一種茶樹花中多糖含量的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測技術領域，具體涉及一種茶樹花中多糖含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 茶樹花含有豐富的內(nèi)含物質(zhì)，其主要化學成分與茶葉大體相同。但是其活性成分 的比例卻與茶葉相差甚遠，其中茶樹花含有總糖（多35%)要高于茶葉，尤其是其中的多糖 要高于茶葉，而咖啡因1% )卻低于茶葉。但是近年來關于茶樹原料多糖的檢測方法一 直沒有達到統(tǒng)一。茶樹原料多糖大多沿用其他多糖的檢測方法，有少量科學工作者在茶葉 中多糖的檢測方法研宄上做了一定工作，如利用色譜方法（HPLC、GC)直接分析多糖中單糖 組分，用間接方法（苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法）分析多糖含量；前者由于前處理工作過 于復雜（如HPLC需要樣品衍生化、GC需預先轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)性、熱穩(wěn)定的衍生物），尤其是分 析得到的僅是單糖組分或還原糖情況等，不利于被廣泛應用。后者雖然比較簡單，但是由于 難于找到一種合適的對照品，加上準確度很難保證，無法成為茶樹原料多糖的有效檢測方 法，尤其是對于茶樹花中的多糖檢測方法研宄的沒有大的突破。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種茶樹花中多糖含量的檢測方法，本發(fā)明基于茶源多糖檢 測的現(xiàn)有技術，比較離子色譜法和分光光度法對茶源多糖含量的分析，結(jié)果表明，無論采用 哪種單糖（如阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖）作為分光光度法檢測 的對照品，與離子色譜分析的結(jié)果都存在較大差異。本發(fā)明將兩種檢測技術結(jié)合，探索一 種改良換算因子蒽酮-硫酸分光光度檢測茶樹花多糖的新方法，利用分光光度法檢測的便 捷、簡單、設備成本低的優(yōu)點，又避免離子色譜法檢測的前期處理復雜、設備成本高、不利推 廣的缺點，該方法同樣適用于茶樹其他組織中多糖的分析，以及其他途徑天然產(chǎn)物源中多 糖含量檢測分析。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術方案是，一種茶樹花中多糖含量的檢測方法，具體按照以下 步驟實施：
[0005] 步驟1、茶樹花樣品的預處理；
[0006] 步驟2、茶樹花中多糖提取與精制，得到精制的茶樹花多糖制品；
[0007] 步驟3、采用分光光度法測定精制的茶樹花多糖制品中多糖含量，得到茶樹花樣品 中多糖檢測濃度c(mg/ml)和多糖含量cl(% );
[0008] 步驟4、采用離子色譜法檢測茶樹花粗多糖水解液中茶樹花粗多糖中多糖含量 c2(% )；
[0009] 步驟5、根據(jù)利用分光光度法得到的茶樹花粗多糖中多糖含量cl (%)和利用離子 色譜法測出的茶樹花粗多糖中多糖含量c2(% )，確定兩者的換算因子f;
[0010] 步驟6、分光光度法所測的多糖檢測濃度乘以換算因子f得到最終茶樹花多糖含 量（％ )。
[0011] 本發(fā)明的特點還在于，
[0012] 步驟1中茶樹花樣品的預處理具體按照以下步驟實施：
[0013] 步驟1. 1、將茶樹花樣品，置于80°C環(huán)境下的電熱鼓風烘箱中，干燥3h后用高速粉 碎機進行粉碎，過20目篩后，備用；
[0014] 步驟1. 2、稱取過20目篩后的干燥茶樹花粉末，使用80%乙醇，90°C-KKTC條件下 水浴回流提取0. 5h-l. 5h，趁熱抽濾，其中，干燥茶樹花粉末與乙醇的質(zhì)量體積比（g/ml)為 1 : 30-1:50;濾渣中加入80%熱乙醇，超聲振蕩lmin，其中，濾渣與乙醇的質(zhì)量體積比（g/ ml)為1 : 30-1:50,抽濾，重復一次，濾澄45°C低溫干燥備用。
