本發(fā)明涉及用于大菱鲆的雌雄辨別的引物組及使用其來(lái)辨別大菱鲆的雌雄的方法，更具體而言，本發(fā)明涉及能夠通過(guò)測(cè)定對(duì)生成大菱鲆的性激素而言重要的芳香化酶基因表達(dá)量而在種苗階段快速而準(zhǔn)確地辨別大菱鲆的雌雄的方法。

背景技術(shù)：

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，養(yǎng)殖魚(yú)種的性別辨別對(duì)養(yǎng)殖的效率性起到重要的作用。即，這是因?yàn)樯L(zhǎng)速度或者產(chǎn)業(yè)價(jià)值會(huì)根據(jù)性別而有所不同，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)性上產(chǎn)生大的差異。鰻鱺魚(yú)或比目魚(yú)等物種是雌性的生長(zhǎng)速度更快，而羅非魚(yú)則是雄性的生長(zhǎng)速度更快。另外，對(duì)于鮭魚(yú)或真鯛而言，雌性的體色的消費(fèi)者好感程度高，對(duì)于被食用生殖質(zhì)的鯔魚(yú)、香魚(yú)而言，具有卵的雌性的養(yǎng)殖價(jià)值高。因此，挑選水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)價(jià)值高的性別來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)能夠增大生產(chǎn)力，從而提高養(yǎng)殖的效率。

作為魚(yú)類(lèi)性別的辨別方法，首先有通過(guò)外形特征來(lái)進(jìn)行辨別的方法。根據(jù)在成熟期顯現(xiàn)出的婚姻色或成熟的雌雄個(gè)體的外形特征來(lái)進(jìn)行辨別，或者對(duì)生殖質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)觀察來(lái)進(jìn)行辨別的方法均屬于其中。對(duì)輻紋海豬魚(yú)、犁齒鯛、鰟鮍等可通過(guò)體色來(lái)區(qū)別性別，對(duì)鮭魚(yú)或海馬等可用形態(tài)來(lái)區(qū)別性別。然而，由于這大部分屬于在生長(zhǎng)為成體之后在產(chǎn)卵期和發(fā)情期發(fā)生改變的情況，因此事實(shí)上不可能在魚(yú)類(lèi)的魚(yú)苗階段用肉眼來(lái)區(qū)別性別。

除了外觀上的辨別以外，還有在卵形成過(guò)程中測(cè)定作為卵黃形成前體的卵黃蛋白原的方法。然而，該方法也屬于在性成熟之后才能夠進(jìn)行的方法，因此同樣不能夠在屬于未成熟期的種苗階段進(jìn)行辨別。

除此以外，還有通過(guò)分子生物學(xué)方法來(lái)辨別性別的方法，但魚(yú)類(lèi) 與哺乳類(lèi)不同，不僅具有性染色體的魚(yú)種不多，而且僅由性染色體不能夠決定性腺性別，受到如性分化期的水溫等環(huán)境影響而發(fā)生性別改變的魚(yú)種較多。

已知，除了這種根據(jù)生態(tài)情況來(lái)改變性別的魚(yú)類(lèi)以外，對(duì)于根據(jù)生長(zhǎng)初期的環(huán)境而具有與遺傳性別(geneticgender)不同的性別的情況，主要根據(jù)生殖腺的發(fā)育而顯現(xiàn)出性腺性別(gonadalgender)，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為產(chǎn)業(yè)上重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的比目魚(yú)等的情況，除了遺傳性狀以外，根據(jù)水溫等環(huán)境條件，生殖腺發(fā)育形成得不同，并且性別被決定。另外已知，即使遺傳上為雌性(xx)，在高水溫和低水溫下飼養(yǎng)時(shí)也會(huì)性分化為性腺雄性?；谶@樣的理由，基因辨別的方法也難以在種苗階段辨別魚(yú)類(lèi)的性別。

