本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)新穎的pyxinol衍生物及其半合成方法，和其在心肌缺血/再灌注損傷中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心肌缺血/再灌注損傷(myocardialischemia-reperfusioninjury,iri)是冠心病心肌損傷的重要原因，主要是指心肌組織在較長時(shí)間缺血后通過手術(shù)或藥物等手段恢復(fù)血液灌流，產(chǎn)生比再灌流前更顯著的功能障礙和損傷，如冠狀動脈血流量下降、心臟收縮功能降低等心臟病態(tài)癥狀。目前，臨床上使用的藥物雖有一定療效，但均存在局限性，因此，亟須尋求新的結(jié)構(gòu)類型的抗iri活性藥物。
人參皂苷作為人參的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用，在中醫(yī)里，人參作為保護(hù)心臟的首選補(bǔ)藥，其主要的活性成分--人參皂苷在抗心血管疾病的研究上，極為引人矚目，尤其是20(s)原人參二醇型皂苷，具有較強(qiáng)的抗心肌缺血作用，更受關(guān)注。pyxinol作為天然產(chǎn)物，早在1972年從苔蘚植物--地衣中分離出來，然而其活性研究，鮮有進(jìn)展。近年來，研究發(fā)現(xiàn)pyxinol為20(s)原人參二醇型皂苷在體內(nèi)的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物之一，因此在抗心肌缺血作用上具有較高的研究價(jià)值。然而，體內(nèi)外代謝研究顯示，pyxinol生物利用度較差，幾乎不溶于水，影響用藥。其中，藥物脂水分配系數(shù)是其生物利用度高低的關(guān)鍵指標(biāo)之一。因此，我們對pyxinol母核結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，希望獲得具有更優(yōu)抗iri活性的、具有較理想脂水分配系數(shù)的、結(jié)構(gòu)新穎的pyxinol衍生物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為尋找結(jié)構(gòu)新穎、具有較理想脂水分配系數(shù)的、制備方便的pyxinol衍生物，并進(jìn)一步提供一種治療相應(yīng)疾病或病癥的藥物及其組合物。本發(fā)明提供了一系列具有通式(i)結(jié)構(gòu)特征的衍生物、其藥學(xué)可接受的鹽。這些化合物的抗iri活性屬于首次發(fā)現(xiàn)，且為首次合成新化合物。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是尋找新結(jié)構(gòu)類型的具有優(yōu)良抗iri活性的化合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種pyxinol衍生物的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種pyxinol衍生物在制備預(yù)防或治療iri疾病藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種具有結(jié)構(gòu)式i的pyxinol衍生物，其結(jié)構(gòu)式為：
其中，r為甘胺酰甘胺?；?、甘胺酰甘胺酰甘胺?；?、6-氨基己酰基或{2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；械娜我庖环N。
本發(fā)明中化合物1為(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺?；?-達(dá)瑪烷，化合物2為(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺?；?-達(dá)瑪烷，化合物3為(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺酰甘胺?；?-達(dá)瑪烷，化合物4為(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–6–氨基己?；?–達(dá)瑪烷，化合物5為(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–{2-(2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?–達(dá)瑪烷。本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)式i的pyxinol衍生物采用如下方法步驟制備：
1)以(20s,24r)-環(huán)氧達(dá)瑪烷-3β,12β,25-三醇(pyxinol)為原料，在有機(jī)堿、縮合劑存在下與羧酸反應(yīng)獲得酯化衍生物；
2)然后將步驟(1)得到的酯化衍生物在酸或胺的條件下，氨基脫保護(hù)直接得到化合物1、化合物4或化合物5；化合物1在縮合劑hbtu(o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)的存在下與氨基酸衍生物縮合，然后在酸或胺的條件下氨基脫保護(hù)可得到化合物2或化合物3。
步驟1)中所述有機(jī)堿為edci(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、dcc(二環(huán)己基碳二亞胺)、dic(n,n'-二異丙基碳二亞胺)中的任意一種或幾種混合，縮合劑為dmap(4-二甲氨基吡啶)。
步驟2)中所述酸為tfa(三氟乙酸)等，胺為二乙胺、二乙胺等任意一種或幾種混合。
其中，原料(20s,24r)-環(huán)氧達(dá)瑪烷-3β,12β,25-三醇可以通過天然產(chǎn)物分離得到或者通過20(s)原人參二醇在間氯過氧苯甲酸氧化作用下氧化環(huán)化方式合成獲得；所述有機(jī)堿、縮合劑、酸、胺、氨基酸衍生物直接由市售購得。
pyxinol衍生物在制備預(yù)防或治療iri疾病藥物中的應(yīng)用。
所述結(jié)構(gòu)式(i)的pyxinol衍生物用于制備抗iri藥物。
藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明的pyxinol衍生物具有抗iri活性，可以用于制備抗iri藥物。
下面是本發(fā)明化合物的藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
試驗(yàn)方法：
