本發(fā)明涉及一種判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，屬于藥物檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：乳腺癌的藥物治療已經(jīng)進(jìn)入了分子分型指導(dǎo)下的精準(zhǔn)化治療時代。通過組化四要素(er、pr、her2和ki67)而代替基因芯片檢測的簡易分子分型，已廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)臨床藥物治療方案的制定。但三陰型乳腺癌(tnbc)因其er、pr以及her2均陰性，對靶向激素受體的內(nèi)分泌治療和靶向her2的系列藥物治療無效。曾被列為靶向治療的棄兒。而三陰型乳腺癌又較其他分子類型發(fā)病更年輕化，遺傳傾向更明顯，有更強(qiáng)的侵襲性，2年內(nèi)局部復(fù)發(fā)和內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。傳統(tǒng)的化療雖然顯示出較高的近期有效率，但緩解時間較短，總體生存差，亟待開發(fā)針對性強(qiáng)的靶向治療藥物。相對于乳腺癌的其他分子分型，三陰性乳腺癌中brca1/2突變型(brcaness)患者比例明顯增高，約占15％。brca1/2基因不僅是目前發(fā)現(xiàn)的外顯率最高的乳腺癌遺傳易感基因，而且還是dna損傷修復(fù)的重要基因。在dna損傷發(fā)生后，brca1蛋白能夠迅速招募到dna損傷位點(diǎn)上，通過蛋白激酶atm(ataxiatelangiectasiamutated)等磷酸化過程，激活其下游的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(cell-cyclecheckpointkinase2，chek2或者chk2)等蛋白，通過同源重組(homologousrecombination，hr)和非同源重組通路實(shí)現(xiàn)對dna損傷的修復(fù)。因此理論上伴有brcal/2基因突變的乳腺癌對致dna損傷的藥物更為敏感。大量的臨床研究也證實(shí)了以dna損傷為主要作用機(jī)制的藥物，如順鉑、卡鉑等能明確提高三陰性乳腺癌，特別是brca1/2型乳腺癌的療效?；诤铣芍滤览碚?syntheticlethality)，在brca1/2型乳腺癌的治療中，加入另外一個dna損傷修復(fù)關(guān)鍵酶parp1(polyadp-ribosepolymerasefamilymember1,聚腺苷二磷酸-核糖轉(zhuǎn)移酶1)的抑制劑，能更有效抑制腫瘤細(xì)胞的損傷修復(fù)，提示對化療藥物敏感。parp1可與修復(fù)途徑中的多種蛋白相互作用，并募集它們到dna損傷位點(diǎn)。在堿基切除修復(fù)途徑中parp1可募集另一個dna損傷修復(fù)元件xrcc1至單鏈損傷部位，而在dna雙鏈損傷修復(fù)途徑中可募集dna依賴的蛋白激酶。parp1抑制劑通過抑制parp1活性導(dǎo)致單鏈dna不能被修復(fù)，經(jīng)dna復(fù)制，單鏈損傷變成雙鏈損傷。brca1和brca2都是dna雙鏈損傷后同源重組修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一旦brca1/2缺失后，依賴于此的同源重組途徑修復(fù)異常，進(jìn)而影響細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡?；诖死碚?，應(yīng)用parp1抑制劑聯(lián)合dna損傷化療藥物卡鉑治療brca1/2突變率相對較高的三陰性乳腺癌理論上應(yīng)該具有更好的療效。然而，o’shaughnessy教授牽頭開展的國際多中心iii期臨床研究，并未顯示出parp1抑制劑iniparib聯(lián)合致dna損傷化療藥物卡鉑及吉西他濱治療三陰性乳腺癌的優(yōu)勢。隨后astrazeneca公布的另一個parp1抑制劑olaparib治療三陰性乳腺癌ii期臨床結(jié)果，也未達(dá)到預(yù)期的療效。之后的多個parp1抑制劑治療三陰性乳腺癌的臨床試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。為何對于brcaness型比例較高的三陰性乳腺癌，化療基礎(chǔ)上聯(lián)合parp1抑制劑沒有發(fā)揮合成致死效應(yīng)，其機(jī)制尚在研究之中，但是在抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用中，卻沒有一種快速的檢測方法來指導(dǎo)臨床用藥，判斷一種抗癌藥是否對三陰性乳腺癌有效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，以指導(dǎo)臨床用藥或者篩選對三陰性乳腺癌有效的抗癌藥。