一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like）基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，涉及長牡蠣CgIFN-like基因體外重組表達技術(shù)及其功能鑒定。本發(fā)明利用體外重組表達技術(shù)獲得了長牡蠣類干擾素重組蛋白，發(fā)現(xiàn)長牡蠣CgIFN-like基因體外重組蛋白可以激活牡蠣的免疫系統(tǒng)，引起細胞凋亡，同時也可以促進細胞對燦爛弧菌的吞噬功能，以及抑制人肺癌細胞A549增殖的功能。利用本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于新型免疫增強劑的開發(fā)，以及海洋天然抗癌藥物的開發(fā)和利用。
【專利說明】-種長牡蠣類干擾素（CgIFN-l ike)基因重組蛋白及其制 備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like) 基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（IFN)是機體細胞在病毒感染，或者受核酸、細菌內(nèi)毒素、促細胞分裂素等 的作用下，由受體細胞分泌的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤、免 疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。干擾素系統(tǒng)是先天性免疫系統(tǒng)抵抗病毒感染的主要構(gòu)成者，包括分 泌合成干擾素的細胞系統(tǒng)以及接受干擾素作用的細胞系統(tǒng)，即指所有經(jīng)病毒感染等外部刺 激后能激活干擾素合成的細胞以及對干擾素的作用發(fā)生反應(yīng)并建立抗病毒狀態(tài)的細胞，是 機體對抗病毒感染的一道重要防御系統(tǒng)，它與細胞免疫、體液免疫及其他非特異性免疫協(xié) 同作用抵抗病毒的侵染。干擾素自發(fā)現(xiàn)以來引起了人們極大的興趣，一直是病毒學(xué)、細胞 學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)學(xué)科的研究熱點。但由于來源限制，無法 得到廣泛應(yīng)用，直到1986年，基因工程干擾素的出現(xiàn)，才使得干擾素能夠大量應(yīng)用于臨床， 干擾素的產(chǎn)生可以激活細胞的免疫防御系統(tǒng)從而清除病原體或者腫瘤。
[0003] 牡蠣是一種含有較高活性物質(zhì)的海洋經(jīng)濟貝類，含有豐富的氨基酸、多糖、蛋白 質(zhì)、?；撬帷⑽⒘吭氐壬锘钚晕镔|(zhì)，具有很高的藥用價值，而且作為低等無脊椎動物的 代表，特殊的進化地位，值得人們對其進行研究開發(fā)。
[0004] 目前，干擾素系統(tǒng)在哺乳動物及魚類中已經(jīng)得到了較深入的研究，但是在軟體動 物中干擾素系統(tǒng)研究較少，因此對長牡蠣干擾素的研究有利于軟體動物中干擾素的開發(fā)和 利用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的在于提供一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白及其制備和 應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白，CgIFN-like基因重組蛋白為 序列表SEQ ID NO. 1中氣基酸序列所不。
[0007] 所述的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白的制備方法
[0008] (1)以長牡蠣CgIFN-like編碼區(qū)為模板，采用P1和P2引物進行PCR擴增，待用；
[0009] (2)PCR擴增產(chǎn)物與將pET-30a(+)載體通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組 子；
[0010] (3)將上述構(gòu)建重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)表達菌株中進行誘導(dǎo)培 養(yǎng)，然后利用親和層析化蛋白，即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白 rCgIFN-like ；
[0011] 所述引物P1和P2分別為：
[0012] PI :5, -CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT-3，
[0013] P2 :5 ' -CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC-3 '。
[0014] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列編碼CgIFN-like體外重組的蛋白可用于 制備免疫增強劑。
