本發(fā)明涉及一種桑葉活性肽，特別是涉及一種桑葉免疫活性肽及其制備方法。

背景技術(shù)：

免疫調(diào)節(jié)是指免疫系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞與免疫分子之間、以及免疫系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間相互作用，使機體的免疫應(yīng)答處于最合適的水平，從而維持生物體內(nèi)生理動態(tài)平衡。一旦免疫調(diào)節(jié)失衡，就會引發(fā)病原微生物感染、免疫缺陷病、腫瘤及超敏反應(yīng)等不良癥狀。因此尋找具有免疫活性的免疫分子顯得尤為重要。近期研究認(rèn)為，通過諸如免疫肽、免疫多糖等天然活性物質(zhì)來提高機體免疫調(diào)節(jié)活性是最有希望替代抗生素治療的方法。免疫活性肽是指一類能夠通過增強機體免疫力，增強巨噬細(xì)胞吞噬能力從而提高機體抵御外來病原體感染能力的免疫功能肽。免疫活性肽作為小分子物質(zhì)，能夠完整的被腸道吸收或者在腸道與受體結(jié)合來發(fā)揮免疫作用，具有活性強、易吸收、穩(wěn)定性強等獨特的優(yōu)勢。目前免疫肽主要來源于動物、植物、微生物。其中植物蛋白免疫肽因具有來源廣、成本低、活性高等特點而成為研究熱點。目前制備的植物源免疫肽主要有大米肽、米糠肽、綠豆肽等，而葉蛋白免疫肽的研究較少。

桑樹屬?？粕僦参?，在我國栽培歷史悠久。桑葉是桑樹的葉子，國家衛(wèi)生部將其列為藥食兩用植物。桑葉中含有豐富的蛋白質(zhì)、生物堿、多糖、黃酮、酚酸等物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值。傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)中桑葉主要用作蠶飼料，易出現(xiàn)過剩、浪費等現(xiàn)象，為了實現(xiàn)資源的最優(yōu)利用，目前對桑葉中的多種成分，如多糖、酚酸、黃酮、生物堿等進(jìn)行了提取并進(jìn)行生理活性的分析。如中國專利cn102370707a用乙醇溶液制備桑葉、桑枝提取物，經(jīng)大孔樹脂多次洗脫分離，得到主要成分為dnj、多糖及黃酮的桑葉/桑枝提取物，并將其用于美白及降血糖研究；中國專利cn102771862a用50%~70%的酸性乙醇溶液制備了具抑菌活性的桑葉酚酸提取物；中國專利cn104274534a用超臨界萃取技術(shù)制備了全成分桑葉提取物，對其多糖含量進(jìn)行了分析。目前的專利及研究主要集中在桑葉中酚類、dnj的提取及其在降血糖、美白等藥理活性中的應(yīng)用，提取溶劑多為有機溶劑，產(chǎn)物溶解性較低。因此，需要對桑葉中更多的化學(xué)成分及生理活性進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步提高桑葉的綜合利用價值。

研究表明，桑葉中蛋白質(zhì)含量為干基重量的15%~30%，是蛋白含量較高的植物。其氨基酸組成與脫脂大豆粉大體一致，可以用作動物飼料添加劑或食品添加劑。目前有少數(shù)文獻(xiàn)及專利對桑葉蛋白及桑葉肽的提取優(yōu)化進(jìn)行了分析，而對于桑葉免疫活性肽的制備尚無研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有桑葉活性成分及免疫肽研究存在的不足之處，提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的桑葉免疫活性肽及其制備方法，所得桑葉肽具有純度高、免疫活性高的特點。

本發(fā)明的目的通過如下方法實現(xiàn)：

一種桑葉免疫活性肽的制備方法，用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶6種蛋白酶單獨酶解或者復(fù)合酶解桑葉蛋白，并用deaesepharosefastflow陰離子柱層析、sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析及rp-hplc對其進(jìn)行分離純化制備，得到桑葉免疫活性肽；

