本發(fā)明涉及生物技術(shù)研究領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)效干擾素及其制備方法。

背景技術(shù)：

干擾素是病毒病的有效治療藥物和腫瘤的輔助治療藥物。現(xiàn)有重組干擾素多為大腸桿菌表達(dá)的組氨酸標(biāo)簽融合蛋白，需要用親和柱純化。親和柱不僅價(jià)格較貴，而且難以規(guī)?；苽?。類彈性蛋白多肽(elastin-likepolypeptide,elp)是根據(jù)彈性蛋白重復(fù)序列合成的聚合分子，具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于相變溫度溶液中呈可溶狀態(tài)，在高于相變溫度溶液中呈凝聚狀態(tài)。因此，elp融合蛋白不僅可在特定溫度下用簡(jiǎn)單的離心法進(jìn)行分離純化，而且純化效率與親和層析法相當(dāng)。

由于分子量較小(15kda左右)和易被體內(nèi)清除，干擾素的半衰期較短，治療慢性疾病時(shí)需要反復(fù)注射。延長(zhǎng)干擾素半衰期的策略主要有聚乙二醇化和與血清白蛋白等融合。其中，聚乙二醇化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，但反應(yīng)程度較難控制，不僅影響干擾素活性，而且有一定的副作用；血清白蛋白融合干擾素的活性穩(wěn)定，但純化程序較復(fù)雜、成本較高。鏈球菌g蛋白(spg)是免疫球蛋白igg結(jié)合蛋白，其igg結(jié)合區(qū)含c1、c2和c3結(jié)構(gòu)域，其中c2結(jié)構(gòu)域足以與人和多種動(dòng)物的igg結(jié)合。因此，spgc2結(jié)構(gòu)域融合干擾素可通過與igg結(jié)合而增大分子量、延長(zhǎng)半衰期。

多數(shù)重組蛋白均需切除融合標(biāo)簽后才有生物活性，常用的策略是先向目的蛋白引入蛋白酶切位點(diǎn)，在純化獲得重組蛋白后，再用煙草蝕紋病毒蛋白酶(tevp)等切除融合標(biāo)簽。這種策略不僅需要價(jià)格昂貴的蛋白酶，還需用額外的親和層析等步驟去除蛋白酶。

本發(fā)明將干擾素與elp、肝片吸蟲fh8蛋白和spgc2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合表達(dá)，用tevp活性包涵體切割elp-fh8融合標(biāo)簽，獲得的ifn-c2融合干擾素能通過與igg結(jié)合而延長(zhǎng)半衰期。盡管這種策略在理論上是可以想得到的，但在設(shè)計(jì)時(shí)面臨以下具體問題：此融合蛋白能否在大腸桿菌中高效表達(dá)？其分離純化和標(biāo)簽切除的最佳條件是什么？ifn-c2融合干擾素能否與igg結(jié)合？其生物活性及半衰期如何？

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)效干擾素制備方法。

本發(fā)明的長(zhǎng)效干擾素由干擾素與spgc2結(jié)構(gòu)域組成，經(jīng)體外結(jié)合證明能與人和多種動(dòng)物igg結(jié)合，經(jīng)血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)證明半衰期顯著延長(zhǎng)。

本發(fā)明所述的長(zhǎng)效干擾素，用下列方法制備：

(1)將肝片吸蟲fh8蛋白編碼序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子序列，將合成序列插入類彈性蛋白多肽(elp)融合表達(dá)載體，獲得pelp-fh8載體；

(2)將spgc2結(jié)構(gòu)域編碼序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子序列，將合成序列插入pelp-fh8載體，獲得pelp-fh8-c2載體；

(3)將干擾素成熟肽編碼序列優(yōu)化成大腸桿菌密碼子序列，5'端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶(tevp)識(shí)別位點(diǎn)，將合成序列插入pelp-fh8-c2載體，獲得重組載體pelp-fh8-ifn-c2；

(4)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在低溫用iptg誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；