[0015] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列編碼CgIFN-like體外重組的蛋白可用于 制備抗癌的藥物。本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0016] 本發(fā)明利用體外重組表達技術(shù)獲得了長牡蠣類干擾素蛋白，該重組蛋白可以激活 長牡蠣的細胞免疫系統(tǒng)引起細胞凋亡，同時也可以促進血細胞對燦爛弧菌的吞噬能力，并 能抑制人肺癌細胞A549的增殖，作為一種有效的細胞免疫調(diào)節(jié)劑和增強劑，在開發(fā)廣譜抗 菌類藥物、新型免疫制劑和飼料添加劑以及新型的海洋抗腫瘤天然活性產(chǎn)物等方面具有潛 在應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白促進細 胞凋亡的作用圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白增強血 細胞對燦爛弧菌的吞噬功能圖。
[0019] 圖3為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白抑制小 鼠成纖維細胞L929 (a)和人肺癌細胞A549 (b)的增殖作用圖。
[0020] 其中，圖3a中，rCgIFN :牡蠣重組蛋白；HIFN :商品化人重組干擾素蛋白；L929 :小 鼠成纖維細胞，在rCgIFN和HIFN處理12, 24,48, 72h后，L929細胞的活力；
[0021] 圖3b中rCgIFN :牡蠣重組蛋白；HIFN :商品化人重組干擾素蛋；A549 :人肺癌細 胞，在rCgIFN和HIFN處理12, 24, 36,48, 72h后，A549細胞的活力。

【具體實施方式】
[0022] 下面的實驗例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0023] 實施例1 :長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因編碼區(qū)的體外原核重組表達，包括 下列步驟：
[0024] 1.重組載體的構(gòu)建
[0025] 本發(fā)明中采用的重組載體為pET_30a(+)原核表達載體。通過PCR技術(shù)，使用基因 特異性引物：
[0026] Pl(5, -CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT-3,）；
[0027] P2 (5, -CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC-3'），
[0028] 反應(yīng)條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進入下列循環(huán)：94°C變性30秒，52°C退 火30秒，72°C延伸30秒，共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收， 雙酶切后與pET-30a(+)載體連接。轉(zhuǎn)化，菌落PCR篩選并測序，提取陽性克隆質(zhì)粒，完成載 體的構(gòu)建。
[0029] 2.重組蛋白的表達
[0030] 以大腸桿菌Transetta(DE3)為重組表達菌株，將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到表 達宿主菌中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測序驗證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于5ml LB液 體卡那培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時，然后以1 :100的比例接種200mL LB液 體卡那培養(yǎng)基中，37°C，220轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7。加入IPTG，使終濃度達到ImM ml/1，25°C，150 轉(zhuǎn)，培養(yǎng) 20-24h。4°C，12000rcf，離心 lOmin，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆谩?取lmL菌液離心，棄去上清后，加入80yL水和20yL5X蛋白上樣緩沖液，10(TC沸水煮沸 10分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物。
[0031] 3.重組蛋白的純化
[0032] 將上述所得蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了可溶性重組蛋白，具體操作步 驟如下：
[0033] 鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標簽的重組蛋白
[0034] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1. 6 X 20cm，柱床體積為10mL ;
[0035] (2)用緩沖液 1 (1. 482g I^NaHfCV 14. 5g L^^HPOp 17. 532g L-1NaCl，平衡 2-5 個 床體積，流速為2mL mirT1 ;
[0036] ⑶將 2〇ml 細胞破碎液（5〇mM PBS，pHL 4,0· 3M NaCl) 0· 45 μ m 濾膜過濾，上樣， 流速為lmL mirT1 ;
[0037] (4)用緩沖液1再洗2-5個床體積，流速為2mL mirT1 ;
