本發(fā)明涉及人類疾病分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)型糖尿病相關(guān)基因kcnip1拷貝數(shù)變異的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

拷貝數(shù)變異（copynumbervariation，cnv）是基因組dna上一種亞顯微水平的結(jié)構(gòu)變異，涉及的基因組序列大小從1kb到多個(gè)mb，包括拷貝數(shù)增加（copynumbergain）和拷貝數(shù)減少（copynumberloss）。人類基因組中存在廣泛的拷貝數(shù)變異，大部分cnv區(qū)域?qū)儆赿na序列多態(tài)性范疇，是構(gòu)成人類基礎(chǔ)表型多樣性的分子基礎(chǔ)，有些cnv并不引起任何表型變化。然而，還有一些cnv能夠擾亂功能基因的結(jié)構(gòu)，影響基因表達(dá)，最終引起人類復(fù)雜疾病的發(fā)生。因此，鑒定出與疾病密切相關(guān)的cnv位點(diǎn)，對(duì)于疾病的篩查和診斷至關(guān)重要，具有重大的應(yīng)用價(jià)值。

目前，cnv的檢測(cè)技術(shù)主要包括：比較基因組雜交芯片（acgh），該技術(shù)是將未知樣品與對(duì)照樣品的基因組dna進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)差異在染色體或染色體亞帶水平上發(fā)現(xiàn)cnv。但是，acgh技術(shù)的靈敏度在mb水平，對(duì)mb以下的小片段cnv則無法檢出。此外，該技術(shù)操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本昂貴，且需要的模板dna量大，不利于大范圍推廣。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（mlpa），該技術(shù)是2002年發(fā)展起來的一種cnv檢測(cè)方法，其相對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確度高，但該技術(shù)操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，探針制備過程也較為復(fù)雜。mlpa后期分析是通過毛細(xì)管電泳，通量較低且成本較高，另外操作過程種容易造成pcr產(chǎn)物的污染。高分辨熔解曲線分析（hrm），該技術(shù)是2003年發(fā)展起來的，其技術(shù)核心是通過準(zhǔn)確的控制變溫速率，根據(jù)核酸染料的指示，研究pcr產(chǎn)物的熔解溫度，進(jìn)而分析拷貝數(shù)變異。hrm技術(shù)具有快速、廉價(jià)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，然而該技術(shù)還存在如下缺點(diǎn)，首先由于其研究對(duì)象為雜合位點(diǎn)，大大增加了實(shí)驗(yàn)成本和設(shè)計(jì)難度。同時(shí)，微小差異的發(fā)生對(duì)熔解曲線的影響較小，有的甚至不會(huì)引起任何偏移，嚴(yán)重降低該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度。實(shí)時(shí)熒光定量pcr（qpcr），該技術(shù)核心是在pcr反應(yīng)體系中加入sybrgreen熒光染料，pcr擴(kuò)增過程中，染料分子能夠特異性地滲入雙鏈dna中并發(fā)射熒光信號(hào)，而未結(jié)合dna的sybrgreen不發(fā)射熒光，因此，實(shí)驗(yàn)中采集到的熒光信號(hào)與pcr產(chǎn)物的增加呈正相關(guān)，可通過檢測(cè)sybrgreen的熒光強(qiáng)度反映模板dna的含量。采用qpcr技術(shù)進(jìn)行cnv檢測(cè)時(shí)，對(duì)目的片段（候選cnv區(qū)域）及參考基因（單拷貝）分別定量，然后根據(jù)log22^?δδct值（參照高通量技術(shù)的計(jì)算原則）確定所有待測(cè)樣本的拷貝數(shù)變異情況。該技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)成本低、無需設(shè)計(jì)合成探針、操作簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，但不適用于大量樣本的高通量檢測(cè)。

糖尿病被認(rèn)為是世界上第五大嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中90%為非胰島素依賴型糖尿病，又稱為型糖尿病。該病屬于復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是遺傳和環(huán)境互作的結(jié)果，其中遺傳多態(tài)性可能是影響個(gè)體間疾病易感性的主要因素。由于型糖尿病的早期臨床癥狀不明顯，往往使患者延誤最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，對(duì)人類基因組中與型糖尿病相關(guān)的變異位點(diǎn)進(jìn)行探索和鑒定，將有利于該疾病的早期篩查和診斷，及時(shí)控制病程的進(jìn)展。

