本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)秦川牛gbp2基因拷貝數(shù)變異的方法，該方法利用基因組dna實(shí)時(shí)定量pcr，以btf3基因?yàn)閰⒄眨鶕?jù)2^-δδct值從而確定個(gè)體的拷貝數(shù)變異。

背景技術(shù)：

隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，動(dòng)物遺傳育種的理論和技術(shù)也發(fā)生了重大的變化，肉牛的育種也由傳統(tǒng)的常規(guī)表型選育轉(zhuǎn)向分子選育，目前，分子育種的研究主要集中在標(biāo)記輔助選擇(molecularmark-assistselection,mas)，該技術(shù)是通過dna分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良。在畜禽育種中，通過對(duì)生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密關(guān)聯(lián)的dna標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。

拷貝數(shù)變異(copynumbervariations,cnvs)是指基因組中大于50bp的片段插入、缺失復(fù)制和復(fù)雜的重組的現(xiàn)象，是一種在基因組亞顯微水平上的結(jié)構(gòu)變異，可以通過劑量效應(yīng)、位置效應(yīng)、阻斷功能基因、融合基因、暴露隱性等位基因和潛在的躍遷效應(yīng)來影響基因的功能以及個(gè)體的表型。研究表明，有些cnv位點(diǎn)位于功能基因的內(nèi)部，與畜禽的生長(zhǎng)性狀有相關(guān)關(guān)系，或與qtl位點(diǎn)重合，對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀的一定影響。

目前，cnv常用的檢測(cè)方法主要分為兩類：一類主要用于在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)未知cnv，包括基因組芯片和高通量測(cè)序技術(shù)；另一類主要用于定點(diǎn)檢測(cè)或驗(yàn)證已知cnv。其中芯片方法主要包括比較基因組雜交芯片(comparativegenomichybridization,cgh)和snp芯片，在比較基因組芯片中寡核苷酸探針芯片因其具有高精度、高靈敏度、樣本需要量小等特點(diǎn)，被廣泛使用。snp芯片在檢測(cè)時(shí)不需要對(duì)照樣本，通過被檢測(cè)樣本內(nèi)snp信號(hào)強(qiáng)度來進(jìn)行分析。其主要優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)提供拷貝數(shù)和基因型信息，還可以顯示雜合性缺失。但是snp芯片上的探針在基因組分布不均衡，很多復(fù)雜區(qū)域探針設(shè)計(jì)困難。因此，snp芯片在檢測(cè)cnv時(shí)有一定的局限性。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的成熟，直接通過重測(cè)序來檢測(cè)基因組結(jié)構(gòu)變異已經(jīng)成為當(dāng)前最有效的檢測(cè)手段。與雜交技術(shù)相比，利用測(cè)序技術(shù)來檢測(cè)cnv具備很多優(yōu)勢(shì)：提高了cnv的分辨率；可以確定cnv的邊界；可以檢測(cè)出個(gè)體cnv的絕對(duì)拷貝數(shù)；對(duì)于結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜的cnv也有較高檢測(cè)效力，但這種方法成本較高。

對(duì)于已確定的cnv的檢測(cè)，通常是采用基于pcr技術(shù)和雜交技術(shù)的一些方法。例如qpcr、qmpsf、mlpa、fish、southernblotting和maph等。其中，實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr、qrt-pcr)最為常用。根據(jù)qrt-pcr所使用的熒光化學(xué)方法的不同，主要分為熒光染料嵌入法和熒光雜交探針法兩類。pcr反應(yīng)體系中加入過量的sybrgreen染料分子，能特異性地滲入dna雙鏈并發(fā)射熒光信號(hào)，而游離的染料分子則僅有很低的熒光本底，幾乎不發(fā)光，從而確保信號(hào)的增加與pcr產(chǎn)物的增加同步，可通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來反映基因組dna的數(shù)量。通過對(duì)目的基因(具有拷貝數(shù)變異)及參考基因(無拷貝數(shù)變異)進(jìn)行相對(duì)定量，根據(jù)2^-δδct方法統(tǒng)計(jì)檢測(cè)樣本候選基因的拷貝數(shù)。染料法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)成本低、無需設(shè)計(jì)合成探針、使用方便，可以檢測(cè)目的片段的絕對(duì)拷貝數(shù)，但不適用于大樣本的高通量檢測(cè)。

