專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (LAMP)技術(shù)檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(St即hylococcus aureus, S. aureus)簡(jiǎn)稱(chēng)金葡菌，球形，直徑
0. 811m，在顯微鏡下排列成葡萄串狀，無(wú)芽孢、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性。金葡 菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可以找到，是引起細(xì)菌性 食物中毒的主要病原菌，而且在國(guó)家鮮乳標(biāo)準(zhǔn)中列為不得檢出的項(xiàng)目。目前國(guó)標(biāo)法仍采用 傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，但步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、靈敏性差等缺點(diǎn)。雖然近幾年出現(xiàn)了一些簡(jiǎn) 便快速的技術(shù)，但是，直接應(yīng)用于牛奶中的金葡菌檢測(cè)，仍然不可行，因?yàn)?，牛奶中的蛋白質(zhì) 和脂肪等物質(zhì)給檢測(cè)帶來(lái)了很大的影響，因此，開(kāi)發(fā)一種快速檢測(cè)牛奶中金葡菌的技術(shù)已 成為主要的發(fā)展趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒，建立了一種快速、
靈敏的用于牛奶中的金黃色葡萄球菌檢測(cè)的方法，適用于牛奶中金葡菌的定性檢測(cè)。 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了該試劑盒的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明的快速檢測(cè)牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的試劑盒，具體構(gòu)成如下 1)免疫微球聯(lián)接金黃色葡萄球菌抗體的羧基微球。
2)兩對(duì)引物為 外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
內(nèi)引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3)LAMP反應(yīng)液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化鉀、10mmo1/
L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0. 1 % TritonX-100、 1. Omol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4)陽(yáng)性對(duì)照液金黃色葡萄球菌基因組DNA。
5)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)菌雙蒸水。
本發(fā)明試劑盒的制備方法，包括以下步驟
1、免疫微球 1)金黃色葡萄球菌多克隆抗體的制備A :將經(jīng)鑒定的金黃色葡萄球菌接種到LB培養(yǎng)液中，37t:、200r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，用0. 3%甲醛溶液37t:滅活24h，涂平板檢驗(yàn)無(wú)活菌后用生理鹽水洗滌兩次，最后 用200iiL生理鹽水重懸，并調(diào)整其濃度為1Xl(fCFU/ml，與200iiL弗氏完全佐劑充分乳 化，作為免疫原。 B :取兩只體重lkg左右雄性健康新西蘭大白兔，取以上免疫原皮下多點(diǎn)注射。首 次免疫后間隔兩周加強(qiáng)免疫，免疫劑量1 X 1(TCFU/ml ， 200 ii L菌液與200 y L弗氏不完全佐 劑充分乳化，皮下多點(diǎn)注射，每隔兩周進(jìn)行一次，第三次免疫一周后耳靜脈采血測(cè)效價(jià)。當(dāng) 效價(jià)達(dá)到1 : 1000時(shí)加強(qiáng)免疫一次一周后心臟放血分離血清，經(jīng)HiTr即Protein A HP純 化柱純化后，置于-2(TC保存。
2)免疫微球的制備 A :取微球原液超聲波震蕩30s，然后用去離子水洗滌一次。 B :加入羧基微球表面活化劑，室溫震蕩20min，離心洗滌一次，重懸于100 y L PBS中。 C :加入多克隆抗體，漩渦震蕩混勻，室溫震蕩2h，洗滌離心兩次，重懸于含1% BSA 的100 ii L PBS中，室溫震蕩4h，4t:過(guò)夜以阻斷微球表面未結(jié)合位點(diǎn)。
D :用洗滌液洗滌微球2次，重懸于100ii LPBS中，4。C備用。
2、兩對(duì)引物 根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶(皿c)基因(Genbank登錄號(hào)V01281)，利用 Primer ExplorerV4設(shè)計(jì)弓l物如下
外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
內(nèi)引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3、LAMP反應(yīng)液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、 1Ommol/L氯化鉀、10mmo1/
L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0. 1 % TritonX-100、 1. 0mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4、陽(yáng)性對(duì)照液采用AxyPr印細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取金黃色葡萄球菌基 因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。 5、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。
本發(fā)明的使用方法包括以下步驟