包括以下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；提取桑葉蛋白后，取桑葉蛋白用水溶解，配制成質(zhì)量濃度為1%-10%的溶液，在95-100℃蛋白變性5min，冷卻后采用加入所述6種蛋白酶中的一種、加入六種酶中的兩種或加入六種蛋白酶中的三種進(jìn)行酶解，酶解后95-100℃滅酶活10min，冷卻至室溫后，在離心力為5000-10000g條件下離心15-20min，取上清冷凍干燥得到具有免疫活性的桑葉肽粗品；蛋白酶的總添加量為底物質(zhì)量的1%-5%；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用tris-hcl或者去離子水溶解，并用0.22-0.45μm的濾膜過濾；取10-30ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱層析，用不同濃度的nacl溶液沖洗柱子，收集組分；100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測定，將活性最高的組分通過sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析分離，收集分離的組分進(jìn)行冷凍干燥，測定免疫活性，收集活性高的組分用rp-hplc進(jìn)一步分離純化，所得組分冷凍干燥后測定免疫活性，活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

上述方法中，步驟（1）桑葉蛋白的提取采用水提鹽沉或堿提酸沉法（孫崇臻，等.不同制備方法桑葉蛋白功能性質(zhì)的比較[j].現(xiàn)代食品科技，2015,31(12),242-249.）。

上述方法中，步驟（1）中，當(dāng)選用加入六種蛋白酶中的一種時，蛋白酶的酶解條件為：中性蛋白酶37-45℃，ph6.8-7.2，堿性蛋白酶45-55℃，ph7.5-8.5；復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解溫度45-55℃，ph6.5-7.5；胰蛋白酶32-40℃，ph7.5-8.5；6種單獨酶解時間均為1-8h，e/s為1-6%；當(dāng)選用加入六種酶種蛋白酶中的兩種時，酶解條件為：在單獨酶解條件下，各自酶解時間控制在1-4h；當(dāng)選用加入六種酶種蛋白酶中的三種時，三酶復(fù)合酶解滿足：在單酶水解條件下，各自酶解時間控制在0.5-3h。

上述方法中，所述tris-hcl濃度為15-25mm，ph為7.2-8.2。

上述方法中，步驟（2）所述過離子柱的溶液濃度為5-30mg/ml；nacl洗脫液濃度為0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l；洗脫流速1.0-1.5ml/min，8min/管，每個洗脫濃度接收40管。

上述方法中，步驟（2）所述sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析的溶液濃度為5-30mg/ml，加樣體積1-5ml，純水洗脫，洗脫流速0.3-0.8ml/min，3-6min/管。

上述方法中，步驟（2）中采用rp-hplc分離純化的條件為：使用c18柱，上樣濃度0.5-20mg/ml，上樣體積0.02-5ml；檢測波長220nm；流動相為a：0.05-0.3%的三氟乙酸（tfa），b：含0.05-0.3%tfa的乙腈；洗脫梯度為：單酶酶解產(chǎn)物：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流動相a；復(fù)合酶解產(chǎn)物：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，流速為0.2-20ml/min（可在此基礎(chǔ)上根據(jù)實際情況進(jìn)行梯度優(yōu)化）。

上述方法中，所述桑葉肽進(jìn)行免疫活性分析：包括巨噬細(xì)胞raw264.7分泌細(xì)胞因子no，il-6，tnf-α的能力及胞飲中性紅的能力。

本發(fā)明還提供了一種利用上述方法制備的一種具有免疫活性的桑葉肽。

本發(fā)明以6種蛋白酶單獨酶解或復(fù)合酶解制備桑葉免疫活性肽，并用deaesepharosefastflow陰離子柱及sephadexg-50、g-25或者g-15凝膠柱進(jìn)行分離純化，制備工藝簡單；純化過程溫和，較好的保持了桑葉肽的免疫活性，克服了目前對桑葉提取物化學(xué)成分研究相對單一、制備過程復(fù)雜、產(chǎn)物溶解性低的缺陷。同時，桑葉免疫活性肽的制備，擴大了桑葉的應(yīng)用范圍，并提升了其藥食兩用價值。

本發(fā)明制備的桑葉肽具有極強的溶解性及良好的免疫活性，可以作為天然免疫調(diào)節(jié)劑，很好的用于食品及藥品行業(yè)。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：

1）本發(fā)明制備了桑葉免疫活性肽，極大的豐富了桑葉有效成分的研究范圍，強化了其應(yīng)用價值。

2）本發(fā)明提供了一種簡便可行的桑葉免疫活性肽的制備方法。

3）本發(fā)明制備的免疫活性肽具有極強的溶解性、良好的免疫活性。

4）本發(fā)明制備過程未涉及任何有機溶劑，操作條件溫和，最大程度的保留了桑葉肽的免疫活性，保證了產(chǎn)品的安全性。

5）本發(fā)明的制備過程操作簡便，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1a為deaesepharoseff陰離子柱層析圖；圖1b為各離子組分中性紅胞飲率測定結(jié)果；