gbp2基因是gbp家族中的重要成員，其可結(jié)合包括鳥嘌呤核苷酸(gmp，gdp和gtp)的干擾素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)為gtp酶，將gtp水解為gdp，該蛋白質(zhì)可以起到鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物的作用。目前揭示的gbps家族成員的功能主要與細(xì)胞增殖和病原體感染有關(guān)。關(guān)于gbp2基因的功能在人和小鼠上做了一些研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控以及抗病性上有重要影響，但在牛上的報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)秦川牛gbp2基因cnv標(biāo)記的方法及其應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)秦川牛gbp2基因cnv標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

以秦川?；蚪Mdna為模板，以引物對(duì)gbp2-cnv1和引物對(duì)gbp2-cnv2以及引物對(duì)r1為引物，分別通過實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增gbp2基因的拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv1和cnv2以及作為內(nèi)參的btf3基因的部分片段，然后根據(jù)定量結(jié)果鑒定秦川牛gbp2基因的拷貝數(shù)變異類型；

所述的引物對(duì)gbp2-cnv1為：

上游引物f1：5’-ctctcaggcggtatcacagtcaatg-3’

下游引物r1：5’-tccttggcatcattagactctgtat-3’；

所述的引物對(duì)gbp2-cnv2為：

上游引物f2：5’-atgggcagcctggactatc-3’

下游引物r2：5’-ggttctccttggacgggtg-3’；

所述的引物對(duì)r1為：

上游引物f2：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’

下游引物r2：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。

所述的gbp2基因的拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv1位于gbp2基因參考基因組序列nc_007301.6的54593301位至54594300位，共999bp；拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv2位于gbp2基因參考基因組序列nc_007301.6的54636901位至54638000位，共1099bp。

所述的拷貝數(shù)變異類型是根據(jù)log22^-δδct將定量結(jié)果分為的三類：插入型，log22^-δδct>0.5；缺失型，log22^-δδct<-0.5；正常型，log22^-δδct≤|±0.5|。

所述的實(shí)時(shí)定量pcr所用的擴(kuò)增體系包括：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物對(duì)gbp2-cnv1、引物對(duì)gbp2-cnv2或引物對(duì)r1所對(duì)應(yīng)的上、下游引物各1μl以及2×sybrgreenqpcrmix6.25μl和ddh2o4.25μl。

所述的實(shí)時(shí)定量pcr所用的反應(yīng)程序?yàn)椋?)95℃預(yù)變性5min；2)95℃變性10s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。

基于引物對(duì)gbp2-cnv1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段大小為147bp，基于引物對(duì)gbp2-cnv2擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段大小為134bp，基于引物對(duì)r1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段大小為166bp。

上述檢測(cè)秦川牛gbp2基因cnv標(biāo)記的方法在秦川牛分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用。

所述拷貝數(shù)變異類型中，所述的拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv1上具有缺失型拷貝數(shù)變異類型的秦川牛個(gè)體在生長(zhǎng)性狀上較優(yōu)；拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv2上具有缺失型拷貝數(shù)變異類型的秦川牛個(gè)體在生長(zhǎng)性狀上較優(yōu)。

所述生長(zhǎng)性狀為十字部高、體長(zhǎng)、胸寬、尻長(zhǎng)、腰角寬、胸深、坐骨端寬、胸圍或體重中的至少一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供的秦川牛gbp2基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法，不受年齡的限制，可用于母牛的早期選育，甚至在剛出生時(shí)就可進(jìn)行選擇；

(2)檢測(cè)牛gbp2基因拷貝數(shù)變異的方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便；

(3)牛gbp2基因拷貝數(shù)變異的檢出，為牛生長(zhǎng)發(fā)育的分子標(biāo)記輔助選擇提供科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1為gbp2基因cnv及內(nèi)參基因btf3的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖1中：泳道1為引物gbp2-cnv1，泳道2為引物gbp2-cnv2，泳道3為引物r1，泳道5為marker1。