(5)在優(yōu)化條件下，用溫度敏感的相變循環(huán)純化融合蛋白；

(6)用tevp活性包涵體消化elp-fh8-ifn-c2融合蛋白，用離心法去除tevp活性包涵體；

(7)用相變循環(huán)去除elp-fh8標(biāo)簽，用低濃度尿素溶解ifn-c2融合干擾素。

優(yōu)選地，步驟(1)中fh8編碼序列為大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列如seqidno.1所示；步驟(2)中spgc2編碼序列為大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列如seqidno.4所示；步驟(3)中干擾素肽編碼序列為大腸桿菌密碼子優(yōu)化序列如seqidno.7所示；步驟(5)中所述優(yōu)化條件是裂解重組菌蛋白濃度為10mg/ml，相變溫度為28℃，孵育時(shí)間為10min，初次相變循環(huán)氯化鈉濃度為3m，再次相變循環(huán)氯化鈉濃度為2.5m，12000g室溫5min。

用免疫印跡法檢測(cè)本發(fā)明制得的ifn-c2融合干擾素與免疫球蛋白結(jié)合，用病變抑制法測(cè)定融合干擾素的抗病毒活性，用血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定融合干擾素的半衰期。實(shí)驗(yàn)表明ifn-c2融合干擾素能與人和動(dòng)物igg結(jié)合，半衰期顯著延長(zhǎng)。

與其他方法相比，本發(fā)明的長(zhǎng)效干擾素制備方法具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合人和動(dòng)物長(zhǎng)效干擾素的制備。

附圖說明

圖1.長(zhǎng)效干擾素表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。pt7代表t7啟動(dòng)子；elp、fh8、ifna和spgc2分別代表類彈性蛋白多肽、fh8蛋白、干擾素和spgc2結(jié)構(gòu)域編碼序列。

圖2.融合蛋白的純化及電泳分析。m代表蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為未純化重組菌裂解液；2為初次相變循環(huán)純化產(chǎn)物；3為再次相變循環(huán)純化產(chǎn)物。

圖3.融合干擾素的標(biāo)簽切除與回收。m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為tevp酶切產(chǎn)物；2為離心上清；3為回收的poifnα-c2融合干擾素。

圖4.融合干擾素的免疫球蛋白親和性檢測(cè)。m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-7分別為豬、牛、鼠、羊、兔、人、鴨的igg。

具體實(shí)施方式

生物材料：

1.pet-elp載體：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(文獻(xiàn)：wen-junliu,qianwu,bixu,xin-yuzhang,xiao-lixia,huai-changsun.single-steppurificationofrecombinantproteinsusingelastin-likepeptide-mediatedinversetransitioncyclingandself-processingmodulefromneisseriameningitidesfrpc.proteinexpressionandpurification,2014,98:18-24)。

2.dh5α大腸桿菌：從美國(guó)bdbiosciencesclontech公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

3.bl21(de3)大腸桿菌：從美國(guó)novagen公司引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

4.mdbk細(xì)胞：從美國(guó)atcc引進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

5.水泡性口炎病毒(vsv)：由本實(shí)驗(yàn)室保存(文獻(xiàn)：徐耀先，周曉峰，劉立德.分子病毒學(xué).武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2000.300-302)。

6、puc57載體：購(gòu)于金斯瑞生物科技(南京)有限公司。

具體實(shí)施步驟如下：

1.表達(dá)載體構(gòu)建

(1)用javacodonadaptiontool(文獻(xiàn)：grotea,hillerk,scheerm,münchrb,hempeldc,jahnd.jcat:anoveltooltoadaptcodonusageofatargetgenetoitspotentialexpressionhost.nucleicacidsresearch,2005，1:33)，將肝片吸蟲fh8蛋白編碼序列(genbankaf213970)優(yōu)化為大腸桿菌(k12株)密碼子序列(seqidno.1)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，插入puc57載體。

