本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離高純度橄欖苦苷的方法。
背景技術(shù)：
橄欖苦苷(oleuropein)是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：橄欖苦苷具有抗炎、抗真菌、抗病毒、抗氧化，抗癌和降血糖等多種活性。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)橄欖苦苷的提取純化方法進(jìn)行了有益探索。如發(fā)明名稱為“一種純化橄欖苦苷的方法”(申請(qǐng)?zhí)枮?01010549802.x)的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種從油橄欖葉中提取橄欖苦苷的方法：將油橄欖葉用乙醇提取，然后加入活性炭脫色，回收乙醇后用正丁醇萃取，正丁醇萃取相回收溶劑后用制備型高速逆流色譜儀分離，可以得到純度90％以上的橄欖苦苷純品。但是該專利使用活性炭脫色并正丁醇萃取，溶劑耗費(fèi)較多，回收正丁醇能耗大，并且最后工藝回收率較低，整個(gè)工藝橄欖苦苷得率僅達(dá)到1％左右。發(fā)明名稱“一種橄欖苦苷的制備方法”(申請(qǐng)?zhí)枺?01510270831.5)的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種制備橄欖苦苷的方法，是將油橄欖葉以乙醇為夾帶劑，通入co2進(jìn)行萃取，將所得萃取物濃縮后用大孔樹(shù)脂吸附，洗脫物用高速逆流色譜分離，以氯仿-甲醇-水(10:5:7，v:v)為兩相溶劑，制備得到橄欖苦苷。該專利使用超臨界co2進(jìn)行提取，設(shè)備和工藝成本較高，制約了它的進(jìn)一步發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分離高純度橄欖苦苷的方法，在獲得的高純度橄欖苦苷的基礎(chǔ)上，也獲得更大的得率，并通過(guò)減少工藝步驟降低生產(chǎn)成本，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題。
本發(fā)明的分離高純度橄欖苦苷的方法，包括如下的步驟：
1)制備油橄欖葉提取物：
使用60％-90％(體積比)的乙醇從油橄欖葉中提取獲得油橄欖葉提取物，
所述的提取方法為浸泡提取法或加熱回流提取
2)分離溶劑系統(tǒng)的選擇：
將正丁醇、乙酸乙酯、甲醇和水混合作為分離溶劑系統(tǒng)，振搖后靜置分層，將上、下相分開(kāi)分別作為固定相和流動(dòng)相；
作為實(shí)施例的優(yōu)選，其中正丁醇、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為1:19:1:19；
3)首先將固定相充滿逆流色譜儀的分離柱，然后開(kāi)動(dòng)逆流色譜儀主機(jī)，達(dá)到設(shè)定轉(zhuǎn)速后，再向其中泵入流動(dòng)相，待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥將油橄欖葉提取物注入，自動(dòng)餾分收集器接受餾分；
4)將收集的餾分通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)，合并含有橄欖苦苷的餾分，回收溶劑后得到橄欖苦苷。
所述的步驟2)中，所用溶劑系統(tǒng)的ph值為2-14。
所述的步驟2)中，可以以溶劑系統(tǒng)中的上相為固定相，下相為流動(dòng)相；也可以以溶劑系統(tǒng)中下相為固定相，上相為流動(dòng)相。
所述的步驟3)中，逆流色譜儀可以采用正轉(zhuǎn)模式，也可以采用反轉(zhuǎn)模式。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)為分離成本低，制備過(guò)程安全，并且分離過(guò)程能夠連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，橄欖苦苷產(chǎn)品純度可以達(dá)到90％以上。與柱層析等方法比較，它不使用固態(tài)的載體，因此不存在固體載體造成的樣品不可逆吸附和損耗，分離效率高，整個(gè)分離工藝適合于工業(yè)化生產(chǎn)，能夠最大限度的利用原料，降低生產(chǎn)成本，是一種高效快捷的從油橄欖葉提取物中分離高純度橄欖苦苷的方法。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中所使用的分離設(shè)備逆流色譜儀，根據(jù)所需目標(biāo)分離量的不同，可以選擇分析型、半制備型和制備型逆流色譜儀。
