本發(fā)明屬于疾病臨床診斷領(lǐng)域，具體涉及一種通過分子生物學檢測手段診斷膀胱癌的技術(shù)，尤其涉及一種通過檢測tp53基因突變以診斷膀胱癌的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常見的惡性腫瘤。癌發(fā)病率水平在全國32個腫瘤登記處的合計為6.69/10萬，占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的2.52％。按性別統(tǒng)計，膀胱癌男、女性發(fā)病率分別為10.10/10萬和3.20/10萬，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全國32個腫瘤登記中為2.53/10萬，占全部惡性腫瘤死亡總數(shù)的1.47％，此癌多數(shù)組織學表現(xiàn)為分化良好的乳頭狀病變。

tp53基因是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)性最高的一種抑癌基因，是多種腫瘤的分子標志物。tp53位于人類染色體17p13上，編碼393個氨基酸的蛋白，該蛋白包括3個主要的結(jié)構(gòu)域：n末端反式激活位點中間的dna結(jié)合區(qū)域和c末端寡居位點，該基因的蛋白產(chǎn)物是細胞生長、增殖和損傷修復的重要調(diào)節(jié)因子。

tp53突變的泌尿上皮癌通常是高級別的腫瘤，傾向于肌層浸潤，高復發(fā)，早期轉(zhuǎn)移。tp53基因突變僅在診斷為膀胱癌的患者細胞中發(fā)現(xiàn)，在癌癥擴散的患者中，tp53突變的檢出率比在淺表癌的患者中高2.5倍，與具有較低侵襲性癌癥的患者相比，tp53在高侵襲性泌尿上皮癌中的檢出率高4倍以上。tp53是目前僅有的能診斷和預(yù)測膀胱癌預(yù)后的理想的評估指標之一?，F(xiàn)有技術(shù)中針對tp53基因位點突變的檢測方法例如cn103740818a、cn102146461a等，但其針對的樣本通常均為臨床手術(shù)獲取的病變組織，難以進行膀胱癌早期無創(chuàng)篩查。。

目前臨床上通過尿液進行膀胱癌的早期診斷的方法主要包括：尿液分析、尿脫落細胞分析，超聲、ct或mri成像等。特異性膀胱腫瘤標志物是實現(xiàn)快速、便捷、檢測的重要手段，cn106093389a、cn103018461b等致力于通過血清學方法對尿樣進行檢測來診斷膀胱癌；cn104620109a、cn105779641a、cn105229169a等主要在基因水平通過檢測膀胱腫瘤標志物診斷膀胱癌。

然而，現(xiàn)有技術(shù)中膀胱癌腫瘤標記物眾多，各檢測指標的檢測效果和檢出率變異較大。一方面，為使檢測結(jié)果具有臨床診斷意義，必須要綜合使用大量標記物，但另一方面，應(yīng)用了大量標記物不但費時耗力、價格昂貴，而且各標記物的診斷結(jié)果之間往往不一致難以給出具有臨床價值的診斷結(jié)論。比較成熟的無創(chuàng)篩查和監(jiān)測膀胱癌尿基標記物，如食品和藥物管理局(fda)批準的immunocy，核基質(zhì)蛋白22，和熒光原位雜交(fish)具有較為確定的臨床診斷意義，然而仍需要更方便、快捷，臨床意義明確的診斷方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種臨床價值明確，操作簡單快捷、結(jié)果直觀可靠、以尿液為檢測材料的無創(chuàng)傷膀胱癌早期臨床診斷方法和試劑盒。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供tp53基因的檢測試劑在制備膀胱癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其中所述tp53基因檢測試劑選自由以下組成的組：外顯子5的檢測試劑、外顯子7的檢測試劑和外顯子8的檢測試劑。

如前所述本發(fā)明的應(yīng)用，其中外顯子5的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子5中157、158、175位點的突變；外顯子7的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子7中244、245、248位點的突變；外顯子8的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子8中268、273、275、282位點的突變。

如前所述本發(fā)明的應(yīng)用，其中針對每種外顯子的檢測試劑都包括一組探針和引物，所述探針包括供體探針和受體探針，其中供體探針3’端標記有熒光供體，所述受體探針的5’端標記有熒光受體、3’端進行磷酸化修飾；上游引物和下游引物分別位于探針結(jié)合位點的兩側(cè)。

如前所述本發(fā)明的應(yīng)用，其中外顯子5的檢測試劑包括seqidno:1-2、外顯子7的檢測試劑包括seqidno:3-4、外顯子8的檢測試劑包括seqidno:5-6。