圖2asephadexg-25凝膠柱層析圖；圖2b各分離組分中性紅胞飲率；

圖3為rp-hplc液相圖譜；

圖4a~圖4d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌no(a)、il-6(b)、tnf-α(c)及胞飲中性紅的影響（d）；

圖5a~圖5d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌tnf-α(a)、no(b)、il-6(c)及胞飲中性紅的影響（d）。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但需要說明的是，實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實施例1

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（中性蛋白酶酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；取30g桑葉粉加600ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細(xì)胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達(dá)到65%飽和度。離心（離心力8000g，4℃，20min）取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質(zhì)量濃度為1%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調(diào)ph7.0，加入1%的中性蛋白酶（諾維信，neutrase0.8l），45℃酶解2h后，95℃滅酶活10min。冷卻至室溫，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用tris-hcl（20mm，ph7.8）水溶解，配制10mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取15ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.0ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進(jìn)行收集（8min/管）。共得到d1-d7七個組分，將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測定（結(jié)果見圖1a和圖1b）。圖1adeaesepharoseff陰離子柱層析圖；圖2b為各離子組分中性紅胞飲率測定結(jié)果。其中a-f:不同字母代表各組分中性紅胞飲率具有顯著差異，p<0.05。

由圖1a可知，桑葉免疫活性粗肽經(jīng)過deaesepharoseff陰離子柱分離后得到7個不同的組分。由圖1b可知，7個組分的中性紅胞飲率均顯著優(yōu)于空白組，說明離子分離后得到的不同組分均有免疫活性，其中d4、d5的免疫活性最高，顯著優(yōu)于其他組分，d3次之。綜合考慮產(chǎn)品得率及免疫活性，因此選擇得率高活性高的d5進(jìn)一步純化。

將組分d5用水配成濃度5mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取2ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進(jìn)行層析分離。流速0.3ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值，繪制洗脫曲線（圖2a）并測定中性紅胞飲率（圖2b）。圖2a-圖2b為sephadexg-25凝膠柱層析圖（a）及各分離組分中性紅胞飲率（b）。a-d:不同字母代表各組分中性紅胞飲率具有顯著差異，p<0.05。由圖2-a可知，d5經(jīng)過sephadexg-25凝膠柱分離后，得到s1、s2兩個組分。由圖2-b得知，s1、s2的中性紅胞飲率均顯著高于空白組，其中s1的吞噬率最高，且顯著優(yōu)于lps組。選擇s1組分進(jìn)一步純化。

選擇s1進(jìn)行rp-hplc液相純化。將s1用超純水配制成濃度為1mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用日本島津液相色譜儀進(jìn)行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（300sb-c18，5μm,9.4×250mm）中，以0.05%的tfa（a）及含0.05%tfa的乙腈（b）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流動相a。使用紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長220nm，流速1ml/min。由圖3可知，s1經(jīng)過rp-hplc分離后，在1-10min出現(xiàn)兩個溶劑峰，17.954min得到1個組分，說明制備的桑葉免疫活性肽具有較高純度。

對本發(fā)明實施例制備純化的桑葉肽進(jìn)行免疫活性測定：將桑葉免疫肽用dmem培養(yǎng)基溶解稀釋，配制濃度為5~150μg/ml的溶液，進(jìn)行小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌no、il-6、tnf-α及胞飲中性紅的測定，結(jié)果如圖4所示。圖4桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌no(a)、il-6(b)、tnf-α(c)及胞飲中性紅的影響（d）。**:代表不同濃度桑葉肽及脂多糖（lps）與對照組具有極顯著差異，p<0.01。