1)牛奶樣品前處理取lmL牛奶樣品于2mL離心管中，加入100 y L微球，在室溫下輕輕震蕩30min，離 心，棄上清，用100iiL無(wú)菌水重懸沉淀，煮沸10min，離心，取上清。
2)LAMP反應(yīng) 取1 ii L上清加入到LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，進(jìn)行LAMP檢領(lǐng)"反應(yīng)條件為
65 °C 50min。 3)結(jié)果判定 取8 ii LLAMP產(chǎn)物，以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠圖像分析儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。
以下實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒可以快速檢測(cè)牛奶樣品中金黃色葡萄球菌
1、牛奶樣品前處理取lmL牛奶樣品于2mL離心管中，加入100 y L微球，在室溫下輕輕震蕩30min，離 心，棄上清，用100iiL無(wú)菌水重懸沉淀，煮沸10min，離心，取上清。
2、試劑盒檢測(cè) 取1 ii L上清加入到LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，進(jìn)行LAMP檢領(lǐng)U，同時(shí)做陰性和陽(yáng) 性對(duì)照，置于65t:水浴鍋反應(yīng)50min。
3、結(jié)果分析 取8ii LLAMP產(chǎn)物，以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠圖像分析儀上觀察擴(kuò) 增結(jié)果。(見(jiàn)圖l)。 圖中，1是DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；2是金黃色葡萄球菌基因組陽(yáng)性對(duì)照；3是無(wú)菌雙 蒸水陰性對(duì)照；4是牛奶樣品的檢測(cè)結(jié)果。
結(jié)論 反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，所得檢測(cè)結(jié)果都相同，說(shuō)明不同批次之間的檢測(cè)結(jié)果具有可 比性和良好的重復(fù)性。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其積極效果在于 利用免疫微球富集牛奶中的金黃色葡萄球菌，簡(jiǎn)單快速，并消除了牛奶中其他物 質(zhì)的影響。LAMP檢測(cè)方法實(shí)用性強(qiáng)，快速、靈敏，裝配成試劑盒使用安全，特異性好，使用步 驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，可以對(duì)牛奶樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行定性檢測(cè)，可以替代傳統(tǒng)的 牛奶中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法。


圖1牛奶樣品檢測(cè)結(jié)果圖；
圖2試劑盒特異性鑒定圖。
圖3試劑盒敏感性鑒定圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料羧基微球購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；MgCl2購(gòu)自上海生工生物工程有限公 司；Bst DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司；dNTP、rTaq酶購(gòu)自Takara公司；HiTr即 Protein A HP購(gòu)自GE公司；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25923)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品 鑒定所；鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CVCC541)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型(CVCC263)購(gòu) 自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；大腸桿菌0157:H7 (912981)由日本友人贈(zèng)送；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 (ATCC9610)、痢疾志賀氏菌由沈陽(yáng)出入境檢驗(yàn)檢疫局贈(zèng)送。
實(shí)施例1試劑盒的組成與配制
1、免疫微球 1)金黃色葡萄球菌多克隆抗體的制備 A :將經(jīng)鑒定的金黃色葡萄球菌接種到LB培養(yǎng)液中，37t:、200r/min搖床過(guò)夜培 養(yǎng)，計(jì)數(shù)，用0. 3%甲醛溶液37t:滅活24h，涂平板檢驗(yàn)無(wú)活菌后用生理鹽水洗滌兩次，最后用200iiL生理鹽水重懸，并調(diào)整其濃度為1Xl(fCFU/ml，與200iiL弗氏完全佐劑充分乳 化，作為免疫原。 B :取兩只體重lkg左右雄性健康新西蘭大白兔，取以上免疫原皮下多點(diǎn)注射。首 次免疫后間隔兩周加強(qiáng)免疫，免疫劑量1 X 1(TCFU/ml ， 200 ii L菌液與200 y L弗氏不完全佐 劑充分乳化，皮下多點(diǎn)注射，每隔兩周進(jìn)行一次，第三次免疫一周后耳靜脈采血測(cè)效價(jià)。當(dāng) 效價(jià)達(dá)到1 : 1000時(shí)加強(qiáng)免疫一次一周后心臟放血分離血清，經(jīng)HiTr即ProteinAHP純化 柱純化后，置于-2(TC保存。
2)免疫微球的制備 A :取微球原液超聲波震蕩30s，然后用去離子水洗滌一次。 B :加入羧基微球表面活化劑，室溫震蕩20min，離心洗滌一次，重懸于100 y L PBS中。 C :加入多克隆抗體，漩渦震蕩混勻，室溫震蕩2h，洗滌離心兩次，重懸于含1% BSA 的100 ii L PBS中，室溫震蕩4h，4t:過(guò)夜以阻斷微球表面未結(jié)合位點(diǎn)。
D :用洗滌液洗滌微球2次，重懸于100 ii L PBS中，4。C備用。
