本發(fā)明涉及一種瑞鮑迪苷d的提取方法，具體涉及一種從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法。

背景技術(shù)：

甜菊糖苷中的主要糖苷有甜菊苷（st）和瑞鮑迪苷a（ra），其他已知糖苷包括瑞鮑迪苷b（rb）、瑞鮑迪苷c（rc）、瑞鮑迪苷d（rd）、瑞鮑迪苷f(shuō)（rf）、杜克苷a、甜茶苷和甜菊雙糖苷。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，甜菊糖苷中口感最好的成分不是甜度最高的ra，而是rd，rd的甜度大約是蔗糖的150倍，口感好，無(wú)苦澀味，但是，rd在甜葉菊中的含量很低，僅1%左右，因此，想要高回收率的提取高純度的rd較為困難。

cn102060892a公開(kāi)了一種甜菊糖甙rd的提純方法，是將母液糖料液流過(guò)大孔吸附樹脂，再用乙醇洗脫，分段收集洗脫液，濃縮，干燥，精制，得到rd。但是，由于大孔樹脂的吸附選擇性差，通過(guò)分段洗脫，通過(guò)確定臨界點(diǎn)的方法收集rd的可操作性較低，rd難以富集，因此，rd的收率不高。

cn102406113a公開(kāi)了一種ra和rd復(fù)配甜菊糖的制備方法，是以甜葉菊為原料，通過(guò)水提取，大孔樹脂吸附，洗脫，脫色，結(jié)晶，重結(jié)晶等步驟，得到ra和rd的混合產(chǎn)品。但是，該方法無(wú)法獲得高含量的rd。

cn103709215a公開(kāi)了一種從甜菊糖結(jié)晶母液糖中提取萊鮑迪甙d的方法，是將甜菊糖母液糖用水和甲醇保溫，攪拌，反復(fù)結(jié)晶，得到rd產(chǎn)品。但是，該方法因結(jié)晶次數(shù)過(guò)多，收率較低，且rd的純度僅50%左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種所得產(chǎn)品純度、收率高，產(chǎn)品附加值高，綠色環(huán)保，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：一種從甜菊糖苷精制母液中提取高純度瑞鮑迪苷d的方法，包括以下步驟：

（1）結(jié)晶除雜：將甜菊糖苷精制母液加入醇溶液中，加熱溶解，冷卻析晶，過(guò)濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液減壓濃縮至無(wú)醇，在濃縮液中加入反相硅膠，混合均勻，干燥至恒重，得拌樣硅膠；

（3）裝柱：在空層析柱中，先裝入反相硅膠，再在反相硅膠上裝入步驟（2）所得拌樣硅膠；

（4）洗脫：用洗脫劑對(duì)步驟（3）裝柱后的層析柱進(jìn)行洗脫，收集目標(biāo)洗脫流出液，濃縮，干燥，得瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得瑞鮑迪苷d粗品用有機(jī)溶劑或水加熱溶解，冷卻，析晶，過(guò)濾，干燥，得瑞鮑迪苷d精品。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述甜菊糖苷精制母液中瑞鮑迪苷d的質(zhì)量含量為5～30%（更優(yōu)選6～10%）。本發(fā)明所述甜菊糖苷精制母液來(lái)源于以甜葉菊提取物為原料，用有機(jī)溶劑結(jié)晶制備高純?nèi)瘐U迪苷a（ra）、甜菊苷（st）時(shí)所產(chǎn)生的母液。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述醇溶液的用量為甜菊糖苷精制母液質(zhì)量的4～20倍（更優(yōu)選5～10倍）。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述醇溶液中的醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等中的一種或幾種，醇溶液的體積濃度為50～99%。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述加熱溶解的溫度為40～60℃。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述冷卻析晶的溫度為10～25℃，時(shí)間為12～24h。