構(gòu)建體外心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧模型,采用mtt法檢測pyxinol衍生物對心肌細(xì)胞活力的影響。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1)實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)立正常對照組、缺氧-復(fù)氧損傷(h/r)模型組和h/r+試驗(yàn)藥物組。
2)細(xì)胞培養(yǎng)：選用h9c2細(xì)胞體外培養(yǎng)，3-4天后，h9c2細(xì)胞大部分貼壁，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞一般可以占到80％，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3)心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧損傷模型建立：將h9c2細(xì)胞其按照3×103～5×103/孔種于96孔板中，每組4個(gè)復(fù)孔；在常氧培養(yǎng)箱(37℃5％的co2培養(yǎng)箱)中孵育24h后，將正常對照組外的各組更換為缺氧支持液(含na2s2o4的無糖無血清dmem培養(yǎng)基)，使其繼續(xù)在常氧培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間。造成細(xì)胞缺氧后，再次更換為同體積含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，模擬再灌注，建立體外心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型。
經(jīng)缺氧復(fù)氧損傷處理后，正常對照組和缺氧-復(fù)氧損傷(h/r)模型組加正常培養(yǎng)基，其余各組分別加相應(yīng)的藥物，在常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。
4)mtt檢測心肌細(xì)胞活力：經(jīng)(3)處理后，每孔加入5mg/ml的mtt(全稱四甲基偶氮唑藍(lán)溶液)20μl,常氧培養(yǎng)箱孵育2h后小心移除培養(yǎng)液,每孔中加入150μldmso(全稱二甲基亞砜),微孔板震蕩器震蕩10min使甲攢結(jié)晶充分溶解,用微孔板掃描酶標(biāo)儀測其吸光度值(od值)。
5)結(jié)果分析：以細(xì)胞的存活率(細(xì)胞存活率％＝加藥組細(xì)胞od值/對照組細(xì)胞od值×100％)為主要評價(jià)指標(biāo)，以缺氧-復(fù)氧模型組的細(xì)胞存活率低于正常對照組作為模型成功的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。加pyxinol衍生物處理后細(xì)胞活性增加，提示pyxinol衍生物有抗心肌缺血/再灌注損傷的活性。
6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示，附圖1顯示化合物2、化合物3、化合物4和化合物5具有顯著的抗iri活性，可以用于制備抗iri藥物?；衔镏苄詼y定
實(shí)驗(yàn)步驟：將化合物加入到正辛醇-水體系中，調(diào)至ph7.4，在25℃的恒溫水浴中搖勻1h，離心分離為兩相，用hplc測定藥物在兩相中的濃度。
結(jié)果分析：化合物在正辛醇-水體系分配系數(shù)對數(shù)值(logp)的結(jié)果如下，pyxinol的logp＝5.80±0.12，化合物2的logp＝4.70±0.11，化合物3的logp＝4.00±0.09。logp是藥物生物利用度的一個(gè)中重要指標(biāo)，通常藥物的logp在-2到5之間有較好的生物利用度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：這些pyxinol衍生物提高了其生物利用度。
附圖說明
圖1為pyxinol衍生物抗心肌缺血/再灌注損傷作用的體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)例。
實(shí)施例1
(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺?；?-達(dá)瑪烷
將(20s,24r)-環(huán)氧達(dá)瑪烷-3β,12β,25-三醇(42mg，0.088mmol)，boc-甘氨酸(26mg，0.148mmol)和edci(51mg，0.266mmol)溶于無水二氯甲烷(1ml)中，加入dmap(3mg，0.024mmol)，室溫?cái)嚢?h。氯仿稀釋，加水猝滅反應(yīng)，有機(jī)相依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝3/1-2/1)，得到無色粘液n-boc-1(56mg，0.088mmol，100％)。
將上述得到的n-boc-1(52mg，0.082mmol)溶于三氟乙酸(0.3ml)，室溫?cái)嚢?h，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝10/1-6/1)，得化合物1(43mg，0.081mmol，98％)。
將化合物1(36mg，0.067mmol)和boc-甘氨酸(26mg，0.148mmol)溶于無水二甲基甲酰胺(1ml)中，加入hbtu(59mg，0.156mmol)和三乙胺4滴，室溫?cái)嚢?h。乙酸乙酯稀釋，加飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝30/1-20/1)，得到無色粘液n-boc-2(43mg，0.062mmol，93％)。
將上述得到的n-boc-2(30mg，0.043mmol)溶于三氟乙酸(0.3ml)，室溫?cái)嚢?0min，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝10/1-6/1)，得化合物2(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺?；?-達(dá)瑪烷(21mg,0.036mmol,83％)。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ4.47(dd,j＝10.9,5.5hz,1h),3.89(t,j＝7.4hz,1h),3.49(td,j＝10.5,4.4hz,1h),2.91(t,j＝7.6hz,2h),2.35(t,j＝7.3hz,2h),2.19(td,j＝11.0,3.4hz,1h),2.06–0.82(m,21h),1.27(s,3h),1.21(s,3h),1.13(s,3h),1.02(s,3h),0.93(s,3h),0.93(s,3h),0.88(s,3h),0.85(s,3h)；hrms(esi,positive)m/z591.4362[m+h]+.