本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：一種判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，其特征在于，包括：步驟一：取懸浮型腫瘤細(xì)胞，將其chek2基因沉默或者敲除，得到第一細(xì)胞系；步驟二：將第一細(xì)胞系分為兩組，分別轉(zhuǎn)入chek2wt-gfp和chek2y390c-gfp基因；步驟三：使用流式細(xì)胞儀分別分選出含有g(shù)fp的細(xì)胞，得到chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系；步驟四：使用不同濃度的待測藥物對相同細(xì)胞濃度的chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系進(jìn)行刺激；步驟五：對步驟四中被藥物刺激后的chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系進(jìn)行離心和重懸，使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，若存活的chek2y390c-gfp細(xì)胞系的細(xì)胞濃度大于chek2wt-gfp的細(xì)胞濃度，說明對應(yīng)的藥物對三陰性乳腺癌的效果不明顯。進(jìn)一步，本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，還可以具有這樣的特征：其中，懸浮型腫瘤細(xì)胞為eμ-mycp19arf-/-b細(xì)胞。進(jìn)一步，本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟一中使用rnai的方法對chek2基因進(jìn)行沉默。進(jìn)一步，本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟二中，使用質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的操作。進(jìn)一步，本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟四中，刺激時間大于6小時。進(jìn)一步，本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，還可以具有這樣的特征：其中，步驟五中，離心所用的轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)明的有益效果本發(fā)明的判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，使用抗癌藥物對chek2基因的y390c位點(diǎn)的突變細(xì)胞和野生型chek2的細(xì)胞進(jìn)行對比，由于申請人意外的發(fā)現(xiàn)帶有chek2基因的y390c位點(diǎn)的突變的腫瘤細(xì)胞會對一些抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性。因此，只需要檢測chek2基因的y390c位點(diǎn)的突變的腫瘤細(xì)胞，就能夠快速的判斷此種藥物是否能夠?qū)θ幮匀橄侔┊a(chǎn)生效果，從而對臨床上的用藥進(jìn)行指導(dǎo)，從用藥之初就避免使用會有抗藥性的藥物進(jìn)行治療，而不是在發(fā)現(xiàn)患者對此種藥物有抗藥性之后才更換用藥，防止浪費(fèi)寶貴的治療時間。附圖說明圖1是chek2表達(dá)的real-timepcr的檢測結(jié)果圖；圖2是不同濃度的順鉑對細(xì)胞的殺傷結(jié)果圖；圖3是chek2基因的表達(dá)情況；圖4是幾種chek2表達(dá)狀態(tài)下的ser20的磷酸化情況。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。需要說明的是，本發(fā)明中未詳細(xì)描述的實(shí)驗(yàn)，均按照生物化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程或者相應(yīng)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。1.chek2基因被沉默后，會對順鉑產(chǎn)生耐藥性。構(gòu)建chek2的shrna，進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，選擇dna損傷的化療藥物順鉑cisplatin。具體流程如下：順鉑分2個梯度，用48孔板進(jìn)行試驗(yàn)，每孔加100μlb細(xì)胞培養(yǎng)基、0.2mb細(xì)胞和100μl，順鉑的濃度為20μg/ml。表1：藥物結(jié)果其中負(fù)值表示耐藥，正值表示敏感，log絕對值大于1說明表型明顯。對感染的shrna進(jìn)行嘌呤霉素篩選后，抽提rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，進(jìn)行real-timepcr結(jié)果如圖1所示：說明chek2確實(shí)有下調(diào)。