5-catatgccgtctgttcaggaagttgaaaaactgctgcacgttctggaccgtaacggtgacggtaaagtttctgctgaagaactgaaagctttcgctgacgactctaaatgcccgctggactctaacaaaatcaaagctttcatcaaagaacacgacaaaaacaaagacggtaaactggacctgaaagaactggtttctatcctgtcttctgcagatct-3(seqidno.1)

(2)根據(jù)fh8編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，正向引物引入saci酶切位點(diǎn)，反向引物引入sali酶切位點(diǎn)。

正向引物：5-gagctcaccgtctgttcaggaagttg-3(seqidno.2)；

反向引物：5-gtcgacgcagaagacaggatagaaac-3(seqidno.3)。

(3)以含fh8編碼序列puc57為模板，按照rtaqdnapolymerase(takara公司)說明書進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃/4min；94℃/45s，65℃/30s，72℃/1min，30次循環(huán)；72℃/10min；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶saci和sali消化后，插入pet-elp載體，獲得pelp-fh8載體。

(4)用javacodonadaptiontool將spgc2編碼序列(genbank：x06173)優(yōu)化為大腸桿菌(k12株)密碼子序列(seqidno.4)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，插入puc57載體。

5-acctacaaactggttatcaacggtaaaaccctgaaaggtgaaaccaccaccgaagctgttgacgctgctaccgctgaaaaagttttcaaacagtacgctaacgacaacggtgttgacggtgaatggacctacgacgacgctaccaaaaccttcaccgttaccgaataa-3(seqidno.4)。

(5)根據(jù)spgc2編碼序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物引入noti酶切位點(diǎn)，下游引物引入taa終止碼和xhoi酶切位點(diǎn)。

正向引物：5-gcggccgcggatccacctacaaactggttatcaac-3(seqidno.5)；

反向引物：5-ctcgagttattcggtaacg-3(seqidno.6)。

(6)以含spgc2編碼序列puc57為模板，用rtaqdnapolymerase進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)程序同前；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶noti和xhoi消化后，插入pelp-fh8載體，獲得pelp-fh8-c2載體。

(7)用javacodonadaptiontool將豬α干擾素(poifn-α)編碼序列(genbankay345969)優(yōu)化為大腸桿菌(k12株)密碼子序列(seqidno.7)，序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，克隆在puc57載體中。

5-tgcgacctgccgcagacccactctctggctcacacccgtgctctgcgtctgctggctcagatgcgtcgtatctctccgttctcttgcctggaccaccgtcgtgacttcggttctccgcacgaagctttcggtggtaaccaggttcagaaagctcaggctatggctctggttcacgaaatgctgcagcagaccttccagctgttctctaccgaaggttctgctgctgcttgggacgaatctctgctgcaccagttctgcaccggtctggaccagcagctgcgtgacctggaagcttgcgttatgcaggaagctggtctggaaggtaccccgctgctggaagaagactctatcctggctgttcgtaaatacttccaccgtctgaccctgtacctgcaggaaaaatcttactctccgtgcgcttgggaaatcgttcgtgctgaagttatgcgttctttctcttcttctcgtaacctgcaggaccgtctgcgtaaaaaagaaggcgcgccgggatcc-3(seqidno.7)。

(8)根據(jù)poifn-α編碼序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物引入sali酶切位點(diǎn)和tevp識(shí)別位點(diǎn)，下游引物引入bamhi酶切位點(diǎn)。

正向引物：5-gtcgacagaaaacctgtacttccagggttgcgacctgccgcagac-3(seqidno.8)；

反向引物：5-ggatcccggcgcgccttc-3(seqidno.9)。

(9)以含poifn-α編碼序列puc57為模板，用rtaqdnapolymerase進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)程序同前；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制酶sali和bamhi消化后，插入pelp-fh8-c2載體，獲得重組載體pelp-fh8-poifnα-c2，如圖1所示。