kv通道蛋白1（kcnip1）基因，是kcnip家族成員之一。kcnip1蛋白通過與下游靶基因的調(diào)控元件直接結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控其表達(dá)，在調(diào)控胰腺β細(xì)胞胰島素分泌過程中發(fā)揮了重要作用。lee等研究發(fā)現(xiàn)敲除kcnip1基因能夠影響β細(xì)胞的復(fù)極化，促進(jìn)胰島素分泌（leehs，moon，s，yun，jhetal.genome-widecopynumbervariationstudyrevealskcnip1asamodulatorofinsulinsecretion.genomics2014;104:113-120.）。由此可見，kcnip1基因可能與糖尿病的發(fā)生有關(guān)。高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)kcnip1基因序列中存在1854bp的拷貝數(shù)變異，我們推測(cè)該cnv可能造成個(gè)體間糖尿病的易感性差異。然而，目前尚未見kcnip1基因cnv影響型糖尿病相關(guān)臨床指征的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，研究kcnip1基因cnv與型糖尿病的關(guān)系，并鑒定出易感基因型，可以為型糖尿病的臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)，具有重大的實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于鑒定一種與型糖尿病易感性相關(guān)的cnv標(biāo)記，并提供該cnv標(biāo)記的檢測(cè)方法，以此作為臨床指標(biāo)，應(yīng)用于型糖尿病的早期篩查和診斷。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種ii型糖尿病相關(guān)基因kcnip1拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因組dna為模板，以引物對(duì)p1（f1、r1）和p2（f2、r2）為引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr分別擴(kuò)增kcnip1基因cnv區(qū)域和內(nèi)參基因rnasep，根據(jù)定量結(jié)果分析kcnip1基因cnv在糖尿病患者和正常人中的分布差異，鑒定出該位點(diǎn)在糖尿病患者中的易感基因型。

本發(fā)明的所述與型糖尿病易感性相關(guān)的cnv標(biāo)記，是指kcnip1基因候選區(qū)域chr5q35.1:170062275–170064128的拷貝數(shù)變異。具體地，所述的cnv標(biāo)記位于人kcnip1基因（genbankaccessionnc_000005.9）所示序列的281784bp-283637bp區(qū)域內(nèi)，根據(jù)log22^?δδct將kcnip1基因cnv區(qū)域分為三種基因型：log22^?δδct>0.5則為插入型；log22^?δδct<-0.5則為缺失型，log22^?δδct≤|±0.5|則為正常型。

本發(fā)明還提供用于檢測(cè)與型糖尿病相關(guān)的cnv標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物信息如表1所示：

表1實(shí)時(shí)熒光定量pcr的引物信息

本發(fā)明所述的用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的前述與型糖尿病相關(guān)的cnv標(biāo)記試劑盒包括2×sybrgreenqpcrmix和去離子水。

本發(fā)明還提供所述的kcnip1基因cnv標(biāo)記在型糖尿病的早期篩查和診斷中的應(yīng)用。

前述的應(yīng)用是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

（1）提取待測(cè)型糖尿病患者和正常人的基因組dna；

（2）以上述提取的基因組dna為模版，利用表1中的引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)kcnip1基因的cnv位點(diǎn)；

（3）以正常人為對(duì)照，根據(jù)log22^?δδct值確定型糖尿病患者的cnv基因型，如果拷貝數(shù)為插入型，則待測(cè)個(gè)體對(duì)糖尿病更易感，患病癥狀更嚴(yán)重，而缺失型個(gè)體則相反。

步驟（2）中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用的擴(kuò)增體系以20μl計(jì)為：50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去離子水7μl。

步驟（2）中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量所用的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?imgfile="660745dest_path_image007.gif"wi="20"he="20"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>預(yù)變性95℃15s；擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性10s，60℃退火30s，39個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

所述的應(yīng)用包括以下步驟：

（1）采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)候選的kcnip1基因cnv位點(diǎn)在型糖尿病患者和正常人中的拷貝數(shù)變異情況，鑒定出與型糖尿病易感性相關(guān)的cnv基因型；

（2）利用spss20.0軟件將拷貝數(shù)變異類型與空腹血糖、糖化血紅蛋白等型糖尿病相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；