如前所述本發(fā)明的應(yīng)用，其中外顯子5的檢測試劑還包括seqidno:7-8、外顯子7的檢測試劑還包括seqidno:9-10、外顯子8的檢測試劑還包括seqidno:11-12。

本發(fā)明還提供一種實時熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于包括tp53基因檢測試劑，所述tp53基因檢測試劑選自由以下組成的組：外顯子5檢測試劑、外顯子7檢測試劑和外顯子8檢測試劑，優(yōu)選所述檢測試劑為實時熒光pcr試劑。

如前所述本發(fā)明的試劑盒，其中外顯子5的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子5中157、158、175位點的突變；外顯子7的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子7中244、245、248位點的突變；外顯子8的檢測試劑能夠檢測tp53基因外顯子8中268、273、275、282位點的突變。

如前所述本發(fā)明的試劑盒，其中針對每種外顯子的檢測試劑都包括一組探針和引物，所述探針包括供體探針和受體探針，其中供體探針3’端標記有熒光供體，所述受體探針的5’端標記有熒光受體、3’端進行磷酸化修飾；所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物分別位于探針結(jié)合位點的兩側(cè)。

如前所述本發(fā)明的試劑盒，其特征在于外顯子5的檢測試劑包括seqidno:1-2、外顯子7的檢測試劑包括seqidno:3-4、外顯子8的檢測試劑包括seqidno:5-6。

如前所述本發(fā)明的試劑盒，其特征在于外顯子5的檢測試劑還包括seqidno:7-8、外顯子7的檢測試劑還包括seqidno:9-10、外顯子8的檢測試劑還包括seqidno:11-12。

發(fā)明詳述

除另有說明以外，本發(fā)明所用術(shù)語均是本領(lǐng)域常規(guī)的含義，對術(shù)語的解釋可參考例如薩姆布魯克等主編的《分子克隆(第三版)》。對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進行詳述如下：

本發(fā)明設(shè)計至少3對探針和3對引物以及mastermix，用于檢測tp53基因外顯子5中的位點突變、外顯子7中的位點突變、外顯子8中的位點突變。三型突變之和約占膀胱癌患者的85％；且檢測方法試劑簡單，價格低廉，而且試劑盒設(shè)計最大限度地減少了需要現(xiàn)場配制反應(yīng)成分，所有步驟和相應(yīng)試劑濃度，反應(yīng)參數(shù)和判定標準均經(jīng)過優(yōu)化和驗證；反應(yīng)體系簡單，最大限度地減少了影響因素。本發(fā)明提供的檢測方法具有精準、操作簡單以及價格低廉等特點，為臨床醫(yī)學上從尿液沉淀細胞中快速檢測膀胱癌奠定了基礎(chǔ)。

第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測tp53基因外顯子5中的位點突變、外顯子7中的位點突變、外顯子8中的位點突變的試劑盒，所述試劑盒含有特異性識別tp53基因外顯子突變的熒光標記探針。

本發(fā)明中，當檢測tp53基因存在突變時，突變特異性探針與基因組dna特異性結(jié)合，而野生型dna則因為有單點的不配對，形成“泡”，從而顯示較低的熔點。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒含有特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變、外顯子7中的位點突變、外顯子8中的位點突變或其組合的熒光標記探針。

具體地，所述試劑盒可以只含有特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的熒光標記探針，可以只含有特異性識別tp53基因外顯子7中的位點突變的熒光標記探針，也可以只含有特異性識別tp53基因外顯子8中的位點突變的熒光標記探針，或者是同時含有特異性識別三種或其中兩型位點突變的熒光標記探針。

本發(fā)明中，當采用同時含有識別tp53特異性三型外顯子基因突變的三對熒光標記探針時，相比采用單一的熒光標記探針，其能夠大大增加對膀胱癌tp53基因外顯子突變的檢測效率，并提高檢測準確率，使檢測準確率接近99％。

根據(jù)本發(fā)明，所述熒光標記探針含有供體探針和受體探針，例如特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的供體探針，含有特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的受體探針；特異性識別外顯子7中的位點突變的供體探針，特異性識別外顯子7中的位點突變的受體探針；含有特異性識別外顯子8中的位點突變的供體探針，特異性識別外顯子8中的位點突變的受體探針。

本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的供體探針，其核苷酸序列含有如seqidno.1所示的片段，所述特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.2所示的片段；

