本發(fā)明屬于特色民族藥用植物中的有效成分提取分離以及活性篩選的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種異苯并呋喃類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）是唇型科中的小型灌木，原產(chǎn)于歐洲南部和地中海地區(qū)，現(xiàn)在在法國、西班牙、葡萄牙和匈牙利等地進(jìn)行商業(yè)種植。薰衣草廣泛使用于香料和化妝品的制作生產(chǎn)，它是香料和醫(yī)藥工業(yè)中有名的芳香植物，其治療用途可以追溯到古羅馬人和希臘人時(shí)期。先前有關(guān)該屬植物的研究中，顯示了該屬植物含有許多生物活性化合物，包括類黃酮、內(nèi)酯、香豆素和萜類化合物等。特別是其中一些顯示出了抗氧化、抑真菌、抗病毒等細(xì)胞活性。本發(fā)明從薰衣草中分離得到兩個(gè)新的具有一定的細(xì)胞毒活性和抗煙草花葉病毒活性的異苯并呋喃類化合物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是提供1個(gè)新的異苯并呋喃類化合物；第二目的在于提供所述異苯并呋喃類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述異苯并呋喃類化合物在制備抗癌和抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的1個(gè)異苯并呋喃類化合物是從唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）干燥的整株植物中分離得到，命名為lavandulactonesc（分子式：c14h14o4），具有下述結(jié)構(gòu)：。本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的異苯并呋喃類化合物的制備方法，其特征在于異苯并呋喃類化合物是以唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）干燥的整株植物為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、mci脫色、硅膠柱層析、高效液相色譜分離步驟而得到，具體為：a、浸膏提?。簩⒏稍锏拇叫慰妻挂虏輰僦参镛挂虏荩╨avandulaangustifoliamiller）的整株植物20～40目粉碎，用有機(jī)溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮沉淀物，再用乙酸乙酯萃取濃縮的沉淀物，萃取液濃縮成浸膏a；b、mci脫色：浸膏a，用重量比2~5倍量的甲醇水溶解，上mci柱，用90%甲醇水洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮成浸膏b；c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重1~2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量6~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；d、將9:1洗脫部分再次用體積比為9:1~1:2混合有機(jī)溶劑洗脫；e、高效液相色譜分離：以55-60%的甲醇-水為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為210~300nm，每次進(jìn)樣10~100l，收集10~50min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc。其中a步驟所用的有機(jī)溶劑為90%乙醇；b步驟所用的有機(jī)溶劑為90%甲醇；c步驟所述的混合有機(jī)溶劑為氯仿和丙酮的體積比配比為20:1，9:1，8:2，7:3，6:4和1:1。d步驟所用的混合有機(jī)溶劑石油醚和丙酮的體積配比為9:1，8:2，7:3，6:4，1:1和1:2。本發(fā)明1個(gè)新的異苯并呋喃類化合物結(jié)構(gòu)是通過核磁共振和質(zhì)譜測定方法確定，并表征其具體結(jié)構(gòu)為：。本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的異苯并呋喃類化合物在制備抗癌和抗煙草花葉病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的1個(gè)新異苯并呋喃類化合物經(jīng)對(duì)抗煙草花葉病毒的實(shí)驗(yàn)，lavandulactonesc的相對(duì)抑制率在20μm下達(dá)到33.4％，高于陽性對(duì)照品南寧霉素的相對(duì)抑制率（28.6%），說明lavandulactonesc具有一定的抗煙草花葉病毒活性。此外，本發(fā)明的1新異苯并呋喃類化合物對(duì)白血病急性早幼粒nb4細(xì)胞、肺腺癌a549細(xì)胞、人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤shsy5y細(xì)胞、人前列腺癌pc3細(xì)胞、人乳腺癌mcf7細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測試，異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc對(duì)nb4、a549、shsy5y、pc3和mcf7細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性，ic50值分別達(dá)4.3，3.6，2.4，5.1和5.0μm。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎活性好，可作為抗癌和抗煙草花葉病毒藥物的先導(dǎo)性化合物，在藥物發(fā)現(xiàn)方面有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為本發(fā)明化合物lavandulactonesc的核磁共振碳譜（13cnmr）；圖2為本發(fā)明化合物lavandulactonesc的核磁共振氫譜（1hnmr）。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述1個(gè)異苯并呋喃類化合物是從唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）干燥的整株植物中分離得到，命名為lavandulactonesc（分子式：c14h14o3），具有下述結(jié)構(gòu)：。其特征在于異苯并呋喃類化合物是以唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）干燥的整株植物為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、mci脫色、硅膠柱層析、高效液相色譜分離步驟而得到具體為：a、浸膏提?。