一種定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于糖醛酸多糖檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)構(gòu)中的重復(fù)二糖是由一個(gè)糖醛酸與一個(gè)氨基己糖或己糖組成的多糖廣泛存在 于自然界中。如糖胺聚糖中的肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等，都是由糖醛酸與氨基己糖連 接而成的重復(fù)二糖片段構(gòu)成。另外，在一些貝類等生物中還發(fā)現(xiàn)了含有糖醛酸與己糖連接 而成的重復(fù)二糖片段的多糖，如鮑魚(yú)性腺多糖AGSP等。由于具有顯著的功能活性，一些含糖 醛酸多糖被開(kāi)發(fā)為藥品和保健品等。如硫酸軟骨素能有效預(yù)防關(guān)節(jié)炎，還具有抗癌、抗HIV、 降血脂、抗凝血等功效，被開(kāi)發(fā)為藥品、保健食品、化妝品等;肝素被開(kāi)發(fā)為抗凝血藥物，在 臨床上應(yīng)用廣泛;透明質(zhì)酸由于強(qiáng)持水性等性能，應(yīng)用于臨床治療、診斷、化妝品基質(zhì)以及 營(yíng)養(yǎng)保健品等。另外，還有一些食物中含糖醛酸多糖被證實(shí)具有增強(qiáng)免疫等生物活性，是重 要的功效成分。因此，定量檢測(cè)這些含糖醛酸多糖是相關(guān)藥品、保健品、化妝品等產(chǎn)品質(zhì)量 控制的必要措施，也是對(duì)含這類多糖的食品質(zhì)量評(píng)價(jià)的有力手段。
[0003] 目前，對(duì)這些含糖醛酸多糖的定量檢測(cè)，化學(xué)顯色法最為常用，例如通過(guò)咔唑法測(cè) 定糖醛酸含量從而間接測(cè)定這些含糖醛酸多糖，而含氨基糖的肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸 等糖胺聚糖還可以通過(guò)Elson-Morgan法測(cè)定氨基糖含量來(lái)間接定量。但這些化學(xué)顯色法缺 乏特異性，對(duì)于同時(shí)含有幾種這類多糖的樣品，只能測(cè)出它們的總量，而無(wú)法確定每一種多 糖的含量。有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)糖胺聚糖酶解后產(chǎn)生的二糖進(jìn) 行定量，從而對(duì)各種糖胺聚糖進(jìn)行定量，但糖胺聚糖酶的降解酶價(jià)格都十分昂貴，而含糖醛 酸-己糖二糖片段多糖還沒(méi)有商品化的降解酶，因此該方法難以廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法。
[0005] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：一種定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，包括 以下步驟：
[0006] 步驟1，將已知的多糖配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液；
[0007] 步驟2，提取待測(cè)樣品中的多糖并配置成待測(cè)樣品溶液；
[0008] 步驟3，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣品溶液中的多糖水解，得到水解殘余物；
[0009] 步驟4,步驟3所得殘余物用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制備糖的衍生物；
[0010] 步驟5,利用高效液相色譜儀和三重四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)糖的衍生物 進(jìn)行分析；
[0011] 步驟6，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)多糖混合溶液的MRM色譜圖及待測(cè)樣品溶液的MRM色譜圖，利用色 譜峰保留時(shí)間和監(jiān)測(cè)離子豐度比確定待測(cè)樣品為何種含糖醛酸多糖；
[0012] 步驟7,根據(jù)高效液相色譜-質(zhì)譜獲得的標(biāo)準(zhǔn)多糖二糖衍生物的MRM色譜圖，制定色 譜峰面積與多糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算待測(cè)樣品中含糖醛酸多糖的 含量。
[0013] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，步驟1和步驟2中制備 的標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液、待測(cè)樣品溶液中含有三氟乙酸;在步驟3的具體過(guò)程為:標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品 溶液密封，在105 °C水解3h;酸水解液使用冷凍離心濃縮除去溶劑，再加入0.5mL甲醇，使用 冷凍離心濃縮除去溶劑，以上操作重復(fù)三次，達(dá)到除酸目的。
