本發(fā)明涉及食品分離純化領(lǐng)域，特別是指一種提純植物多糖的方法。

背景技術(shù)：

多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少要超過10個的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(c6h10o5)n表示。由相同的單糖組成的多糖稱為同多糖，如淀粉、纖維素和糖原，以不同的單糖組成的多糖稱為雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成。它是生物體內(nèi)一種重要的組成成分，常規(guī)的農(nóng)副產(chǎn)品植物資源，例如大米、馬鈴薯等，一般均含有較多的多糖（分為游離型多糖和結(jié)合型多糖），同時也含有較多的蛋白或多酚，許多多糖能與蛋白之間共價結(jié)合形成糖蛋白。有些糖蛋白的比例非常高，大部分分布在細(xì)胞膜上，具有識別功能。多酚類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基，在植物體內(nèi)能與蛋白質(zhì)、多糖或其他物質(zhì)以氫鍵和疏水鍵形式形成較為穩(wěn)定的復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有多方面的生物活性，如抗腫瘤、免疫促進(jìn)、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等。然而，要分析多糖的功能首先要獲得較純多糖樣品，去除樣品原料中的蛋白和多酚，防止其對結(jié)果進(jìn)行干擾。

常用的多糖的分離方法為水溶醇沉法，利用乙醇可以將溶液中的多糖沉淀下來，從而提純多糖。其缺點在于一方面非結(jié)合蛋白、多酚能與多糖形成共沉淀，另一方面沉淀的多糖含有部分結(jié)合蛋白，導(dǎo)致提取的多糖純度低。結(jié)合型多糖的蛋白與多糖之間的共價鍵可以采用化學(xué)裂解法切割，常用的試劑為三氟甲磺酸。

由于多酚物質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基、羥基、羧基等，具有一定的極性，在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖以氫鍵和疏水鍵形式形成穩(wěn)定的化合物，而有機(jī)溶劑具有斷裂氫鍵的作用，因此可以用乙酸乙酯、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑萃取，除去多酚。

為了盡可能多的除去蛋白和多酚，同時提高多糖的純度，需要一種有效的分離多糖的純化方法。在提純多糖之前先將糖蛋白中的蛋白與糖鏈分開，并對多酚進(jìn)行萃取，從而提高多糖純度的文獻(xiàn)還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡單，能夠制備高純度多糖的分離方法。具體為將樣品進(jìn)行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割結(jié)合多糖的多肽，采用9-芴甲氧羰基法（fmoc）或叔丁氧羰基（boc）法將游離多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物質(zhì)，達(dá)到分離提純多糖的目的。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，其具體的技術(shù)方案如下：

一種提純植物多糖的方法，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）蛋白酶解

將蛋白樣品加入蒸餾水混勻（底物濃度30~70g/l），調(diào)節(jié)ph至8~9，溫度45~55℃，加入蛋白酶底與底物比為0.5~2.5%的堿性蛋白酶，酶解時間5~12h，沸水浴滅酶10~20min，離心取上清液，凍干。

（2）糖蛋白鏈斷裂

準(zhǔn)確稱取上述絕干樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按0.3ml/mg（蛋白酶酶解物樣品）加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖2~5min使樣品溶解，于4℃下保溫30~60min，偶爾搖動，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時溶液ph約為6.0，最后對去離子水透析并冷凍干燥。

（3）分離多糖

將多肽進(jìn)行氨基端疏水性衍生化，增加與多糖的極性差異，可采用fmoc或boc法。

（3-1）fmoc衍生法：準(zhǔn)確稱取步驟（2）制備的凍干樣品，溶解于10%碳酸鈉溶液中，樣品濃度為1~5%，加入少量丙酮，在0~4℃條件下加入與樣品質(zhì)量相同的芴甲氧羰酰氯法（fmoc-cl），攪拌反應(yīng)4~12h后，冷卻，并用濃鹽酸酸化到ph至2，100ml乙酸乙酯萃取3~5次，將多酚和被保護(hù)的fmoc-多肽溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮干燥得純化的多糖。

（3-2）boc衍生法：準(zhǔn)確稱取步驟（2）制備的凍干樣品放入燒杯中，倒入樣品質(zhì)量10ml/g（凍干樣品）的水溶解，將二碳酸二叔丁酯（按照凍干樣品重量的0.5~2倍），溶解于10ml/g（凍干樣品）1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至8~9，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至2~3，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取3~5次，將多酚和被保護(hù)的boc-多肽溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮干燥得純化的多糖。