（3）根據(jù)拷貝數(shù)變異類型進(jìn)行型糖尿病的篩查和臨床診斷。

本發(fā)明的實(shí)施案例中，以人kcnip1基因chr5q35.1:170062275–170064128區(qū)域?yàn)楹蜻x位點(diǎn)，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)該位點(diǎn)在型糖尿病患者和正常人中的拷貝數(shù)變異情況，并分析該cnv在兩個(gè)群體中的分布差異，同時(shí)將cnv不同基因型與空腹血糖、糖化血紅蛋白等型糖尿病臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析；如果檢測(cè)kcnip1基因候選位點(diǎn)的拷貝數(shù)為插入型，則待測(cè)個(gè)體對(duì)糖尿病更易感，患病癥狀更嚴(yán)重，如果拷貝數(shù)為缺失型，待測(cè)個(gè)體的糖尿病癥狀較輕。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的kcnip1基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且不受檢測(cè)dna模板量的限制，可對(duì)微量樣品進(jìn)行cnv檢測(cè)。

kcnip1基因在調(diào)控胰島素合成和分泌過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，將kcnip1基因的cnv位點(diǎn)與型糖尿病的臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素水平等受到顯著影響，因此，kcnip1基因的chr5q35.1:170062275–170064128拷貝數(shù)變異位點(diǎn)可以作為型糖尿病早期篩查和診斷的分子標(biāo)記。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)kcnip1基因cnv在ii型糖尿病患者（t2d）和正常人（control）基因組中的分布情況。

圖2為kcnip1基因拷貝數(shù)與糖尿病患者空腹血糖、糖化血紅蛋白的相關(guān)性分析。

圖3為kcnip1基因3種拷貝數(shù)變異型與ogtt實(shí)驗(yàn)中的血糖、胰島素水平的比較分析。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。若未特別指明，均按照常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商說明書建議的條件。

一種ii型糖尿病相關(guān)基因kcnip1拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因組dna為模板，以引物對(duì)p1（f1、r1）和p2（f2、r2）為引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr分別擴(kuò)增kcnip1基因cnv區(qū)域和內(nèi)參基因rnasep，根據(jù)定量結(jié)果分析kcnip1基因cnv在糖尿病患者和正常人中的分布差異，鑒定出該位點(diǎn)在糖尿病患者中的易感基因型。

其中所述的cnv標(biāo)記是指人kcnip1基因（genbank:nc_000005.9）候選區(qū)域chr5q35.1:170062275–170064128的拷貝數(shù)變異；所述的拷貝數(shù)變異位點(diǎn)根據(jù)log22^?δδct值可分為3種基因型：插入型（log22^?δδct>0.5）；缺失型（log22^?δδct<-0.5）；正常型（log22^?δδct≤|±0.5|）；所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑包括2×sybrgreenqpcrmix和去離子水；所述的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物對(duì)p1和p2序列信息見表1：

表1實(shí)時(shí)熒光定量pcr的引物信息

本發(fā)明檢測(cè)方法中kcnip1基因cnv位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于ii型糖尿病的篩查和診斷時(shí)，具體包括以下步驟：

（1）提取ii型糖尿病患者和正常人的血液基因組dna；

（2）以上述基因組dna為模版，利用權(quán)利要求4中的引物對(duì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)kcnip1基因cnv；

（3）根據(jù)kcnip1基因cnv的檢測(cè)結(jié)果，如果拷貝數(shù)為插入型，則待測(cè)個(gè)體對(duì)糖尿病更易感，患病癥狀更嚴(yán)重，而缺失型個(gè)體則相反。

其中，所述步驟（2）中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用的擴(kuò)增體系為20μl，包含50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去離子水7μl。

其中，所述步驟（2）中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用的反應(yīng)程序?yàn)椋?imgfile="957286dest_path_image007.gif"wi="21"he="20"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>預(yù)變性95℃15s；擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性10s，60℃退火30s，39個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min

本發(fā)明利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr對(duì)ii型糖尿病相關(guān)基因kcnip1的cnv進(jìn)行檢測(cè)時(shí)步驟如下：

1、血液樣本采集

本發(fā)明具體以ii型糖尿病患者和正常個(gè)體作為檢測(cè)對(duì)象，126個(gè)ii型糖尿病患者的血液樣本采自武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院內(nèi)分泌科，100個(gè)正常人血液樣本采自武漢大學(xué)校醫(yī)院體檢科。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是經(jīng)過武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2、基因組dna的分離、提取、純化

參考文獻(xiàn)sambrocketal(2002)方法。

3、cnv序列及參考序列的擴(kuò)增

以ncbi數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的人kcnip1基因序列（genbankaccessionnc_000005.9）為參考序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物檢測(cè)kcnip1基因拷貝數(shù)變異，擴(kuò)增片段大小為101bp。內(nèi)參序列為已知的不存在拷貝數(shù)變異的序列，即rnasep基因中的一段122bp的序列。引物對(duì)序列信息如表1所示。