2、兩對(duì)引物 根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶(皿c)基因(Genbank登錄號(hào)V01281)，利用 Primer ExplorerV4設(shè)計(jì)弓l物如下
外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
內(nèi)引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3、LAMP反應(yīng)液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、 1Ommol/L氯化鉀、10mmo1/
L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0. 1 % TritonX-100、 1. 0mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4、陽(yáng)性對(duì)照液采用AxyPr印細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取金黃色葡萄球菌基 因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。 5、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。
實(shí)施例2試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn) 1、分別取經(jīng)過(guò)DNA有效性驗(yàn)證的鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、豬傳染性胸膜 肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、金黃色葡萄球菌的菌液 20ii L于離心管中，95。C加熱10min進(jìn)行熱裂解。12000rpm離心lmin，取上清。
2、分別取各種菌液上清1 ii L加入到LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，進(jìn)行LAMP檢領(lǐng)" 同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，置于65t:水浴鍋反應(yīng)50min。 3、取8 ii LLAMP產(chǎn)物，以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠圖像分析儀上觀察 擴(kuò)增結(jié)果。 結(jié)果只有金黃色葡萄球菌擴(kuò)增出來(lái)，而鼠傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、豬傳染性 胸膜肺炎放線桿菌血清5型、大腸桿菌0157:H7、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和陰性對(duì)照無(wú)條帶
7(見(jiàn)圖2)。圖中，1是DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；2是鼠傷寒沙門(mén)氏菌；3是痢疾志賀氏菌；4是豬 傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型；5是大腸桿菌0157 :H7 ;6是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；7是 無(wú)菌雙蒸水陰性對(duì)照；8是金黃色葡萄球菌。
上述結(jié)果說(shuō)明試劑盒具有良好的特異性。
實(shí)施例3試劑盒的敏感性實(shí)驗(yàn) 1、取lmL過(guò)夜培養(yǎng)的金葡菌培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋?zhuān)♂屩?0—9。每個(gè)稀釋度分 別取20iU置于PCR管中，95。C加熱10min進(jìn)行熱裂解。12000rpm離心lmin，取上清。
2、取各個(gè)稀釋度上清1 ii L加入到LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)體系中，進(jìn)行LAMP檢測(cè)，同 時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，置于65t:水浴鍋反應(yīng)50min。 3、取8 ii LLAMP產(chǎn)物，以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠圖像分析儀上觀察 擴(kuò)增結(jié)果。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出當(dāng)菌液稀釋至10—8時(shí)仍可以擴(kuò)增出，最低檢測(cè)限為50CFU/ ml (見(jiàn)圖3)。圖中，1是DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；2是金黃色葡萄球菌基因組陽(yáng)性對(duì)照；3是 無(wú)菌雙蒸水陰性對(duì)照；4-11分別是細(xì)菌濃度分別為5. 0 X 107CFU/ml 、5. 0 X 106CFU/ml 、 5. OX 105CFU/ml、5. 0 X 104CFU/ml 、5. 0 X 103CFU/ml 、5. 0 X 102CFU/ml 、 5. OX 1(^CFU/ml、 5. 0X100CFU/ml。 上述結(jié)果說(shuō)明試劑盒具有良好的敏感性。 序列表 〈110>吉林大學(xué) 〈120〉 一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒
〈210>1
〈211>966
〈212>DNA 〈213>金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)
〈220〉
〈221>gene
〈222〉 (1) (966)
〈223〉
〈400〉 1 tgtctcgata tgatagtctg
gctaaatata taagttctga
ttttattate attattaaat
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ttaagtgctg gcatatgtat