上述原料也可以為蛋白酶解產(chǎn)物、多糖粗提物，若原料的蛋白水解程度較高可以省略第一步驟。

上述三氟甲磺酸試劑可以用其他能斷裂糖肽鍵的化學(xué)試劑簡單代替。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：1、本發(fā)明在整個過程中操作要求低，設(shè)備要求簡單，特別適合少量制備高純度的多糖；2、能將樣品中的蛋白、多肽、多酚物質(zhì)去除，分離出的高純度的多糖。

下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實施例1

1、蛋白酶解：稱取干燥的大米蛋白原料21g，加入700ml蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)ph至8，溫度45℃，加入105μl的堿性蛋白酶，酶解時間5h，沸水浴滅酶10min，離心取上清液，凍干。

2、糖蛋白鏈斷裂：準(zhǔn)確稱取10g絕干蛋白酶解物樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按3ml加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖5min使樣品溶解，于4℃下保溫60min，偶爾搖動，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時溶液ph約為6.0，最后對去離子水透析并冷凍干燥。

3、分離多糖：將上述凍干樣品準(zhǔn)確稱取溶解于10%碳酸鈉溶液中，樣品濃度為5%，加入少量丙酮，在4℃條件下加入與樣品質(zhì)量相同的fmoc-cl，攪拌反應(yīng)12h后，冷卻，并用濃鹽酸酸化到ph=2，100ml乙酸乙酯萃取3次，被保護(hù)的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮得多糖產(chǎn)品4.36g。

4、多糖純度：將多糖產(chǎn)物凍干后，采用苯酚硫酸法測定多糖的含量93.64%。

實施例2

1、蛋白酶解：稱取干燥的大豆蛋白原料21g，加入300ml蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)ph至9，溫度55℃，加入525μl的堿性蛋白酶，酶解時間12h，沸水浴滅酶20min，離心取上清液，凍干。

2、糖蛋白鏈斷裂：準(zhǔn)確稱取10g絕干蛋白酶解物樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按3ml加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖5min使樣品溶解，于4℃下保溫60min，偶爾搖動，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時溶液ph約為6.0，最后對去離子水透析并冷凍干燥。

3、分離多糖：將上述凍干樣品準(zhǔn)確稱取溶解于10%碳酸鈉溶液中，樣品濃度為5%，加入少量丙酮，在4℃條件下加入與樣品質(zhì)量相同的fmoc-cl，攪拌反應(yīng)12h后，冷卻，并用濃鹽酸酸化到ph=2，100ml乙酸乙酯萃取5次，被保護(hù)的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮得多糖產(chǎn)品4.58g。

4、多糖純度：將多糖產(chǎn)物凍干后，采用苯酚硫酸法測定多糖的含量92.17%。

實施例3

1、蛋白酶解：稱取干燥的大米蛋白原料21g，加入700ml蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)ph至8，溫度45℃，加入105μl的堿性蛋白酶，酶解時間5h，沸水浴滅酶10min，離心取上清液，凍干。

2、糖蛋白鏈斷裂：準(zhǔn)確稱取10g絕干蛋白酶解物樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按3ml加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖5min使樣品溶解，于4℃下保溫60min，偶爾搖動，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時溶液ph約為6.0，最后對去離子水透析并冷凍干燥。

3、分離多糖：將上述凍干樣品準(zhǔn)確稱取9.53g放入燒杯中，倒入95.3ml水溶解，將二碳酸二叔丁酯4.765g溶解于95.3ml1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至8，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取5次，被保護(hù)的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮得多糖產(chǎn)品3.47g。

4、多糖純度：將多糖產(chǎn)物凍干后，采用苯酚硫酸法測定多糖的含量為87.46%。

實施例4

1、蛋白酶解：稱取干燥的大豆蛋白原料21g，加入300ml蒸餾水混勻，調(diào)節(jié)ph至9，溫度55℃，加入525μl的堿性蛋白酶，酶解時間12h，沸水浴滅酶20min，離心取上清液，凍干。

2、糖蛋白鏈斷裂：準(zhǔn)確稱取10g絕干蛋白酶解物樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按3ml加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖5min使樣品溶解，于4℃下保溫60min，偶爾搖動，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時溶液ph約為6.0，最后對去離子水透析并冷凍干燥。

3、分離多糖：將上述凍干樣品9.24g準(zhǔn)確稱取放入燒杯中，倒入92.4ml水溶解，將二碳酸二叔丁酯18.48g溶解于92.4ml1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至9，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至3，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取5次，被保護(hù)的蛋白和多酚溶于乙酸乙酯中，將水相過濾，經(jīng)500da透析袋透析，去除小分子鹽等雜質(zhì)，濃縮得多糖產(chǎn)品3.68g。

4、多糖純度：將多糖產(chǎn)物凍干后，采用苯酚硫酸法測定多糖的含量為89.28%。