圖2為本發(fā)明中進(jìn)行qpcr繪制的擴(kuò)增曲線；

圖3是本發(fā)明中進(jìn)行qpcr繪制的溶解曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。

本發(fā)明利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr對(duì)秦川牛gbp2基因的拷貝數(shù)變異進(jìn)行檢測(cè)并用于分子育種，通常包括以下步驟：

(1)利用ncbi數(shù)據(jù)庫找到gbp2基因序列，再用primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并用普通pcr檢測(cè)引物；

(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)技術(shù)檢測(cè)候選位點(diǎn)在群體中的拷貝數(shù)變異情況，篩選到與秦川牛生長(zhǎng)性狀相關(guān)的cnv標(biāo)記；

(3)利用spss20.0軟件將拷貝數(shù)變異類型與秦川牛生長(zhǎng)性狀等進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；

(4)根據(jù)拷貝數(shù)變異類型進(jìn)行生長(zhǎng)性狀優(yōu)異的秦川牛選育。

1、牛樣本采集

本發(fā)明具體以66頭秦川牛作為檢測(cè)對(duì)象，其中66頭秦川牛的血樣樣本采集自陜西省秦川牛良種繁育中心(陜西省寶雞市扶風(fēng)縣段家鎮(zhèn))。

2、血樣基因組dna的提取

①冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，吸取500μl血液于1.5ml離心管中，加入等體積的磷酸緩沖液(pbs)混勻，溫和搖動(dòng)，4℃，12000r/min離心5min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈透明色。

②在離心管中加入dna抽提緩沖液500μl，輕輕吹打，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶k至5μl(20mg/ml)，并混勻，55℃水浴中消化過夜(16h左右)至絮狀沉淀不見，溶液澄清，尚未澄清的，可補(bǔ)加10μl蛋白酶k混勻繼續(xù)消化直至澄清。

④將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入500μltris飽和酚，溫和搖動(dòng)15min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管，重復(fù)上述步驟1次。

⑤加入氯仿500ml，溫和搖動(dòng)20min，使其充分混勻，4℃，12000r/min離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌的1.5ml離心管。

⑥加入氯仿、異戊醇混合液(體積比24:1)500ml，充分混合20min，4℃，12000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中。

⑦加入0.1倍體積的naac緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出。

⑧4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

⑨4℃，12000r/min離心10min，棄上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。

⑩干燥后的dna中加入80～100μl的te溶解，4℃保存直至dna完全溶解，利用紫外分光光度儀泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80℃保存。

3、目標(biāo)序列及參考序列的擴(kuò)增

以ncbi數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛gbp2基因序列(genbankaccessionno.nc_007301.6)為參考序列，以牛gbp2基因候選區(qū)域chr3:54579273-54670347為候選位點(diǎn)，利用primer5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物對(duì)檢測(cè)gbp2基因拷貝數(shù)變異，其引物對(duì)序列信息如表1所示(拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv1位于gbp2基因參考基因組序列nc_007301.6的54593301位至54594300位，共999bp；拷貝數(shù)變異位點(diǎn)cnv2位于gbp2基因參考基因組序列nc_007301.6的54636901位至54638000位，共1099bp)。通過繪制擴(kuò)增曲線(圖2)和溶解峰來確定引物是否適用于qpcr分析。根據(jù)繪制的溶解曲線，各樣品曲線吻合在一起，且曲線走勢(shì)平滑，峰高且尖，無引物二聚體或非特異擴(kuò)增引起的雜峰(圖3)。

表1.實(shí)時(shí)熒光定量pcr的引物信息

其中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用的擴(kuò)增體系以12.5μl計(jì)為：10ng/μl模板dna(提取自血樣樣本的基因組dna)1μl，10pmol/l的上、下游引物各0.5μl，2×sybrgreenqpcrmix6.25μl，ddh2o4.25μl。

pcr擴(kuò)增：(1)預(yù)變性：95℃5min；(2)擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性10s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；(3)繪制溶解曲線：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