另外，大菱鲆(turbot；scophthalmusmaximus)為生活在大西洋沿岸、歐洲海岸、北大西洋、波羅的海、地中海以及黑海周邊的比目魚(yú)科魚(yú)類(lèi)。大菱鲆作為不在東北亞棲息的外來(lái)魚(yú)種，在比較冰冷的海洋中棲息，具有從非對(duì)稱(chēng)菱形趨近于圓形程度的寬大的體型，因而具有與比目魚(yú)相類(lèi)似的外形。對(duì)于體色，生活在沙中的個(gè)體與生活在暗礁中的個(gè)體相互不同，與其它鰈魚(yú)科魚(yú)類(lèi)同樣地隨著棲息環(huán)境而改變體色。眼鏡的位置如韓國(guó)的普通的比目魚(yú)(偏口魚(yú))那樣，從正面觀察時(shí)偏向于左側(cè)。

大菱鲆養(yǎng)殖始于法國(guó)，目前在西班牙、葡萄牙、丹麥及荷蘭等歐洲以及以中國(guó)為首的亞洲進(jìn)行著養(yǎng)殖。韓國(guó)從2012年開(kāi)始進(jìn)行利用濟(jì)州島的熔巖地下海水的養(yǎng)殖，目前少量地流通。

這種大菱鲆具有如比目魚(yú)那樣的雌性生長(zhǎng)得快于雄性的特性，因此需要開(kāi)發(fā)在養(yǎng)殖的種苗階段能夠在魚(yú)苗階段中快速而準(zhǔn)確地區(qū)別表現(xiàn)得不同于遺傳性別的性腺性別的技術(shù)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專(zhuān)利文獻(xiàn)

韓國(guó)注冊(cè)專(zhuān)利第10-1418139號(hào)

韓國(guó)注冊(cè)專(zhuān)利第10-1281529號(hào)

韓國(guó)注冊(cè)專(zhuān)利第10-1499689號(hào)

韓國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利第10-2014-0071579號(hào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)課題

本發(fā)明的目的在于提供雌雄辨別方法，其中該雌雄辨別方法能夠在種苗階段準(zhǔn)確而容易地辨別雌雄，從而解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中不易在種苗階段辨別養(yǎng)殖魚(yú)的雌雄的問(wèn)題，并且利用最近作為高附加值養(yǎng)殖魚(yú)種而受到矚目的大菱鲆的養(yǎng)殖中的雌性比雄性快速生長(zhǎng)的特性來(lái)提高養(yǎng)殖效率。

技術(shù)方案

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供用于大菱鲆雌雄辨別的引物組，其特征在于，包含在大菱鲆的雌性生殖質(zhì)中特異性地表達(dá)的芳香化酶(aromatase)基因的引物組seqidno:1(5’-tgagaaagagctgctggtga-3’)、seqidno:2(5’-cgtcttgtgcttctggtgaa-3’)。另外，為了準(zhǔn)確地比較芳香化酶的表達(dá)，提供大菱鲆生殖質(zhì)的特異性vasa基因的引物組seqidno:3(5’-accgtcagaccctgatgttc-3’)、seqidno:4(5’-gcgttctgttcctgtggttt-3’)以及作為看家基因的ef1a基因的引物組seqidno:5(5’-cgttggtgtcaacaagatgg-3’)、seqidno:6(5’-atccagagatggggacaaag-3’)。

有益效果

通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的用于大菱鲆雌雄辨別的引物組及使用其來(lái)辨別大菱鲆雌雄的方法，能夠在種苗階段準(zhǔn)確地辨別大菱鲆的雌雄，從而能夠挑選出因生長(zhǎng)快速而對(duì)養(yǎng)殖有利的雌性來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。

附圖說(shuō)明

圖1示出從大菱鲆卵巢的cdna分離的ef1α、vasa、芳香化酶的部分核苷酸序列及在分析中使用的引物的位置(下劃線部分)。

圖2是在實(shí)驗(yàn)中使用的大菱鲆雌雄個(gè)體的生殖質(zhì)的組織學(xué)觀察照片。

圖3是示出利用根據(jù)本發(fā)明的芳香化酶、vasa和ef1α的引物組在大菱鲆的雌性和雄性生殖質(zhì)中擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果的照片。