步驟（1）中，析晶過(guò)濾后的濾渣中含有高含量的ra和st，可用現(xiàn)有技術(shù)對(duì)這兩種原料進(jìn)行提取。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述減壓濃縮的溫度為60～90℃，真空度為-0.06～-0.09mpa。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述干燥的溫度為60～90℃。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述反相硅膠的用量為濃縮液質(zhì)量的1～2倍。拌樣的目的是使物料能和反相硅膠充分吸附；若反相硅膠的用量過(guò)少，則物料無(wú)法完全吸附；若反相硅膠的用量過(guò)多，則易造成浪費(fèi)并增加洗脫的難度。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述反相硅膠的類型為c4、c8或c18等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述反相硅膠的用量為拌樣硅膠質(zhì)量的1～20倍（更優(yōu)選5～15倍）。先加入反相硅膠的目的是，提供一個(gè)緩沖區(qū)域，使洗脫過(guò)程中各種成分在反相硅膠中保留不同的時(shí)間。若反相硅膠的用量過(guò)少，則各種成分保留的相對(duì)時(shí)間太接近，無(wú)法達(dá)到分離的目的；若反相硅膠的用量過(guò)多，則易造成浪費(fèi)并增加洗脫劑的用量。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述層析柱的高徑比為5～20:1。若高徑比過(guò)小，則分離的效果差；若高徑比過(guò)大，將增加洗脫劑的用量和洗脫的時(shí)間。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述洗脫劑的用量為2～10bv，洗脫的流速為0.5～2.0bv/h。所述1bv=1個(gè)柱床體積。所述目標(biāo)洗脫流出液是通過(guò)薄層層析檢測(cè)含有瑞鮑迪苷d的洗脫流出液段。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述洗脫劑為體積濃度40～95%（更優(yōu)選50～80%）的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙腈、乙酸、丙酮、乙酸乙酯溶液或水等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（4）中，濃縮至無(wú)溶劑，干燥至恒重。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述有機(jī)溶劑或水的用量為瑞鮑迪苷d粗品質(zhì)量的4～20倍（更優(yōu)選4.5～10倍）。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述有機(jī)溶劑為體積濃度40～95%（更優(yōu)選60～90%）的甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮或乙酸乙酯溶液等中的一種或幾種。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述加熱溶解的溫度為40～60℃。

優(yōu)選地，步驟（5）中，所述析晶的溫度為10～25℃，時(shí)間為12～24h。

本發(fā)明方法的原理為：由于甜菊糖苷精制母液中rd的含量普遍不高，用醇溶解后難以達(dá)到rd可以結(jié)晶的濃度，rd不會(huì)結(jié)晶析出，而其它雜質(zhì)成分，如ra和st的含量高，則可以在醇溶液中大量結(jié)晶析出，先將析出的雜質(zhì)過(guò)濾之后，絕大部分rd就留在了結(jié)晶母液中，由此提高了rd的含量，降低了后續(xù)反相硅膠柱層析的難度。反相硅膠的特性之一是在洗脫過(guò)程中，極性大的成分先流出，極性小的成分后流出，rd是所有甜菊糖苷中極性最大的，因此，在反相硅膠柱的洗脫中是最先流出的，由此可以高效的將rd和其它糖苷分離，最后通過(guò)重結(jié)晶，得到高純度的rd精品。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法可以從廉價(jià)的甜菊糖苷精制母液中提取出高純度的rd，所得rd精品呈白色結(jié)晶性粉末，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，rd的純度可高達(dá)99.0wt%，rd的最終收率可高達(dá)92.4%，提高了甜葉菊資源的利用率；

（2）本發(fā)明方法原料天然，所采用的物理提取方式，生產(chǎn)過(guò)程綠色環(huán)保，成本低，產(chǎn)品純凈、無(wú)污染，rd的售價(jià)是原料的10倍以上，產(chǎn)品附加值高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例所使用的甜菊糖苷精制母液來(lái)源于湖南華誠(chéng)生物資源股份有限公司以甜葉菊提取物為原料，用有機(jī)溶劑結(jié)晶制備高純r(jià)a、st時(shí)所產(chǎn)生的母液，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，rd的質(zhì)量含量為6.5%；本發(fā)明實(shí)施例所使用的c4、c8和c18反相硅膠均購(gòu)于大連依利特分析儀器有限公司；本發(fā)明實(shí)施例所使用的原料或化學(xué)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均通過(guò)常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