[0038] (5)用20mM咪唑的緩沖液3進行洗脫，洗去雜蛋白，流速為2mL mirT1 ;
[0039] (6)用400mM咪唑的緩沖液3進行洗脫，流速為lmL mirT1，收集洗脫峰，用 SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達；
[0040] (7)用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2mL mirT 1，柱子置于4°C環(huán)境中保存。通過親和層系純化的蛋白用水透析，每次在4°C透析12h， 即得到SEQ ID NO. 1所示的長牡蠣CgINF-like基因重組蛋白。
[0041] SEQ ID NO. 1
[0042] MERKKDKKVLKSKTLPPRKTYPAEFDDFDFFSSTDSSTDWEDVLEKKIEDLSRQLTNEKQQHRKEKQQV AKLQRELARAKSDSQKFLTVSVNLERKLMT
[0043] 長度：100個氨基酸
[0044] 類型：氨基酸
[0045] 鏈型：單鏈
[0046] 特性：分子量為11. 3kDa，等電點為9. 49，
[0047] 來源：長牡蠣
[0048] 實施例2 :長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)原核重組蛋白促進細胞凋亡和細胞吞噬 的功能分析
[0049] (1)將上述重組蛋白用海水稀釋不同的濃度：10ug/ml，lug/ml，100ng/ml，用海水 作為對照組，每只牡蠣注射l〇ul
[0050] (2)分別在Oh, 3h，6h，12h，取血細胞，離心后，用L-15 (gibco)培養(yǎng)基沖懸，為了維 持滲透壓的平衡，在培養(yǎng)基中加入終濃度：KC1 (0. 54g/L)，NaCl (20. 2g/L)，CaCl2(0. 6g/L)， MaCl2(3. 9g/L)，MaS04(lg/L)，glucose(20. 8g/L)，根據(jù)碧云天Annexin V-FITC檢測試劑盒， 用流式細胞儀檢測重組蛋白激活的免疫系統(tǒng)相關(guān)指標。
[0051] (3)實驗結(jié)果如圖1和圖2所示。
[0052] 凋亡作用由圖1所示：
[0053] 高濃度的CgIFN-like處理后，血細胞在3h時凋亡率升高到最高，然后隨著時間的 延長，凋亡率下降；中濃度的CgIFN-like處理后，血細胞在6h時凋亡率最高，之后下降，而 且中濃度組的凋亡率高于高濃度組；低濃度的CgIFN-like處理后，血細胞在12h凋亡率最 商。
[0054] 因為細胞表面的受體有限，干擾素濃度過高時，細胞表面的受體已經(jīng)飽和，升高濃 度并不能引起凋亡率升高，所以中濃度組的凋亡率高于高濃度組，存在濃度和時間的劑量 效應(yīng)關(guān)系。
[0055] 吞噬作用：在長牡蠣注射重組蛋白rCgIFN-like后011，311，611，1211，收集血細胞，將 上述收集的血細胞和FITC標記的燦爛弧菌孵育lh后，用流式細胞儀檢測。由圖2可知：
[0056] 高濃度的CgIFN-like孵育后，長牡蠣血細胞吞噬燦爛弧菌的吞噬率在3h時開 始升高，隨著時間的延長，吞噬率開始下降；中濃度的CgIFN-like孵育后，長牡蠣血細胞 在3h，6h，12h吞噬率上升，在12h達到最高，且中濃度組的吞噬率高于高濃度組；低濃度的 CgIFN-like孵育后，長牡蠣血細胞在6h，12h吞噬率升高；CgIFN-like可以激活長牡蠣的免 疫系統(tǒng)，促進機體對病原菌的清除。
[0057] 實施例3 :長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)原核重組蛋白對L929和A549細胞增殖 抑制功能的分析
[0058] (1)人肺癌細胞A549培養(yǎng)于含10% (體積比）胎牛血清的1640培養(yǎng)基，小鼠成纖 維細胞（L929)培養(yǎng)于含10% (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為置37°C， 5 % C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞用于試驗。
[0059] (2)將上述細胞分別以5 X 103_1 X 104/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，100ul/ 孔，置5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12-24h，待細胞貼壁后，更換各自的培養(yǎng)基。
[0060] (3)向上述細胞的培養(yǎng)孔中加入重組干擾素（rCgIFN-like)重組蛋白與細胞孵 育，干擾素（rCgIFN-like)重組蛋白設(shè)置的劑量濃度為100ng/ml，10ng/ml，lng/ml，每個劑 量組設(shè)6個復(fù)孔，空白對照只加各自的培養(yǎng)基，對照組不加 CgIFN-1 ike重組蛋白。
[0061] (4)同時用商品化的人的重組干擾素 IFNa-2a作為比較，設(shè)同樣的三個濃度 100ng/ml，10ng/ml，lng/ml，每個劑量組設(shè)6個復(fù)孔，空白對照只加培養(yǎng)基，對照組不加人 的重組干擾素 IFN a -2a重組蛋白。