2.融合蛋白表達(dá)與純化

(1)將pelp-fh8-poifnα-c2轉(zhuǎn)化bl21(de3)大腸桿菌，挑取單菌落接種卡那霉素(50μg/ml)lb培養(yǎng)基，37℃、220rpm培養(yǎng)過夜；按1:100接種卡那霉素2×yt培養(yǎng)液(tryptone16g，yeastextract10g，nacl5g，ph7.2)，37℃、220rpm培養(yǎng)至od600＝0.6，加入0.2mmiptg，分別在20、24、28、37℃誘導(dǎo)表達(dá)6h。電泳分析結(jié)果顯示：37℃誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物約50％為可溶性蛋白，20℃誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物＞90％為可溶性蛋白。

(2)將重組菌在20℃、0.2mmiptg誘導(dǎo)24h，4℃、5000g離心10min，沉淀菌體用裂解液(50mmtris-hcl，50mmnacl，5％glycerol，ph7.2)懸浮，超聲波充分裂解(40w，10s，停20s，5min)，4℃、12000g離心10min；離心上清用pbs調(diào)蛋白濃度為10mg/ml，加入3m氯化鈉，28℃孵育10min，室溫12000g離心5min。sds-page分析顯示：第一輪相變循環(huán)純化的elp-fh8-poifnα-c2融合蛋白的純度約為80％。用pbs溶解初次純化產(chǎn)物，加入2.5m氯化鈉，28℃孵育10min，室溫12000g離心5min；沉淀用預(yù)冷pbs溶解，冰浴30min，4℃、12000g離心5min。sds-page分析顯示：再次相變循環(huán)純化的elp-fh8-poifnα-c2融合蛋白的純度為95％(圖2)。

3.純化標(biāo)簽切除與融合干擾素獲得

(1)按li等方法(文獻(xiàn):ligy,xiaozz,luhp,liyy,zhouxh,tanx,zhangxy,xiaxl,sunhc.asimplemethodforrecombinantproteinpurificationusingself-assemblingpeptide-taggedtobaccoetchvirusprotease.proteinexpressionandpurification,2016,128:86-92)制備tevp活性包涵體。將pp16p-tevp重組菌接種100毫升卡那霉素2×yt培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至od600＝0.8，加入0.2mmiptg，20℃、180rpm誘導(dǎo)表達(dá)18h；離心收集菌體，超聲波裂解，4℃、6000g離心10min；沉淀的活性包涵體用0.5％tritonx-100菌體裂解液離心洗滌2次，用tevp反應(yīng)液離心洗滌1次。

(2)將50μl純化elp-fh8-poifnα-c2融合蛋白與15μltevp活性包涵體(1mg/ml)混合，30℃孵育6h；4℃、12000g離心10min，棄沉淀(tevp活性包涵體)。

(3)離心上清液加1m氯化鈉，12000g離心5min，棄上清(含elp-fh8標(biāo)簽)；沉淀用3m尿素溶解，依次針對(duì)2m尿素和pbs透析4h，4℃、12000g離心5min，吸取上清液。電泳分析結(jié)果顯示：poifnα-c2融合干擾素的純度約為80％(圖3)。

4.融合干擾素結(jié)合igg檢測(cè)

將poifnα-c2融合干擾素進(jìn)行sds-page電泳分離，用轉(zhuǎn)印儀將分離蛋白轉(zhuǎn)移(80v1h)到硝酸纖維素膜，用5％脫脂乳粉pbst(含0.01％tween20的pbs)37℃封閉1h，pbst洗膜3次；分別加入1：1000稀釋igg或辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記igg(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h，pbst洗滌3次；hrp標(biāo)記igg反應(yīng)組經(jīng)化學(xué)發(fā)光染色后直接進(jìn)行信號(hào)掃描，未標(biāo)記igg反應(yīng)組加入1：5000稀釋hrp標(biāo)記spa(上海生工生物工程有限公司)，37℃孵育1h，pbst洗滌3次，然后進(jìn)行信號(hào)掃描。結(jié)果顯示：poifnα-c2融合干擾素能與豬、牛、鼠、羊、兔和人igg結(jié)合(圖4)。