實(shí)施例2
(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺酰甘胺酰基)-達(dá)瑪烷
將化合物1(24mg，0.045mmol)和boc-甘胺酰甘氨酸(15mg，0.065mmol)溶于無水二甲基甲酰胺(0.8ml)中，加入hbtu(29mg，0.076mmol)，室溫?cái)嚢?h。乙酸乙酯稀釋，加飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝30/1-20/1-6/1)，得到無色粘液n-boc-3(27mg，0.036mmol，80％)。
將上述得到的n-boc-3(22mg，0.029mmol)溶于三氟乙酸(0.3ml)，室溫?cái)嚢?0min，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝10/1-6/1)，得化合物3(20s,24r)-環(huán)氧-12β,25–二羥基–(3β–o–甘胺酰甘胺酰甘胺?；?-達(dá)瑪烷(18mg,0.028mmol,96％)。
1hnmr(400mhz,cd3od)1hnmr(400mhz,cd3od)δ4.53(dd,j＝11.3,5.2hz,1h),3.99(s,2h),3.95(d,j＝1.4hz,2h),3.90(t,j＝7.4hz,1h),3.72(s,2h),3.48(dt,j＝10.4,5.2hz,1h),2.23–2.17(m,1h),2.07–0.89(m,21h),1.27(s,3h),1.21(s,3h),1.13(s,3h),1.03(s,3h),0.94(s,6h),0.89(s,3h),0.87(s,3h).ms(esi,positive)m/z648.5[m+h]+
實(shí)施例3
(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–6–氨基己?；?–達(dá)瑪烷
將(20s,24r)–環(huán)氧達(dá)瑪烷–3β,12β,25–三醇(44mg，0.092mmol)，boc–6–氨基己酸(66mg，0.28mmol)和edci(90mg，0.047mmol)溶于無水二氯甲烷(1ml)中，加入dmap(3mg，0.024mmol)，室溫?cái)嚢?h。氯仿稀釋，加水猝滅反應(yīng)，有機(jī)相依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1–4/1–3/1–2/1)，得到無色粘液n-boc-4(45mg，0.065mmol，71％)。
將上述得到的n-boc-4(27mg，0.039mmol)溶于三氟乙酸(0.7ml)，室溫?cái)嚢?h，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝20/1-10/1)，得化合物4(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–6–氨基己?；?–達(dá)瑪烷(23mg,0.039mmol,100％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.45(dd,j＝8.0,8.4hz,1h),3.86(m,1h),3.54(m,1h),2.93(m,2h),2.30(t,j＝7.2hz,2h),2.21(m,1h),2.04–1.78(m,5h),1.70–0.93(m,22h),1.27(s,6h),1.11(s,3h),0.98(s,3h),0.90(s,3h),0.87(s,3h),0.84(s,3h),0.82(s,3h).hrms(esi,positive)m/z590.4768[m+h]+.
實(shí)施例4
(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–{2-(2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?–達(dá)瑪烷
將(20s,24r)–環(huán)氧達(dá)瑪烷–3β,12β,25–三醇(40mg，0.084mmol)，{2-[2-(fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基}乙酸(39mg，0.101mmol)和edci(48mg，0.25mmol)溶于無水二氯甲烷(1.0ml)中，加入dmap(2mg，0.016mmol)，室溫?cái)嚢?8h。氯仿稀釋，加水猝滅反應(yīng)，有機(jī)相依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝5/1–3/1–2/1–1/1–1/2)，得到白色固體n-fmoc-5(58mg，0.069mmol，82％，99％brsm)，有7mg原料回收。
將上述得到的n-fmoc-5(16mg，0.019mmol)溶于二氯甲烷(0.5ml)中，加入二乙胺(0.5ml)，室溫?cái)嚢?天，濃縮，柱層析(氯仿：甲醇＝20/1-10/1)，得化合物5(20s,24r)–環(huán)氧–12β,25–二羥基–(3β–o–{2-(2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基}乙?；?–達(dá)瑪烷(10mg,0.016mmol,85％)。
1hnmr(400mhz,cd3od)δ4.59(dd,j＝10.9,5.5hz,1h),4.20(d,j＝16.4hz,1h),4.15(d,j＝16.4hz,1h),3.90(t,j＝7.4hz,1h),3.73–3.69(m,6h),3.49(td,j＝10.6,4.6hz,1h),3.13–3.11(m,2h),2.23–2.17(m,1h),2.07–0.88(m,21h),1.27(s,3h),1.21(s,3h),1.13(s,3h),1.03(s,3h),0.94(s,6h),0.88(s,3h),0.87(s,3h).hrms(esi,positive)m/z622.4665[m+h]+.
以上描述僅為本申請的較佳實(shí)施例以及對所運(yùn)用技術(shù)原理的說明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本申請中所涉及的發(fā)明范圍，并不限于上述技術(shù)特征的特定組合而成的技術(shù)方案，同時(shí)也應(yīng)涵蓋在不脫離所述發(fā)明構(gòu)思的情況下，由上述技術(shù)特征或其等同特征進(jìn)行任意組合而形成的其它技術(shù)方案。例如上述特征與本申請中公開的但不限于具有類似功能的技術(shù)特征進(jìn)行互相替換而形成的技術(shù)方案。