其中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr所用的擴(kuò)增體系以20μl計(jì)為：50ng/μl模板dna1μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，2×sybrgreenqpcrmix10μl，去離子水7μl。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?imgfile="769887dest_path_image007.gif"wi="21"he="20"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>預(yù)變性95℃15s；擴(kuò)增反應(yīng)：95℃變性10s，60℃退火30s，39個(gè)循環(huán)；繪制溶解曲線：95℃5s，-0.01℃/s，65℃1min。

4、拷貝數(shù)變異分析

每個(gè)待測(cè)樣品分別用目標(biāo)序列和參考序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)。根據(jù)2^?δδct方法進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析。其中δδct=(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(ct目的基因-ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組即為待檢測(cè)有無cnv的樣本，對(duì)照組即為已知無拷貝數(shù)變異的樣本。2^?δδct表示的是實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)序列的拷貝數(shù)相對(duì)與對(duì)照組的倍數(shù)。然后將基因的拷貝豐度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化（以2為底2^?δδct的對(duì)數(shù)）使之符合正態(tài)分布，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)各組間的差異。

當(dāng)cnv位點(diǎn)為正常型時(shí)，根據(jù)log22^?δδct計(jì)算出歸一化值接近0，即log22^?δδct≤|±0.5|；當(dāng)cnv為缺失型時(shí)，log22^?δδct計(jì)算出歸一化值log22^?δδct<-0.5；當(dāng)cnv為插入型時(shí)，log22^?δδct計(jì)算出歸一化值log22^?δδct>0.5。

kcnip1基因拷貝數(shù)在ii型糖尿病患者（t2d，n=126）和正常個(gè)體（control，n=100）中的分布情況如圖1所示，該cnv在兩個(gè)群體中分布呈極顯著差異（p<0.01），拷貝數(shù)插入型在ii型糖尿病患者中屬于優(yōu)勢(shì)基因型，而拷貝數(shù)正常型在正常人中屬于優(yōu)勢(shì)基因型。

5、kcnip1基因cnv位點(diǎn)與ii型糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

（1）kcnip1基因不同拷貝數(shù)與空腹血糖、糖化血紅蛋白相關(guān)性分析

首先，確定ii型糖尿病患者的kcnip1基因cnv位點(diǎn)的拷貝數(shù)目，將拷貝數(shù)的變化與對(duì)應(yīng)的空腹血糖、糖化血紅蛋白水平進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，結(jié)果如圖2所示，kcnip1基因的拷貝數(shù)與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平均呈正相關(guān)（p<0.05），拷貝數(shù)越大，其臨床癥狀越明顯。

（2）kcnip1基因cnv位點(diǎn)與血糖、胰島素水平的關(guān)聯(lián)分析

臨床數(shù)據(jù)：ogtt實(shí)驗(yàn)中血糖和胰島素水平。

關(guān)聯(lián)分析模型：先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用spss20.0軟件分析各基因型間的生產(chǎn)性狀效應(yīng)。在對(duì)基因型效應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)采用了固定模型：

yij=μ+cnvi+eij，

其中：yij為性狀觀察值，μ為總體均值，cnvi為第i個(gè)拷貝數(shù)變異類型的固定效應(yīng)，eij為隨機(jī)誤差。各組數(shù)據(jù)間的差異性采用lsd多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以mean±se形式表示。

ogtt實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明（見圖3），kcnip1基因cnv位點(diǎn)可顯著影響60-min、120-min和180-min的血糖和胰島素水平，其中，拷貝數(shù)插入型（copynumbergain）的血糖水平顯著高于缺失型（copynumberloss），相反地，拷貝數(shù)缺失型（copynumberloss）的胰島素水平顯著高于插入型（copynumbergain）。由此可見，kcnip1基因該cnv位點(diǎn)不同基因型與ii型糖尿病的臨床指標(biāo)顯著相關(guān)。

6、上述cnv標(biāo)記在ii型糖尿病臨床篩查和診斷中的應(yīng)用

鑒定的kcnip1基因chr5q35.1:170062275–170064128位點(diǎn)的拷貝數(shù)變異可作為重要的分子遺傳標(biāo)記，其中，拷貝數(shù)插入型為疾病易感基因型，可作為型糖尿病早期篩查和診斷的重要指征。

核苷酸序列表

<110>武漢科技大學(xué)

<120>一種ii型糖尿病相關(guān)基因kcnip1拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法與應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>1854

<212>dna

<213>人(human)

<220>

<400>1

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<210>2

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<220>

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<400>2

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<223>下游引物r1

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<223>上游引物f2

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<213>人工序列

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<223>下游引物r2

　<400>5

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