圖4是根據(jù)組織分別示出大菱鲆芳香化酶基因的相對(duì)表達(dá)量的圖表。

圖5是示出大菱鲆的雄性和雌性個(gè)體的生殖質(zhì)中的芳香化酶的相對(duì)表達(dá)量的圖表，其中(a)是示出雄性和雌性的芳香化酶的相對(duì)表達(dá)量的圖表，(b)是芳香化酶和vasa的熔解曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)定作為對(duì)于大菱鲆的雌性激素生成而言重要的芳香酶的芳香化酶基因表達(dá)量，從而能夠在種苗階段的早期快速而準(zhǔn)確地辨別大菱鲆的雌雄的方法。下面，舉出具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。

i.大菱鲆生殖質(zhì)特異性芳香化酶和vasa以及ef1-α引物的制備

為了辨別大菱鲆的性別，制備用于擴(kuò)增大菱鲆生殖質(zhì)特異性基因的引物。芳香化酶作為對(duì)合成屬于雌性激素的雌二醇-17b起決定性作用的酶，其被用作大菱鲆的雌雄辨別的標(biāo)志物。另外，vasa作為僅在生殖腺中被表達(dá)的基因，由于不容易從種苗階段的小個(gè)體提取生殖質(zhì)，因此將僅在生殖腺中被特異性地表達(dá)的vasa基因用作看家基因，從而提高芳香化酶的表達(dá)的準(zhǔn)確性。

圖1示出從大菱鲆卵巢cdna分離的ef1α、vasa、芳香化酶的部分核苷酸序列以及分析中使用的引物的位置(下劃線部分)。大菱鲆生殖質(zhì)特異性vasa引物是基于ncbigenbank的已報(bào)告序列(大菱鲆(scophthalmusmaximus)vasamrna，完整的cds，genbank登錄號(hào)：jx266620.1)制備的，并且芳香化酶和ef1-α引物是基于比目魚(yú)的芳香化酶的已報(bào)告序列(牙鲆(paralichthysolivaceus)的p450芳香化酶的p450arommrna，完整的cds，genbank登錄號(hào)：ab017182.1/牙鲆(paralichthysolivaceus)的延伸因子1α的ef1amrna，完整的cd s，genbank登錄號(hào)：ab915949.1)制備的，是將源自大菱鲆卵巢的pcr產(chǎn)物克隆之后，基于測(cè)序結(jié)果利用primer3(version0.4.0)制備的。已向genbank申請(qǐng)注冊(cè)了從大菱鲆首次分離的卵巢型芳香化酶cdna(ovary-typearomatasecdna)序列(entryid:56c5aabed25b2c5dd60009bd.aromatase)。表1中示出了本發(fā)明中使用的引物組的堿基序列及特征。

ii.大菱鲆生殖質(zhì)組織學(xué)

圖2是實(shí)驗(yàn)中使用的大菱鲆雌雄個(gè)體的生殖質(zhì)的組織學(xué)觀察照片。為了對(duì)大菱鲆魚(yú)苗的生殖腺發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行組織學(xué)觀察，提取大菱鲆的生殖腺試樣之后，將大菱鲆的生殖腺試樣在布安溶液(bouin’ssolution)中固定一天，隨后更換70％的乙醇。被固定的組織在經(jīng)過(guò)分階段的脫水過(guò)程之后，用石蠟進(jìn)行包埋，并通過(guò)切片法以7μm的厚度制作組織標(biāo)本。組織標(biāo)本通過(guò)漢森氏蘇木精(hansen’shaematoxylin) 和0.5％曙紅(eosin)對(duì)實(shí)施比較染色并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。分化為雌性的個(gè)體的卵巢(卵巢1、卵巢2)和精巢(精巢1、精巢2)的組織形態(tài)可在外形上進(jìn)行識(shí)別，并且在通過(guò)組織學(xué)分析結(jié)果確認(rèn)實(shí)驗(yàn)大菱鲆的雄性和雌性的性特異性組織觀察之后，分別將其用于基因分析。

iii.芳香化酶引物的卵巢特異性表達(dá)驗(yàn)證

為了由通過(guò)組織學(xué)分析確認(rèn)性別的各個(gè)雄性和雌性個(gè)體開(kāi)發(fā)出通過(guò)基因分析的性別辨別的方法，執(zhí)行pcr。

在摘出大菱鲆的雌性和雄性的各種組織之后，使用rnaisoplus(takara)來(lái)分離總rna。分離的rna使用nanodrop2000c進(jìn)行定量，并且僅將a260/280比率為1.8以上的rna用于實(shí)驗(yàn)。在定量之后，通過(guò)電泳確認(rèn)了各rna的18s和28srrna條帶為良好，并使用rq1無(wú)rna酶的dna酶(rq1rnasefreednase)(普洛麥格公司)去除dna。在經(jīng)dna酶處理的各rna使用topscriptcdna合成試劑盒(enzynomics)合成cdna之后，取100ng用作pcr反應(yīng)的模板。