當(dāng)機體受到病原體感染時，巨噬細(xì)胞首先產(chǎn)生吞噬作用，然后通過分泌no或者產(chǎn)生ros來殺死病原體。il-6,tnf-α等細(xì)胞因子也會被同時分泌參與炎癥反應(yīng)。這些免疫應(yīng)答的刺激調(diào)節(jié)可以增強機體對抗外源病原體的威脅，從而發(fā)揮免疫作用。由圖4a~圖4d可知，經(jīng)過本發(fā)明實施例制備的桑葉免疫活性肽處理后，小鼠巨噬細(xì)胞no（a）、il-6(b)、tnf-α(c)的表達(dá)量均顯著升高。同時，在5-100μg/ml的范圍內(nèi)，三個細(xì)胞因子的表達(dá)量隨著濃度的升高而增加。其中，桑葉免疫活性肽對il-6的激活表達(dá)最為顯著，經(jīng)過100μg/ml活性肽處理后的raw264.7的il-6表達(dá)水平是陰性對照組的500倍左右（圖4-b）。與細(xì)胞因子分泌表達(dá)結(jié)果相似，不同濃度的桑葉活性肽中性紅胞飲率均顯著優(yōu)于陰性對照組，具有顯著的胞飲效果。綜上，本發(fā)明實施例制備的桑葉肽具有很強的免疫調(diào)節(jié)活性，是一種具有較高應(yīng)用價值的免疫活性肽。

實施例2

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；取30g桑葉粉加900ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細(xì)胞粉碎20min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達(dá)到65%飽和度。離心（8000g，4℃，20min）取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質(zhì)量濃度為5%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調(diào)ph7.2，加入2%的中性蛋白酶（諾維信，neutrase0.8l），45℃酶解1h后，95℃滅酶活15min。冷卻至55℃，調(diào)ph8.0，加入1%的堿性蛋白酶（諾維信3701，alcalase3.0t）酶解3h，95℃滅酶活10min后，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制15mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取25ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.5ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進(jìn)行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取1ml加入到sephadexg-15凝膠柱中進(jìn)行層析分離。流速0.5ml/min，3min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進(jìn)行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進(jìn)行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.1%的tfa（a）及含0.1%tfa的乙腈（b）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長220nm，流速10ml/min。

對實施例2制備純化的桑葉肽進(jìn)行免疫活性測定：將桑葉免疫肽用dmem培養(yǎng)基溶解稀釋，配制濃度為5~150μg/ml的溶液，進(jìn)行小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌no、il-6、tnf-α及胞飲中性紅的測定，結(jié)果如圖5a~圖5d所示。圖5a~圖5d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7分泌tnf-α(a)、no(b)、il-6(c)及胞飲中性紅的影響（d）。**:代表與對照組存在極顯著差異，p<0.01。由圖5可知，實施例2制備的桑葉肽在5-150μg/ml范圍內(nèi)，能夠極顯著的提高no、il-6、tnf-α的表達(dá)量，同時顯著提高了中性紅胞飲率，因此具有較強的免疫活性。

實施例3

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶復(fù)合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎過篩得桑葉粉；取30g桑葉粉加500ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細(xì)胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達(dá)到65%飽和度。8000g離心20min，取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質(zhì)量濃度為4%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調(diào)ph7.0，加入2%的復(fù)合蛋白酶（丹麥諾維信，protamex），50℃酶解2h后，95℃滅酶活5min。冷卻至50℃，調(diào)ph7.0，加入2%的木瓜蛋白酶（上海阿拉丁，p123425）酶解1h，95℃滅酶活5min。冷卻后8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制15mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取20ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.5ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進(jìn)行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取2ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進(jìn)行層析分離。流速0.5ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進(jìn)行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進(jìn)行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.1%的tfa（a）及含0.1%tfa的乙腈（b）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長220nm，流速15ml/min。對分離的組分進(jìn)行免疫活性測定，得到活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

實施例4

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎過篩得桑葉粉；取30g桑葉粉加300ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細(xì)胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達(dá)到65%飽和度。8000g離心20min，取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質(zhì)量濃度為3%的溶液，95℃加熱8min。冷卻后調(diào)ph7.5，加入2%的復(fù)合蛋白酶（諾維信，protamex），50℃酶解1h后，95℃滅酶活5min。冷卻至37℃，調(diào)ph8.0，加入1%的胰蛋白酶（上海阿拉丁，t105532）酶解1h，95℃滅酶活5min。冷卻至45℃，調(diào)ph7.0，加入1%的風(fēng)味蛋白酶（諾維信，flavourzyme500lapu/g）酶解0.5h，95℃滅酶活5min后，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品。

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制25mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取15ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.2ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進(jìn)行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進(jìn)行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取1ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進(jìn)行層析分離。流速0.3ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進(jìn)行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進(jìn)行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.05%的tfa（a）及含0.05%tfa的乙腈（b）為流動相進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長220nm，流速5ml/min。對分離的組分進(jìn)行免疫活性測定，得到活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。