2.順鉑耐藥細(xì)胞株的建立過程人的chek2y390位點(diǎn)在鼠中對應(yīng)的為y394位點(diǎn)，構(gòu)建chek2cdna，對394位點(diǎn)酪氨酸堿基進(jìn)行突變?yōu)榘腚装彼?，即tat→tgt；得到chek2y394c的cdna。對b細(xì)胞感染行puro-chek2的shrna，載體中只含嘌呤霉素抗性，不含gfp。感染后進(jìn)行嘌呤霉素篩選，篩選后得到chek2-null(或稱chek2沉默)的b細(xì)胞。對chek2沉默的b細(xì)胞感染chek2cdna分別為:chek2wt，chek2y394c，chek2vec，使gfp在20-50％之間，然后進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。具體流程如前，另由于chek2-nullb細(xì)胞經(jīng)過嘌呤霉素篩選，對其他藥物也產(chǎn)生一定耐藥，這次實(shí)驗(yàn)藥物順鉑濃度：40μg/ml。表2：藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果logcisp-1cisp-2cisp-3mockchek2-y394c0.280.420.400.00chek2-wt-1.93-2.01-1.940.00chek2-vec0.07-0.050.040.00以上結(jié)果說明chek2表達(dá)下降的細(xì)胞對順鉑表現(xiàn)出不同程度的耐藥。3.表達(dá)chek2y390c的細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生最大殺傷需要的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生型chek2細(xì)胞對前面感染的chek2wt，chek2y394c和chek2vec進(jìn)行流式細(xì)胞分選，含gfp的細(xì)胞被篩選出來。進(jìn)行順鉑藥物實(shí)驗(yàn)，分5個梯度，每個梯度做3個副孔，每個梯度遞增0.7nm，觀察48小時最大殺傷，結(jié)果如表3所示：表3：各個濃度的順鉑對chek2表達(dá)狀態(tài)的殺傷情況如圖2所示：chek2y394c和chek2vec對順鉑48h最大殺傷需要的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于chek2wt，圖2中的各個濃度分別是0mm、0.7mm、2.1mm、3.5mm、4.9mm、7mm。4.chek2y390c通過細(xì)胞周期檢測點(diǎn)以及凋亡影響chek2的功能如圖3所示y394c位點(diǎn)突變的chek2基因雖然也有表達(dá)，但是如圖4所示，順鉑處理6小時后，y394c細(xì)胞對底物p53ser20的磷酸化大大降低。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，y394c的細(xì)胞表達(dá)p53下游p21，puma以及noxa均明顯低于wt，提示y394c細(xì)胞的凋亡功能異常。5.一種利用上述研究結(jié)果，判斷三陰性乳腺癌抗藥性的方法，包括如下步驟：步驟一：取懸浮型腫瘤細(xì)胞，本實(shí)施方式中懸浮型腫瘤細(xì)胞使用eμ-mycp19arf-/-b細(xì)胞，使用rnai的方法對其chek2基因進(jìn)行沉默，得到第一細(xì)胞系；步驟二：將第一細(xì)胞系分為兩組，分別轉(zhuǎn)入chek2wt-gfp和chek2y390c-gfp基因，使用質(zhì)?；蛘卟《咀鳛檩d體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因；步驟三：使用流式細(xì)胞儀分別分選出含有g(shù)fp的細(xì)胞，得到chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系；步驟四：使用不同濃度的待測藥物對相同細(xì)胞濃度的chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系進(jìn)行刺激，刺激時間大于6小時；步驟五：對步驟四中被藥物刺激后的chek2wt-gfp細(xì)胞系和chek2y390c-gfp細(xì)胞系進(jìn)行離心和重懸，使用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，若存活的chek2y390c-gfp細(xì)胞系的細(xì)胞濃度大于chek2wt-gfp的細(xì)胞濃度，說明對應(yīng)的藥物對三陰性乳腺癌的效果不明顯。離心時應(yīng)當(dāng)選擇能夠?qū)⒒罴?xì)胞沉淀下來而死細(xì)胞不會沉淀下來的轉(zhuǎn)速，在本實(shí)施方式中離心所用的轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘。當(dāng)前第1頁12