對(duì)如上所述合成的cdna使用上述i過(guò)程中制備的根據(jù)本發(fā)明大菱鲆生殖質(zhì)特異性芳香化酶的引物和vasa以及ef1-α引物執(zhí)行pcr。pcr反應(yīng)使用各5pmole的引物組和4μl的5xhotfirepolblendmastermix(solisbiodyne)在最終體積20μl中進(jìn)行。反應(yīng)條件設(shè)置為在95℃下聚合酶活化和預(yù)變性15分鐘之后，將在95℃下變性20秒鐘，在55℃下退火20秒鐘以及在72℃下延伸50秒鐘作為1次循環(huán)，共進(jìn)行30次循環(huán)的反應(yīng)。在30次循環(huán)的反應(yīng)結(jié)束之后，在72℃下后延伸5分鐘。用1％瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增后的pcr產(chǎn)物在100伏下執(zhí)行30分鐘電泳。作為用于比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的標(biāo)記物dna，使用了100bpdna梯形標(biāo)記(enzynomics)。

圖3是示出使用根據(jù)本發(fā)明的芳香化酶、vasa和ef1-α的引物組在大菱鲆的雌性和雄性生殖質(zhì)中擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果的照片。如圖3所示，對(duì)于作為看家基因的在所有組織中表達(dá)的ef1-α，在雌雄所有試樣中確認(rèn)到了良好的擴(kuò)增結(jié)果，但沒(méi)有雌雄的區(qū)別。對(duì)于 在生殖質(zhì)中特異性表達(dá)的vasa的擴(kuò)增，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的所有個(gè)體中也顯現(xiàn)出了良好的擴(kuò)增結(jié)果和高引物特異性。但是對(duì)于顯現(xiàn)出相對(duì)高的雌性特異性表達(dá)的芳香化酶，沒(méi)在雄性中確認(rèn)出擴(kuò)增子，而在雌性個(gè)體中卻顯現(xiàn)出大量擴(kuò)增產(chǎn)物和高引物特異性。

通過(guò)本結(jié)果確認(rèn)了在大菱鲆的生殖質(zhì)中芳香化酶被雌性特異性地高水平表達(dá)，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的大菱鲆的芳香化酶引物組能夠進(jìn)行大菱鲆的性辨別。

iv.利用芳香化酶引物的實(shí)時(shí)定量pcr法的卵巢特異性表達(dá)的確認(rèn)

為了確認(rèn)大菱鲆芳香化酶的卵巢特異性表達(dá)，在各種組織中執(zhí)行實(shí)時(shí)定量pcr。利用從上述iii過(guò)程分離的各組織的總rna和根據(jù)本發(fā)明的芳香化酶引物組，并使用topreal一步法rtqpcr試劑盒(enzynomics)執(zhí)行pcr。

使用100ng的rna和各5pmole的引物、10μl的2×topreal^tm一步法rtqpcr反應(yīng)mix、1μl的topreal^tm一步法rtqpcrenzymemix(topreal^tm一步法rtqpcr試劑盒；enzynomics)在最終20μl中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置為在50℃下反轉(zhuǎn)錄30分鐘后，在95℃下預(yù)變性10分鐘，將在95℃下變性5秒鐘，在60℃下退火和延伸30秒鐘作為1次循環(huán)，共進(jìn)行45次循環(huán)的反應(yīng)。在擴(kuò)增過(guò)程之后，為了確認(rèn)得到的擴(kuò)增子的特異性，測(cè)定從60℃到95℃的熔解曲線。對(duì)于表達(dá)量，用作為看家基因的ef1-α的表達(dá)量將芳香化酶的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化并根據(jù)組織分別進(jìn)行比較。