[0015] 步驟2中茶樹花中多糖提取與精制具體按照以下步驟實施：稱取經(jīng)80%乙醇預處 理后干燥茶樹花，加入蒸餾水，在60°C下，超聲輔助提取30min，其中，經(jīng)80%乙醇預處理后 干燥茶樹花與蒸餾水的質(zhì)量體積比（g/ml)為1:40-1:60 ;將提取液用布氏漏斗減壓抽濾 后，濾液減壓濃縮至l〇〇mL，用300mL95%乙醇沉淀，邊加邊攪拌，放于4°C低溫條件下醇沉 24h，10000r/min，冷凍離心，沉淀用無水乙醇洗滌3次，于冷凍干燥器中干燥至恒重，即得 精制的茶樹花多糖制品，稱重，備用。
[0016] 步驟3中采用分光光度法測定茶樹花粗多糖中多糖含量具體按照以下步驟實施：
[0017] 步驟3. 1、配制蒽酮-硫酸溶液，稱取0. 20g蒽酮，加入IOOmL 75%濃硫酸，溶解混 勻，備用；
[0018] 步驟3. 2、葡萄糖標準曲線制備，稱取200mg烘至恒重的葡萄糖，蒸餾水定容至 IOOmL為母液，吸取IOmL母液定容至IOOmL為工作液，搖勻；準確吸取工作液0、0. 2、0. 4、 0. 6、0. 8、1.0 mL于IOmL具塞試管，用水定容至lmL，再加入蒽酮-硫酸溶液4mL，搖勾，冰浴 冷卻后，沸水浴煮沸IOmin后，再冰浴冷卻10min，在620nm波長下檢測吸光度；葡萄糖標 準樣品濃度及對應吸光度繪制標準曲線的線性關系為y = 9. 5686x-0. 0058,相關性r = 0· 9995,線性范圍：0mg/mL ~0· 2mg/mL ;
[0019] 步驟3. 3、半乳糖標準曲線制備，稱取200mg烘至恒重的半乳糖，蒸餾水定容至 IOOmL為母液，吸取20mL母液定容至IOOmL為工作液，搖勻；按葡萄糖標準曲線制作法制 做半乳糖標準曲線，半乳糖標準樣品濃度及對應吸光度繪制標準曲線的線性關系為y = 5· 0521χ+0· 0046,相關性 r = 0· 9981，線性范圍：0mg/mL ~0· 2mg/mL，X 為檢測濃度（mg/ mL)，y為吸光度A ;
[0020] 步驟3. 4、多糖含量測定，精密稱取精制茶樹花多糖0. 0500g，用蒸餾水溶解，于 50mL容量瓶中定容，按標準曲線制作方法，取ImL樣液于IOmL具塞試管中，加入蒽酮標準液 4mL，搖勾，冰浴冷卻后，沸水浴煮沸10min，再冰浴冷卻10min，在620nm波長下檢測吸光度， 將其分別代入葡萄糖對照品標準曲線和半乳糖對照品標準曲線，分別計算出以葡萄糖和半 乳糖為對照的茶樹花多糖的檢測濃度c (mg/ml)，并計算出精制茶樹花多糖含量cl (%)。
[0021] 步驟4中采用離子色譜法檢測茶樹花粗多糖水解液中茶樹花粗多糖中多糖含量 具體按照以下步驟實施：
[0022] 步驟4. 1、分別稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果 糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸11種對照品，將其配制成各個對照品濃度為10ug/mL的 混合對照品，用離子色譜進行檢測；
[0023] 步驟4. 2、茶樹花多糖水解：稱取應步驟2處理得到的精制的茶樹花多糖制品 51. 9mg，加入4mL，2mol/L的三氟乙酸進行溶解后充入氮氣封口，120°C水解6h，水解結(jié)束 后，離心，取上清液，在40°C下，用氮吹儀吹干，用甲醇溶解吹趕殘留的三氟乙酸，重復3次， 最后定容至50mL，過0. 45um微孔膜，進行離子色譜分析；
[0024] 步驟4. 3、離子色譜分析的條件為流速：1. OmL/min，進樣量10uL，柱溫30°C， 安培積分檢測，金電極，Dionex公司CarboPacPA10250mmX 3mm，流動相：A :water ;B : IOOmMNaOH ;C :100mMNa0H/0. 5MNaAc ;梯度洗脫：0 ~20min :70 % A，30 % B ;21 ~25min : 90 % B - 80 % B，10 % C - 20 % C ;25 ~35min :80 % B - 50 % B，20 % C - 50 % C ;36 ~ 46min :70% A，30% B ;根據(jù)茶樹花多糖水解后單糖溶液離子色譜圖的保留時間和峰面積， 計算出上述11個單糖的總質(zhì)量占精制的茶樹花多糖制品的質(zhì)量的百分比，即為茶樹花多 糖含量c2(% )。
[0025] 步驟5中根據(jù)利用分光光度法得到的茶樹花粗多糖中多糖含量