本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子7中的位點突變的供體探針的核苷酸序列含有如seqidno.3所示的片段，所述特異性識別外顯子7中的位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.4所示的片段。

本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子8中的位點突變的供體探針的核苷酸序列含有如seqidno.5所示的片段，所述特異性識別外顯子8中的位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.6所示的片段。

本發(fā)明中，所述seqidno.1-6熒光標記探針含有的氨基酸序列優(yōu)選采用如下序列：

seqidno.1：5’-aagcgcctcacaacctccgtcatgtgct-flc-3’

seqidno.2：5’-lc640-tgcttgtagatggccatggcgcggacg-phos-3’.

seqidno.3：5’-ggagtcttccagtgtgatgatggtg-flc-3’

seqidno.4：5’-lc640-tgggcctccggttcatgccgc-phos-3’

seqidno.5：5’-gccggtctctcccaggacaggcac-flc-3’

seqidno.6：5’-lc640-cgcacctcaaagctgttccgtccc-phos-3’

此外本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子5中的位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.7-8所示的片段

本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子7中的位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.9-10所示的片段

本發(fā)明中特異性識別tp53基因外顯子8中的位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.11-12所示的片段

本發(fā)明中含有的檢測tp53基因三型突變的特異性引物序列如下；

seqidno.7：5’-tatctgagcagcgctcatggtg-3’

seqidno.8：5’-ccctgactttcaactctgtctcc-3’

seqidno.9：5’-cctaggttggctctgactgta-3’

seqidno.10：5’-gtggcaagtggctcctga-3’

seqidno.11：5’-ccttactgcctcttgcttctc-3’

seqidno.12：5’-cttgcggagattctcttcctc-3’

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒含有檢測tp53的mastermix，例如還含有實時熒光定量pcr技術(shù)中涉及到的onetaqdna聚合酶、dntps。本發(fā)明中的mastermix試劑濃度和反應(yīng)參數(shù)均經(jīng)過優(yōu)化和驗證，并含有陽性和陰性對照dna樣本。

本發(fā)明中，所有試劑包括熒光標記探針、特異性引物、pcr緩沖液和dntps(除酶之外)均已混合，作為“主液”，不需要單獨配制，極大地方便用戶操作。

本發(fā)明中所述mastermix為4×濃度，其包括優(yōu)化后的pcr反應(yīng)所需緩沖液、dntps和onetaqdna聚合酶。

根據(jù)本發(fā)明，所述dntps的濃度為0.05-1μm，例如可以是0.05μm、0.06μm、0.08μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明中，所述dntps的濃度優(yōu)選為0.1-0.8μm，進一步優(yōu)選為0.2μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述dna聚合酶的濃度為0.5-8u/mg，例如可以是0.5u/mg、0.6u/mg、0.7u/mg、0.8u/mg、1u/mg、1.2u/mg、1.5u/mg、2u/mg、2.5u/mg、3u/mg、3.5u/mg、4u/mg、4.5u/mg、5u/mg、5.5u/mg、6u/mg、6.5u/mg、7u/mg、7.5u/mg或8u/mg，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明中，所述dna聚合酶優(yōu)選為onetaqdna聚合酶，其濃度優(yōu)選為0.5-8u/mg，進一步優(yōu)選為1.5u/mg。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還含有介紹該試劑盒的使用說明書。

第二方面，本發(fā)明提供了一種利用如第一方面所述的用于檢測tp53基因突變的試劑盒在非疾病診斷和治療目的中檢測tp53基因突變的方法，其包括以下步驟：

(1)從篩選的病例尿液樣本中離心提取尿液細胞；

(2)從尿液細胞中提取全基因組dna5-20ng，利用含有seqidno.7-8,seqidno.9-10,seqidno.11-12所示片段的特異性引物對所述模板dna進行實時pcr擴增；

(3)將步驟(2)擴增后的片段分別加入含有如seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6所示片段的熒光標記探針或其混合物中進行加溫熔解；

(4)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷tp53基因的突變情況。

根據(jù)本發(fā)明，所述檢測tp53基因外顯子突變的方法主要用于膀胱癌的診斷和治療，在具體檢測時，可以從尿液離心沉淀細胞中檢測tp53基因外顯子5、7、8的特異性突變，也可以是從膀胱組織活檢標本中實現(xiàn)對tp53基因外顯子5、7、8的特異性突變的檢測，對于檢測樣品以及模板dna的來源也可以采用其它途徑。