圖4是根據(jù)組織分別示出大菱鲆芳香化酶基因的相對(duì)表達(dá)量的圖表。如圖4所示，可以確認(rèn)，在肝臟和胃中芳香化酶幾乎未得到表達(dá)，而在腦、腦垂體、脾、腎、脂肪以及腸中則表達(dá)了非常少的芳香化酶。與此相反，卵巢中顯示出比其它組織至少高30倍以上的表達(dá)值，從而能夠確認(rèn)大菱鲆的芳香化酶在卵巢中被特異性地表達(dá)。

v.利用芳香化酶引物的雌雄辨別

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為通過(guò)對(duì)性別未知的大菱鲆生殖質(zhì)中的芳香化酶的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，能夠辨別大菱鲆的性別。尤其，鑒于 能夠利用根據(jù)本發(fā)明的芳香化酶引物組檢測(cè)到在大菱鲆的卵巢中特異性地大量表達(dá)的芳香化酶的表達(dá)程度，進(jìn)行了隨后的實(shí)驗(yàn)。

為了比較大菱鲆的雌性和雄性生殖質(zhì)中的芳香化酶的表達(dá)，執(zhí)行實(shí)時(shí)定量pcr。從性別未知的大菱鲆提取組織，在用如上述iii過(guò)程的方法分離總rna之后，使用topreal一步法rtqpcr試劑盒(enzynomics)來(lái)執(zhí)行pcr。使用100ng的rna和各5pmole的引物、10μl的2×topreal^tm一步法rtqpcr反應(yīng)mix、1μl的topreal^tm一步法rtqpcrenzymemix(topreal^tm一步法rtqpcr試劑盒；enzynomics)在最終20μl中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置為在50℃下反轉(zhuǎn)錄30分鐘之后，在95℃下預(yù)變性10分鐘，將在95℃下變性5秒鐘，在60℃下退火和延伸30秒鐘作為1次循環(huán)，共進(jìn)行45次循環(huán)的反應(yīng)。在擴(kuò)增過(guò)程之后，為了確認(rèn)得到的擴(kuò)增子的特異性，測(cè)定從60℃到95℃的熔解曲線。用在生殖質(zhì)中被特異性地表達(dá)的vasa的表達(dá)量將芳香化酶的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化并根據(jù)雌性和雄性的個(gè)體分別進(jìn)行比較。

圖5是示出大菱鲆的雄性和雌性個(gè)體的生殖質(zhì)中的芳香化酶的相對(duì)表達(dá)量的圖表。(a)是示出雄性和雌性的芳香化酶的相對(duì)表達(dá)量的圖表，(b)是示出芳香化酶和vasa的熔解曲線的圖表。

通過(guò)用在生殖質(zhì)中特異性地表達(dá)vasa基因的表達(dá)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并對(duì)雄性和雌性的芳香化酶的表達(dá)量進(jìn)行比較的結(jié)果確認(rèn)到，在雄性中分別確認(rèn)了8.538×10^-2和3.010×10⁰的值，在雌性中分別確認(rèn)了3.406×10¹和1.535×10¹的值，在雌性中顯現(xiàn)出比雄性平均高約40倍左右的表達(dá)量，因此能夠通過(guò)比較大菱鲆的芳香化酶的表達(dá)量進(jìn)行大菱鲆魚(yú)苗的雌雄辨別。

由上述結(jié)果，通過(guò)對(duì)比在生殖質(zhì)中特異性表達(dá)的vasa基因和作為看家基因的ef1a基因的表達(dá)，并根據(jù)通過(guò)生殖質(zhì)的組織分析而被確認(rèn)的各個(gè)性別，確認(rèn)了芳香化酶具有在雌性的卵巢中特異性表達(dá)的特征，利用上述基因分析的性辨別方法能夠得到與利用組織學(xué)分析的性辨別方法相一致的結(jié)果。因此，確認(rèn)了通過(guò)本方法能夠進(jìn)行大菱鲆的早期雌雄辨別。

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明提供能夠在種苗階段準(zhǔn)確而容易地辨別大菱鲆的雌雄的方法，從而解決水產(chǎn)養(yǎng)殖中不易在種苗階段辨別養(yǎng)殖魚(yú)的雌雄的問(wèn)題，并且利用最近作為高附加值養(yǎng)殖魚(yú)種而受到矚目的大菱鲆的養(yǎng)殖中的雌性比雄性快速生長(zhǎng)的特性提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的效率而有助于增加養(yǎng)殖漁民的收入，因此具有工業(yè)利用可行性。