量混合，分別以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG濃度，3(TC溫度，誘變20min，稀釋法終止反應(yīng)；③6QCoY-射線輻射誘變?nèi)?0ml菌懸浮液于無菌試管中，分別以8萬、IO萬、倫琴進(jìn)行60CoY-射線輻射；O離子束注入誘變處理取純種斜面加入10mL無菌水洗脫菌絲體，并稀釋成一定濃度的菌絲體懸液，取O.lmL菌懸液于無菌空平皿中涂均勻，用無菌風(fēng)吹干；然后放入離子注入機(jī)的靶室進(jìn)行離子注入，注入完畢后，用無菌水洗脫，稀釋涂平皿，等單單菌落生成后，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上；微波誘變吸取制得菌懸浮液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的菌液為10ml，調(diào)整微波爐(格蘭仕)功率為700W，脈沖頻率為2450Hz，輻照處理20s、40s、60s、80s、100s，其中每輻照10s，要冷卻10s，然后適當(dāng)稀釋涂分離平板；(5)突變株分離上述各誘變處理的菌懸液，取O.lml涂布與分離培養(yǎng)基上30。C，培養(yǎng)4一5天(紫外線誘變平板避光培養(yǎng))，挑取單菌落，培養(yǎng)3—4天備用；(6)篩選，對誘變?nèi)牒蟮木赀M(jìn)行篩選時(shí)，突變株酶活力高于對照菌株5%的突變株為正突變，而低于5%的菌株稱為負(fù)突變，在±5%之間作為未突變菌株。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的誘變選育方法，其特征在于所述步驟(6)的篩選包括初篩和復(fù)篩，其中初篩是各誘變處理后，從3(TC培養(yǎng)12小時(shí)以上生長的菌落，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)有針對性地大量挑取可能與產(chǎn)酶能力有關(guān)的形態(tài)變異性突變菌株，逐步捉高產(chǎn)酶菌株的定向篩選范圍，并傳接斜面2—3代確保菌種性能穩(wěn)定；然后，直接接入發(fā)酵瓶，進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌株接到一個發(fā)酵瓶，挑取正突變的菌株，選3—10株進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩是將初篩得到的高產(chǎn)酶菌株經(jīng)斜面活化后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)測定酶活力。5、一種利用如權(quán)利要求l所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于包括以下步驟將培養(yǎng)成熟的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌懸液，接入裝有種子發(fā)酵培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度29—3rC，罐壓O.06—0.08即a(表)，通風(fēng)量30—90m7hr，培養(yǎng)約30hr接入35n^大發(fā)酵罐(裝料系數(shù)7090，溫度控制在29—31。C，罐壓0.06—0.08卿a(表)，通風(fēng)量400—1000m7hr，pH值8.3—8.8;發(fā)酵成熱醪液打入回收罐后，加入O.2—0.5%抑菌劑，然后直接進(jìn)行過濾，濾液經(jīng)二濾后進(jìn)入超濾膜過濾，經(jīng)超濾濃縮后可直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和包裝入庫，即制得液體酶制品。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述的液體種子培養(yǎng)基葡萄糖1一3%、MgS04'7H2O0.1—l%、KH2P040.1—0.5%、VB12X10-4%、土豆汁20%，其余為水。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每L中含有玉米淀粉25一35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H20O.l—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS047H200.5—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04*恥90—110mg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(堿溶木素)0.5—lg，pH8.5。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述的抑菌劑優(yōu)選為苯甲酸鈉。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述的二濾工藝采用的為二濾板框過濾機(jī)。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述的過濾后的濾渣經(jīng)干燥后可以用做填充料或飼料。全文摘要本發(fā)明涉及一種白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613及其選育方法和應(yīng)用，其由以下方法誘變選育而制得，以白腐真菌為出發(fā)菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外線、亞硝基胍、離子注入與微波處理相結(jié)合的復(fù)合誘變育種技術(shù)，選育出漆酶高產(chǎn)菌株YS-L613。本發(fā)明通過離子注入、紫外線、誘變劑等物理化學(xué)處理方法，進(jìn)行選育工作，最終篩選得到一種產(chǎn)漆酶較高的菌種YS-L613，并采用小試自動化控制工藝對菌種的發(fā)酵控制工藝技術(shù)和提取工藝技術(shù)，開發(fā)出漆酶產(chǎn)品。根據(jù)漆酶在紙漿漂白、纖維改性和紙漿脫墨的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在造紙工業(yè)中利用漆酶，能夠改善紙章的品質(zhì)，減少環(huán)境污染，節(jié)約成本。文檔編號C12N1/14GK101469312SQ20071030003公開日2009年7月1日申請日期2007年12月24日優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日發(fā)明者吳慧霞,左雪梅,常東民,李市場,娜王,王耀民,茹群朵,郭至瑞申請人:河南仰韶生化工程有限公司