逆流色譜法分離高純度橄欖苦苷的方法，包括以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照一定體積比混合后靜置分層，構(gòu)成逆流色譜固定相、流動(dòng)相的溶劑體系；將固定相以較大流速泵入逆流色譜儀分離柱中；待柱中充滿固定相后，開(kāi)機(jī)，使逆流色譜儀主機(jī)以設(shè)定轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，然后以一定流速將流動(dòng)相泵入分離柱中；待兩相在分離柱中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，通過(guò)進(jìn)樣閥進(jìn)樣；自動(dòng)餾分收集器收集餾分；用高效液相色譜檢測(cè)，將含有橄欖苦苷成分的餾分合并后回收溶劑后得到橄欖苦苷。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1
1.樣品：取1kg油橄欖葉，加入15升90％(體積比)的乙醇，加熱回流提取2次，每次2h，將提取液合并后減壓回收乙醇，得到油橄欖葉提取物。
2.儀器：dehpcccspectrum逆流色譜儀，英國(guó)de公司。
3.制備方法：將正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照1:19:1:19(v:v)的比例充分混合均勻后放置在分液漏斗中靜置過(guò)夜。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相。首先將固定相泵入逆流色譜儀螺旋管中，流速6ml/min，待螺旋管完全充滿固定相后，開(kāi)啟逆流色譜儀主機(jī)，緩慢調(diào)整螺旋管轉(zhuǎn)速至1600r/min，同時(shí)以6ml/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡，將120mg前述油橄欖提取物溶解在6ml上、下相的混合溶液中，通過(guò)進(jìn)樣閥注入螺旋管中，設(shè)置儀器溫度為30℃。自動(dòng)餾分收集器接樣，3ml為一份，經(jīng)hplc檢測(cè)，合并含有橄欖苦苷的餾分，減壓濃縮后得到乳白色粉末。經(jīng)過(guò)核磁共振、質(zhì)譜鑒定即為橄欖苦苷，測(cè)定純度≥90％。整個(gè)實(shí)施過(guò)程的橄欖苦苷得率達(dá)到83.2％。
實(shí)施例2
1.樣品：取1kg油橄欖葉，加入12升80％(體積比)的乙醇，加熱回流提取2次，每次2h，將提取液合并后減壓回收乙醇，得到油橄欖葉提取物。
2.儀器：tbe-300b逆流色譜儀，中國(guó)上海同田生物技術(shù)有限公司。
3.制備方法：將正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水按照1:19:1:19(v:v)的比例充分混合均勻后放置在分液漏斗中靜置分層。將上、下相分別放出后超聲20min脫氣，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相。首先將固定相泵入逆流色譜儀螺旋管中，流速20ml/min，待螺旋管完全充滿固定相后，開(kāi)啟逆流色譜儀主機(jī)，緩慢調(diào)整螺旋管轉(zhuǎn)速至950r/min，同時(shí)以1.5ml/min的流速泵入流動(dòng)相。當(dāng)螺旋管尾端流出流動(dòng)相，系統(tǒng)達(dá)到平衡，將400mg前述甘肅棘豆總生物堿樣品溶解在20ml上、下相的混合溶液中，通過(guò)進(jìn)樣閥注入螺旋管中，設(shè)置恒溫水浴為25℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，自動(dòng)餾分收集器接樣，5ml為一份，hplc檢測(cè)，合并含有橄欖苦苷的餾分，減壓濃縮后得到乳白色粉末。經(jīng)過(guò)核磁共振、質(zhì)譜鑒定即為橄欖苦苷，測(cè)定純度≥90％。整個(gè)實(shí)施過(guò)程的橄欖苦苷得率達(dá)到82.6％。