[0062] (5)在孵育12h，24h，36h，48h，72h后。用cck8試劑盒檢測細胞的增殖情況。
[0063] L929細胞為小鼠成纖維細胞，是正常細胞系，用作對照組，因為向培養(yǎng)的細胞中加 入任何非細胞成分，都可能抑制細胞的增殖，所以用正常細胞作為對照，來說明牡蠣類干擾 素抑制癌細胞增殖的藥效和特異性，同時用人的重組干擾素（商品化的）作為對照，進一步 說明牡蠣干擾素的抗癌療效（參見圖3)。
[0064] 由圖3可知：L929(圖3a)細胞系：牡蠣類干擾素對其抑制率為7%，人的重組干 擾素為11% ;A549(圖3b)細胞系：人的肺癌細胞系，實驗組，在36h和48h，牡蠣類干擾素 對其抑制率最大達到31 %，而商品化的人的重組干擾素的最大抑制率為43%。本實驗通過 L929和人的干擾素作為對照，說明了牡蠣的干擾素具有抑制癌細胞增殖的功能。
[0001] SEQUENCE LISTING <110 中國科學(xué)院海洋研究所 <120 一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用 <130 <160 3 <170-> PaLentln version 3, 1 <210, 1 <211 99 <212 PRT <213 長牡蠣 <220 <221 PRT <222 ⑴..（99) <223 <400 1 Met Glu Arg Lys Lys Asp Lys Lys \ral Leu Lys ber Lys Thr Leu Pro 1 5 10 15 Pro Arg Thr Tvr Pro Ala Glu Phe Asp Asp Phe Asp Phe Phe Ser 20 ' 25 30 Ser Thr Asp Ser Ser Thr Asp Trp Glu Asp Val Leu Glu Lvs Lys lie 35 40 45 ' Glu Asp Leu Ser Arg Gin Leu Thr Asn Glu Lys Gin Gin His Arg Lvs 50 55 60 ' Glu Lys Gin Gla VaL Ala Lvs Leu Gin Arg Glu Leu Ala Arg Ala Lts 65 70 ' 75 80 Ser Asp Ser Gin Lvs Phe Leu Thr Val Ser Val Asn Leu Gla Arg Lvs 85 90 95 Leu Met Thr <210> 2
[0002] <211 26 <212/ DNA <213 人工設(shè)計 <220 <221 DNA <222 (1),. (26) <223 <400 2 cgggatccat ggagaggaaa aaggat 26 <210 3 <211 30 <212 DNA <213 人工設(shè)計 <220 <221 DNA <222 (1),. (30) <223 <400> 3 cccaagcttc taagtcatta attttctttc 30
【權(quán)利要求】
1. 一種長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白，其特征在于：CgIFN-like基因重 組蛋白為序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白的制備方 法，其特征在于 ： (1) 以長牡蠣CgIFN-like編碼區(qū)為模板，采用P1和P2引物進行PCR擴增，待用； (2) PCR擴增產(chǎn)物與將pET-30a(+)載體通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組子； (3) 將上述構(gòu)建重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)表達菌株中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 然后利用親和層析化蛋白，即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白 rCgIFN-like ； 所述引物P1和P2分別為： P1 :5' -CGGGATCCATGGAGAGGAAAAAGGAT-3' P2 :5' -CCCAAGCTTCTAAGTCATTAATTTTCTTTC-3'。
3. -種按權(quán)利要求1所述的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白的應(yīng)用，其特 征在于：所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列編碼CgIFN-like體外重組的蛋白可用于制 備免疫增強劑。
4. 一種按權(quán)利要求1所述的長牡蠣類干擾素（CgIFN-like)基因重組蛋白的應(yīng)用，其特 征在于：所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列編碼CgIFN-like體外重組的蛋白可用于制 備抗癌的藥物。
【文檔編號】C12N15/70GK104086643SQ201410294514
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】宋林生, 張冉, 王玲玲, 張峘, 劉瑞 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所