（1）結(jié)晶除雜：將100g甜菊糖苷精制母液加入500g體積濃度為80%的乙醇溶液中，在40℃下，加熱溶解，然后再在25℃下，冷卻析晶16h，過(guò)濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在65℃，真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，得60g濃縮液，在60g濃縮液中加入c4反相硅膠60g，混合均勻，在70℃下，干燥至恒重，得100g拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為15:1的空層析柱中，先裝入1000gc4反相硅膠，再在c4反相硅膠上裝入步驟（2）所得100g拌樣硅膠；

（4）洗脫：用3bv，體積濃度為70%的乙腈溶液對(duì)步驟（3）裝柱后的層析柱，在0.5bv/h的流速下，進(jìn)行洗脫，通過(guò)薄層層析檢測(cè)，收集含有瑞鮑迪苷d的目標(biāo)洗脫流出液，濃縮至無(wú)乙腈，干燥至恒重，得7.6g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得7.6g瑞鮑迪苷d粗品用38g體積濃度為85%的甲醇溶液，在50℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在10℃下，析晶24h，過(guò)濾，干燥，得6.1g瑞鮑迪苷d精品。

本實(shí)施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結(jié)晶性粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為98.5wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為92.4%。

實(shí)施例2

（1）結(jié)晶除雜：將50g甜菊糖苷精制母液加入300g體積濃度為55%的異丙醇溶液中，在60℃下，加熱溶解，然后再在15℃下，冷卻析晶12h，過(guò)濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在85℃，真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，得35g濃縮液，在35g濃縮液中加入c8反相硅膠70g，混合均勻，在90℃下，干燥至恒重，得82g拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為10:1的空層析柱中，先裝入440gc8反相硅膠，再在c8反相硅膠上裝入步驟（2）所得82g拌樣硅膠；

（4）洗脫：用5bv，體積濃度為60%的甲醇溶液對(duì)步驟（3）裝柱后的層析柱，在1bv/h的流速下，進(jìn)行洗脫，通過(guò)薄層層析檢測(cè)，收集含有瑞鮑迪苷d的目標(biāo)洗脫流出液，濃縮至無(wú)甲醇，干燥至恒重，得3.9g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得3.9g瑞鮑迪苷d粗品用30g體積濃度為90%的乙醇溶液，在55℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在10℃下，析晶18h，過(guò)濾，干燥，得2.95g瑞鮑迪苷d精品。

本實(shí)施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結(jié)晶性粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為99.0wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為89.9%。

實(shí)施例3

（1）結(jié)晶除雜：將1kg甜菊糖苷精制母液加入8kg體積濃度為95%的甲醇溶液中，在50℃下，加熱溶解，然后再在20℃下，冷卻析晶24h，過(guò)濾，得濾液；

（2）反相硅膠拌樣：將步驟（1）所得濾液在60℃，真空度為-0.09mpa下，減壓濃縮至無(wú)醇，得650g濃縮液，在650g濃縮液中加入c18反相硅膠650g，混合均勻，在75℃下，干燥至恒重，得1.1kg拌樣硅膠；

（3）裝柱：在高徑比為20:1的空層析柱中，先裝入16.5kgc18反相硅膠，再在c18反相硅膠上裝入步驟（2）所得1.1kg拌樣硅膠；

（4）洗脫：用10bv，體積濃度為50%的乙醇溶液對(duì)步驟（3）裝柱后的層析柱，在1.5bv/h的流速下，進(jìn)行洗脫，通過(guò)薄層層析檢測(cè)，收集含有瑞鮑迪苷d的目標(biāo)洗脫流出液，濃縮至無(wú)乙醇，干燥至恒重，得77g瑞鮑迪苷d粗品；

（5）精制：將步驟（4）所得77g瑞鮑迪苷d粗品用380g體積濃度為60%的正丁醇溶液，在55℃下，加熱溶解，冷卻至室溫，在25℃下，析晶24h，過(guò)濾，干燥，得60g瑞鮑迪苷d精品。

本實(shí)施例所得瑞鮑迪苷d精品呈白色結(jié)晶性粉末，經(jīng)高效液相色譜外標(biāo)法檢測(cè)，所得瑞鮑迪苷d精品的純度為98.6wt%，瑞鮑迪苷d的最終收率為91.0%。