參見圖1，基于引物對(duì)gbp2-cnv1擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段大小為147bp，基于引物對(duì)gbp2-cnv2擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物片段大小為134bp，內(nèi)參序列為已知的不存在拷貝數(shù)變異的序列，即btf3基因中的一段166bp的序列。

4、拷貝數(shù)變異的推斷

每個(gè)樣品分別用目標(biāo)序列和參考序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且每對(duì)引物3個(gè)重復(fù)。根據(jù)2^-δδct方法進(jìn)行拷貝數(shù)的分析。其中δδct＝(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。ct即cyclethreshold，為pcr擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)組即為待檢測(cè)有無cnvs的樣本，對(duì)照組即為已知無拷貝數(shù)變異的樣本。2^-δδct表示的是實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)序列的拷貝數(shù)相對(duì)與對(duì)照組的倍數(shù)。然后將基因的表達(dá)豐度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化(以2為底2^-δδct的對(duì)數(shù))使之符合正態(tài)分布，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)各組間的差異。

當(dāng)目標(biāo)序列為正常型(median)序列時(shí)，根據(jù)2^-δδct計(jì)算出歸一化值為0左右(log22^-δδct≤|±0.5|)。當(dāng)目標(biāo)序列為缺失型(loss)序列時(shí)，log22^-δδct計(jì)算出歸一化值log22^-δδct<-0.5。當(dāng)目標(biāo)序列為插入型(gain)序列時(shí)，log22^-δδct計(jì)算出歸一化值log22^-δδct>0.5。

5、gbp2基因cnv1和cnv2位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

生產(chǎn)數(shù)據(jù)(生長(zhǎng)性狀)：體高(最終分析結(jié)果為無關(guān)聯(lián))、十字部高、體長(zhǎng)、胸寬、尻長(zhǎng)、腰角寬、胸深、坐骨端寬、胸圍、體重。

關(guān)聯(lián)分析模型：先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用spss20軟件分析各基因型間的生產(chǎn)性狀效應(yīng)。在對(duì)基因型效應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)采用了固定模型：

yijk＝μ+ai+cnvj+eijk

其中：yijk為性狀觀察值，μ為總體均值，ai為第i頭個(gè)體的年齡，cnvj為第j個(gè)拷貝數(shù)變異類型的固定效應(yīng)，eijk為隨機(jī)誤差。各組數(shù)據(jù)間的差異性采用lsd多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以mean±se形式表示，參見表2和表3。

表2.秦川牛gbp2基因cnv1拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

表3.秦川牛gbp2基因cnv2拷貝數(shù)變異與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

注：表2、3中，平均值肩標(biāo)上具有相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，平均值肩標(biāo)上字母不同表示差異顯著(p<0.05)。^*p<0.05。括號(hào)里面的數(shù)值表示拷貝數(shù)類型的頻率。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明(見表2、3)：cnv1上具有缺失型拷貝數(shù)變異類型的秦川牛個(gè)體在生長(zhǎng)性狀上較優(yōu)。cnv2上具有缺失型拷貝數(shù)變異類型的秦川牛個(gè)體在生長(zhǎng)性狀上較優(yōu)。說明gbp2基因兩個(gè)cnv位點(diǎn)都可以作為一個(gè)提高秦川牛生長(zhǎng)性狀的候選分子遺傳標(biāo)記。

6、上述cnv標(biāo)記在牛選育中的應(yīng)用

獲得的cnv可作為候選分子遺傳標(biāo)記，尋找與其相關(guān)或緊密連鎖的影響牛生長(zhǎng)性狀的數(shù)量性狀基因座，以對(duì)秦川牛進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，從而加快秦川牛品種改良的選育進(jìn)程。

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種檢測(cè)秦川牛gbp2基因cnv標(biāo)記的方法及其應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ctctcaggcggtatcacagtcaatg25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

tccttggcatcattagactctgtat25

<210>3

<211>19

<212>dna

<400>3

atgggcagcctggactatc19

<210>4

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<212>dna

<213>人工合成

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ggttctccttggacgggtg19

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<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

aaccaggagaaactcgccaa20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

ttcggtgaaatgccctctcg20