簩⒋叫慰妻挂虏輰僦参镛挂虏荩╨avandulaangustifoliamiller）的整株植物20～40目粉碎，用有機(jī)溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮沉淀物，再用乙酸乙酯萃取濃縮的沉淀物，萃取液濃縮成浸膏a；b、mci脫色：浸膏a，用重量比2~5倍量的甲醇水溶解，上mci柱，用90%甲醇水洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮成浸膏b；c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重1~2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量6~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；d、將9:1洗脫部分再次用體積比為9:1~1:2混合有機(jī)溶劑洗脫；e、高效液相色譜分離：以55-60%的甲醇-水（9:1洗脫部分）為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為210~300nm，每次進(jìn)樣10~100ml，收集10~50min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc。其中a步驟所用的有機(jī)溶劑為90%乙醇；b步驟所用的有機(jī)溶劑為90%甲醇；c步驟所述的混合有機(jī)溶劑為氯仿和丙酮的體積比配比為20:1，9:1，8:2，7:3，6:4和1:1。d步驟所用的混合有機(jī)溶劑石油醚和丙酮的體積配比為9:1，8:2，7:3，6:4，1:1和1:2。本發(fā)明所述的薰衣草植物不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。實(shí)施例1取干燥的唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）的整株植物5.2kg，粗粉碎至40目，用95%的乙醇超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濾液再用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮成182g的浸膏a；浸膏a用mci裝柱，在浸膏a中加入150g的80%甲醇水溶解，用90%甲醇水2～4l洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到80.6g浸膏c，浸膏c中加60g丙酮，然后加入100目硅膠60g拌樣，拌樣后，用200目硅膠500g裝柱；用體積比分別為20:1，9:1，8:2，7:3，6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f。其中對(duì)收集到的樣品b部分（9：1）25.6g，再重復(fù)硅膠柱層析，用相同體積比的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑洗脫，其中第c3部分，即7:3部分約450mg，再以55%的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50ml，分別收集25min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc。實(shí)施例2取干燥的唇形科薰衣草屬植物薰衣草（lavandulaangustifoliamiller）的整株植物11kg,粗粉碎至40目，用95%的乙醇超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濾液再用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮成370g的浸膏a；浸膏a用mci裝柱，在浸膏a中加入320g的80%甲醇水溶解，用90%甲醇水3～8l洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮得到170g浸膏c，浸膏c中加135g丙酮，然后加入100目硅膠140g拌樣，拌樣后，用200目硅膠1200g裝柱；用體積比分別為20:1，9:1，8:2，7:3，6:4和1:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f。其中，對(duì)收集到的樣品b部分（9:1）55g，再重復(fù)硅膠柱層析，用相同體積比的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑洗脫，其中第c3部分，即7:3部分約950mg，再以60%的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2′250mm，5mm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50ml，分別收集15min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc。實(shí)施例3取實(shí)施例1制備的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc，為淺黃色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)；（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），lmax(loge)：316(3.32)，282(3.64)，212(4.08)nm；（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）nmax：2936，1720，1612，1563，1448，1360，1246，1168，1059，920，857cm-1；（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z269.0782[m+na]+（計(jì)算值為269.0790），結(jié)合13c和1hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見表1）給出其分子式為c14h14o4，其不飽和度為8。1hnmr（cdcl3，500mhz）和13cnmr（cdcl3，125mhz）數(shù)據(jù)，見表1。表1化合物lavandulactonesc的1h和13cnmr數(shù)據(jù)（溶劑為cdcl3）(500and125mhz)實(shí)施例4取實(shí)施例2制備的異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc分別按實(shí)施例3中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例3，分子式為c14h14o4。實(shí)施例5取實(shí)施例1和2所制備的異苯并呋喃類化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒活性檢測試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：采用半葉法，在藥劑的質(zhì)量濃度為50mg/l時(shí)對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒性測定。