[0014] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，步驟4的具體過(guò)程為： 加入300yL的氨水溶解殘?jiān)偌尤?00yL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲 醇溶液，密封，70°C水浴30min，加入lmL甲醇，真空冷凍離心減壓除去溶劑，重復(fù)三次;然后 加入lmL水，再加入lmL的氯仿，震蕩后除去氯仿，重復(fù)萃取三次，水層作為供試液。
[0015] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，步驟5的具體過(guò)程為： 以乙腈/20mM乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，使用配備反相C18色譜柱的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 分析，離子源ESI源;正離子模式，監(jiān)測(cè)不同種類多糖二糖片段衍生物的特征離子對(duì)。
[0016] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，所述特征離子對(duì)如下： 687·30/511·20、686·30/492·10、686·30/525·20、686·30/510·12、687.30/373·00、687·30/ 187.00、686.30/175.00、686.30/187.00、687.30/175.00、686.30/373.00。
[0017] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，所述含糖醛酸多糖為 具有一個(gè)糖醛酸與一個(gè)氨基己糖或己糖組成的重復(fù)二糖片段的多糖。
[0018] 本發(fā)明如上所述的定量檢測(cè)含糖醛酸多糖的方法，優(yōu)選地，步驟1中所述已知多糖 為硫酸軟骨素、肝素、透明質(zhì)酸或鮑魚(yú)多糖AGSP。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明方法能夠同時(shí)定量測(cè)定多種由一個(gè)糖醛酸與一個(gè)氨基己糖或己糖的重復(fù) 二糖單元構(gòu)成的多糖，不易受到樣品基質(zhì)的干擾，結(jié)果準(zhǔn)確。與酶法降解相比，酸水解法成 本低，操作簡(jiǎn)單，而且對(duì)各種多糖都有降解作用。
[0021] 利用了三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法，并確定了監(jiān)測(cè)離子對(duì)，以保證檢測(cè)的穩(wěn)定性和 靈敏度。采用離心濃縮方法除去樣品中的三氟乙酸和氨水，該方法適合批量處理樣品，而且 相對(duì)于氮吹、真空烘干等方法，樣品不易發(fā)生損失，能夠保證定量檢測(cè)的準(zhǔn)確可靠。
[0022] 本發(fā)明方法適用于定量檢測(cè)由一個(gè)糖醛酸與一個(gè)氨基己糖或己糖的重復(fù)二糖片 段組成的多糖，如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等。這種含糖醛酸多糖廣泛的存在于動(dòng)物、植 物、微生物組織中，而且具有多種生物活性，其中一些被開(kāi)發(fā)為藥品、保健品等。本發(fā)明提供 的方法能夠?qū)@些多糖進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)定，為含有這些多糖的藥品、保健品等產(chǎn)品的質(zhì) 量控制提供了有效手段。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)多糖混合溶液的MRM色譜圖；
[0024] 圖2是實(shí)施例1中樣品溶液的MRM色譜圖。
[0025]圖3是實(shí)施例1中透明質(zhì)酸(ΗΑ)的離子豐度圖；
[0026]圖4是實(shí)施例1中鮑魚(yú)性腺多糖AGSP的離子豐度圖；
[0027]圖5是實(shí)施例1中硫酸軟骨素(CS)的離子豐度圖；
[0028] 圖6是實(shí)施例1中肝素(HP)的離子豐度圖；
[0029] 圖7是實(shí)施例1中樣品溶液色譜峰的離子豐度圖；
[0030] 圖8是實(shí)施例1中透明質(zhì)酸(HA)對(duì)應(yīng)的色譜峰；
[0031]圖9是實(shí)施例1中鮑魚(yú)性腺多糖AGSP對(duì)應(yīng)的色譜峰；
[0032]圖10是實(shí)施例1中硫酸軟骨素(CS)對(duì)應(yīng)的色譜峰；
[0033]圖11是實(shí)施例1中肝素(HP)對(duì)應(yīng)的色譜峰。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，實(shí)施例中未注明具體條件 者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以 通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0035] 實(shí)施例1
[0036]步驟1，準(zhǔn)確取肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、鮑魚(yú)性腺多糖AGSP各10mg左右，混合 后加入5ml水，溶解，過(guò)夜，用2.6m〇VL的三氟乙酸定容于