5.融合干擾素活性檢測(cè)

poifnα-c2融合干擾素活性按文獻(xiàn)測(cè)定(文獻(xiàn)：lafleurdw,nardellib,tsarevat,matherd,fengp,semenukm,taylork,buerginm,chincillad,roschkev,etal.interferon-κ,anoveltypeiifnexpressedinhumankeratinocytes.jbiolchem，2001，276:39765–39772)。在96孔板分別培養(yǎng)mdbk細(xì)胞、pk-15細(xì)胞和marc-145細(xì)胞，10⁴個(gè)/孔，37℃、5％co2培養(yǎng)至細(xì)胞單層；用2％胎牛血清(fbs)dmem培養(yǎng)液稀釋poifnα-c2融合干擾素，加入培養(yǎng)板各孔，100μl/孔，每稀釋度設(shè)3孔重復(fù)，37℃、5％co2培養(yǎng)過夜；每孔加100μl(100tcid50)水泡性口炎病毒(vsv)、豬偽狂犬病病毒(prv)或豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)，設(shè)不加干擾素、不加病毒陰性對(duì)照，不加干擾素、加病毒陽(yáng)性對(duì)照和加干擾素、不加病毒空白對(duì)照，37℃、5％co2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變；在陽(yáng)性對(duì)照孔90％以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，每孔加100μl0.5％結(jié)晶紫(溶于20％乙醇)染色液，用1％醋酸抽提后，用酶標(biāo)儀讀取各孔的od570nm值，將抑制半數(shù)細(xì)胞病變的干擾素最高稀釋度定為1個(gè)活性單位(u)。結(jié)果顯示：poifnα-c2融合干擾素在mdbk和pk-15細(xì)胞上抗vsv活性分別為2.3×10⁴u/mg和9.1×10⁴u/mg蛋白，在pk-15細(xì)胞上抗prv活性為2.8×10⁵u/mg蛋白，在marc-145細(xì)胞上抗prrsv活性為2.1×10⁵u/mg蛋白。

6.融合干擾素血漿穩(wěn)定性檢測(cè)

干擾素血漿穩(wěn)定性檢測(cè)參考進(jìn)行(文獻(xiàn)：shuotian,qinshanli,wenbinyao,chenxu.constructionandcharacterizationofapotent,long-lastingrecombinanthumanserumalbumin-interferona1fusionproteinexpressedinpichiapastoris.proteinexpressionandpurification，2013,90:124-128)。從健康豬采集枸櫞酸鈉抗凝血，高速離心5min取血漿；用pbs稀釋成50％血漿，分別加入poifnα-c2融合干擾素(10μg/ml)和商品化白細(xì)胞干擾素(四川世紅生物科技有限公司)，37℃孵育24h，分別在0、0.5、1.0、3.0、6.0、12和24h，各取100μl進(jìn)行干擾素活性檢測(cè)，方法同前。結(jié)果顯示：白細(xì)胞干擾素活性下降50％的時(shí)間為12h，poifnα-c2融合干擾素活性下降50％的時(shí)間＞24h。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>一種長(zhǎng)效干擾素及其制備方法

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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ggtaaagtttctgctgaagaactgaaagctttcgctgacgactctaaatgcccgctggac120

tctaacaaaatcaaagctttcatcaaagaacacgacaaaaacaaagacggtaaactggac180

ctgaaagaactggtttctatcctgtcttctgcagatct218

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gaagctttcggtggtaaccaggttcagaaagctcaggctatggctctggttcacgaaatg180

ctgcagcagaccttccagctgttctctaccgaaggttctgctgctgcttgggacgaatct240

ctgctgcaccagttctgcaccggtctggaccagcagctgcgtgacctggaagcttgcgtt300

atgcaggaagctggtctggaaggtaccccgctgctggaagaagactctatcctggctgtt360

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