在5～6齡烤煙的植株上，選取適用于測試的葉片（葉行正常，無病無蟲），先將葉片均勻撒上細(xì)金剛砂，用毛筆將備用的煙草花葉病毒源（3.0×10-3）均勻抹在撒有細(xì)金剛砂的葉片上，待所有中選的葉片接毒結(jié)束后，立即放在盛有藥液的培養(yǎng)皿中處理20min，取出，擦去葉片上水珠和藥液，將兩個(gè)半葉復(fù)原排放在鋪有衛(wèi)生紙保濕金的玻璃缸中，并蓋上玻璃蓋，控溫（23±2）℃，放在室溫自然光照射，2～3d即可見枯斑，每個(gè)處理都設(shè)另一半葉為對(duì)照，另外設(shè)有1組為商品南霉素的處理作為對(duì)比，按下列公式計(jì)算相對(duì)抑制率：xi％=(ck-t)/ck×100％x：相對(duì)抑制率（％），ck：浸泡于清水中半片接毒葉的枯斑數(shù)（個(gè)），t：浸泡于藥液中半片接毒葉的枯斑數(shù)（個(gè)）；經(jīng)對(duì)抗煙草花葉病毒的實(shí)驗(yàn)，lavandulactonesc的相對(duì)抑制率在20μm下達(dá)到33.4%，高于陽性對(duì)照品南寧霉素的相對(duì)抑制率（28.6%），說明lavandulactonesc具有一定的抗煙草花葉病毒活性。實(shí)施例6取實(shí)施例1和2所制備的異苯并呋喃類化合物進(jìn)行抗煙草花葉病毒活性檢測試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：細(xì)胞株：白血病細(xì)胞(nb4)、肺癌細(xì)胞(a549)、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(shsy5y)、前列腺癌細(xì)胞(pc3)、乳腺癌細(xì)胞(mcf7)均由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以上細(xì)胞與不同濃度化合物溫育72小時(shí)，每株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)一次，用兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用改良mtt法及srb法評(píng)價(jià)化合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制程度，計(jì)算抑制率，根據(jù)抑制率采用logit方法計(jì)算ic50，比較化合物的體外抗腫瘤活性；細(xì)胞的增殖抑制率=(空白對(duì)照od值-加藥孔的od值)/空白對(duì)照od值×100%。(a)改良mtt法取處于對(duì)數(shù)生長期的懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104/ml，加入96孔培養(yǎng)板，90μl/孔。陽性對(duì)照為順鉑，用生理鹽水溶解。每孔分別加入10μl不同濃度的樣品(1號(hào)試液-5號(hào)試液)。加樣組及對(duì)照組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，加樣組、陽性對(duì)照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔，每塊板均設(shè)有4個(gè)空白對(duì)照孔(僅加培養(yǎng)基)。樣品的終濃度分別為10-2、10-1、1、10及102μg/ml，相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。樣品在終濃度102μg/ml時(shí)，用0.1%dmso作為溶劑對(duì)照，其余濃度均用生理鹽水作陰性對(duì)照。陽性對(duì)照藥順鉑的終濃度為10-1、1、10μg/ml。細(xì)胞在37℃,5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育48h后，加入mtt(5mg/ml,sigma)，10μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入三聯(lián)液[10%sds–5%異丁醇–0.012mol/lhcl(w/v/v)]，100μl/，放置過夜后用酶標(biāo)儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的od值。(b)srb法取處于對(duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞株，用25%胰酶常規(guī)消化后，再用15%小牛血清完全rpmi-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104/ml，加入96孔培養(yǎng)板，90μl/孔。細(xì)胞在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育24h后加入陽性對(duì)照、陰性對(duì)照以及受試樣品(各受試濃度同上mtt法，10μl/孔)，樣品的終濃度分別為10-2、10-1、1、10、102μg/ml，相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。樣品在終濃度102μg/ml時(shí)用0.1%dmso作為溶劑對(duì)照，其余濃度均用生理鹽水作陰性對(duì)照。陽性對(duì)照藥的終濃度為10-1、1、10μg/ml，陰性對(duì)照為等體積的生理鹽水。加樣組及對(duì)照組均設(shè)4復(fù)孔，加樣組、陽性對(duì)照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔，每塊板均設(shè)有4個(gè)空白對(duì)照孔(僅加培養(yǎng)基)。將96孔培養(yǎng)板置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中孵育(細(xì)胞與樣品作用)48h后，加入4℃、50%的tca(三氯乙酸)50μl/孔。加完tca后，將96孔培養(yǎng)板置于4℃孵育1小時(shí)，取出培養(yǎng)板，輕輕傾去板內(nèi)液體。用自來水輕輕沖洗5遍(將自來水由燒杯中輕輕倒入板中，輕晃后再將水倒去)，置于空氣中風(fēng)干至不見水痕。然后加入配制好的0.4%srb(用1%乙酸稀釋)，50μl/，于室溫下靜置染色30分鐘后傾去srb溶液，用1%乙酸沖洗4遍，以除去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料。置于空氣中風(fēng)干至無水痕后，加入10mm未緩沖tris(緩血氨酸)溶液150μl/孔(ph10,用三蒸水配制)，將染料溶解后，于振蕩器上振蕩5分鐘，用酶標(biāo)儀在570nm波長下讀取各孔o(hù)d值。(c)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)對(duì)白血病急性早幼粒nb4細(xì)胞、肺腺癌a549細(xì)胞、人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤shsy5y細(xì)胞、人前列腺癌pc3細(xì)胞、人乳腺癌mcf7細(xì)胞的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)，異苯并呋喃類化合物lavandulactonesc對(duì)nb4、a549、shsy5y、pc3和mcf7細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性，ic50值分別達(dá)4.3，3.6，2.4，5.1，和5.0μm；表2兩個(gè)新異苯并呋喃類化合物的細(xì)胞毒活性compoundsnb4a549shsy5ypc3mcf7紫杉醇0.030.020.10.10.05lavandulactonesc4.33.62.45.15.0當(dāng)前第1頁12