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〈212>DNA 〈213>人工合成 <220> 〈221〉引物(primer) 〈222>(1). . (45) 〈223〉 〈400>5 gaacctgcga ctttaattaa agcgatctga atgtcattgg ttgac 45
10
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的試劑盒，具體構(gòu)成如下1)免疫微球聯(lián)接金黃色葡萄球菌抗體的羧基微球；2)兩對(duì)引物為外引物F3GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT；B3GATGCTTTGTTTCAGGTGTA；內(nèi)引物FIPCTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC；BIPGAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC；3)LAMP反應(yīng)液由0.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化鉀、10mmol/L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0.1％TritonX-100、1.0mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6μmol/L、外引物F3/B3各0.2μmol/L；4)陽(yáng)性對(duì)照液金黃色葡萄球菌基因組DNA；5)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)菌雙蒸水。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟1) 免疫微球A :金黃色葡萄球菌多克隆抗體的制備將經(jīng)鑒定的金黃色葡萄球菌接種到LB培養(yǎng)液中，37t:、200r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)數(shù)， 用0. 3%甲醛溶液37t:滅活24h，涂平板檢驗(yàn)無(wú)活菌后用生理鹽水洗滌兩次，最后用200 y L 生理鹽水重懸，并調(diào)整其濃度為1 X 109CFU/ml，與200 P L弗氏完全佐劑充分乳化，作為免疫 原；取兩只體重1kg左右雄性兔，取以上免疫原皮下多點(diǎn)注射；首次免疫后間隔兩周加強(qiáng) 免疫，免疫劑量1Xl(TCFU/ml，200ii L菌液與200 y L弗氏不完全佐劑充分乳化，皮下多點(diǎn) 注射，每隔兩周進(jìn)行一次，第三次免疫一周后耳靜脈采血測(cè)效價(jià)；當(dāng)效價(jià)達(dá)到l : IOOO時(shí)加 強(qiáng)免疫一次一周后心臟放血分離血清，經(jīng)HiTr即ProteinA HP純化柱純化后，置于-2(TC保 存；B :免疫微球的制備取微球原液超聲波震蕩30s，然后用去離子水洗滌一次；加入羧基微球表面活化劑，室溫震蕩20min，離心洗滌一次，重懸于100 ii L PBS中； 加入上述制備的多克隆抗體，漩渦震蕩混勻，室溫震蕩2h，洗滌離心兩次，重懸于含 1% BSA的100 ii L PBS中，室溫震蕩4h，4。C過(guò)夜以阻斷微球表面未結(jié)合位點(diǎn)； 用洗滌液洗滌微球2次，重懸于100 L PBS中，4t:備用；2) 兩對(duì)引物根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶(皿c)基因(Genbank登錄號(hào)V01281)，利用Primer ExplorerV4設(shè)計(jì)引物如下 外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ; B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ; 內(nèi)引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ; BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ;3) LAMP反應(yīng)液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化鉀、10mmol/L硫 酸銨、8mmol/L硫酸鎂、0. 1% TritonX-lOO、 1. Omol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1. 6 ii mol/ L、外引物各0. 2iimol/L ;4) 陽(yáng)性對(duì)照液采用AxyPr印細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取金黃色葡萄球菌基因組 DNA作為陽(yáng)性對(duì)照；5) 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無(wú)菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)牛奶中金黃色葡萄球菌的方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，適用于金黃色葡萄球菌的定性檢測(cè)。本發(fā)明由免疫微球、兩對(duì)引物、DNA聚合酶、LAMP反應(yīng)液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成。本發(fā)明檢測(cè)速度快，特異性好，靈敏度高，操作步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，可以替代傳統(tǒng)的牛奶中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101701252SQ20091021788
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者馮新, 孫長(zhǎng)江, 杜崇濤, 許會(huì)會(huì), 謝芳, 雷連成, 韓文瑜 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)