本發(fā)明中，步驟(1)所述待測樣品優(yōu)選為尿液細胞離心沉淀物和/或膀胱組織，因此，所述模板dna優(yōu)選來自于尿液細胞沉淀物和/或膀胱組織活檢標本。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述實時pcr擴增的條件為：

(a)95℃預(yù)變性4min，1循環(huán)；

(b)94℃變性20s、56℃退火20s、68℃延伸40s，50個循環(huán)；

(c)37℃延伸30s，1循環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述加溫熔解的條件為：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。

本發(fā)明中，所述試劑盒由特異性dna引物和熒光標記的激發(fā)探針與被激發(fā)探針構(gòu)成，被激發(fā)探針3’磷酸化以防止其延伸，在pcr反應(yīng)過程中，如無目標點突變，則探針與dna100％互補，從而表現(xiàn)為一定的溫度融解。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述判斷tert基因的突變情況的方法為：

當預(yù)測熔點(55℃)±2℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔融曲線峰，則待測樣品含有tp53三型突變或其組合突變細胞克隆。

當預(yù)測熔點(61.8℃)±2℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔融峰，而(55℃)±2℃缺乏熔融曲線峰時，則待測樣本為含有野生型細胞群。

當多個熔融曲線峰存在，分別位于(55℃)±2℃和(61.8℃)±2℃，則待測樣本含有混合細胞群，即含有相應(yīng)突變細胞克隆以及野生型非突變細胞。

第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的用于檢測tp53基因外顯子三型突變的試劑盒在用于非疾病診斷和治療目的的檢測tp53基因外顯子5中的位點突變、外顯子7中的位點突變、外顯子8中的位點突變或其組合突變中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述tp53基因外顯子三型突變的試劑盒在用于非疾病診斷和治療目的的檢測tp53基因外顯子5中的位點突變、外顯子7中的位點突變、外顯子8中的位點突變或其組合的位點突變占所有膀胱癌患者的85％以上。

第四方面，本發(fā)明提供tp53基因外顯子5、7、8的序列，其中外顯子5的序列包括序列表中seqidno:13、外顯子7的序列包括序列表中seqidno:14、外顯子8的序列包括序列表中seqidno:15。

第五方面，本發(fā)明提供tp53基因外顯子5、7、8的擴增片段，在制備膀胱癌診斷試劑盒中的用途，所述基因外顯子5、7、8的擴增引物分別為seqidno；7-8、seqidno:9-10、seqidno:11-12。

本發(fā)明所述tp53基因外顯子5、7、8的擴增片段可以在膀胱癌診斷試劑盒中作為對照。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)經(jīng)過前期大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，選擇以外顯子5中157、158、175位點突變、外顯子7中244、245、248位點突變、外顯子8中268、273、275、282位點突變?yōu)闄z測靶標，開發(fā)出對上述三個外顯子同時進行檢測篩選膀胱癌的方法。三型突變的組合，覆蓋率高，有效彌補了單一靶標熒光定量pcr的不足。本發(fā)明所述方法在膀胱癌群體中的陽性率超過了85％，陽性準確率超過98％、陰性結(jié)果準確率超過97％，針對上述位點進行檢測能夠有效的實現(xiàn)膀胱癌的篩選。

(2)融合了普通熒光pcr檢測和多重熒光pcr檢測的優(yōu)點。引物探針的設(shè)計中采用了相同的熒光標記方案，同時使擴增產(chǎn)物大小相似，既避免了多重熒光pcr中采用多種熒光標記的技術(shù)復雜性，又確保了對多種靶標的同時檢測。只要三個外顯子中任意一個攜帶突變，就能獲得陽性結(jié)果。(3)結(jié)果判斷簡單、明確。由于本申請雖然針對三個外顯子靶標進行檢測，三個外顯子靶標中1個、2個或3個存在突變都表現(xiàn)為陽性結(jié)果，沒有突變則為陰性結(jié)果。不需要對每個靶標的檢測結(jié)果引入復雜的結(jié)果分析模型進行分析即可做出診斷，特別適用于快速篩查。

附圖說明

圖1：為本發(fā)明試劑盒檢測原理圖；

圖2：陽性對照樣本(膀胱癌細胞系)的檢測結(jié)果，出現(xiàn)61.8℃的熔融曲線峰；

圖3：正常尿液樣本檢測結(jié)果，出現(xiàn)55℃的熔融曲線峰；

圖4：早期膀胱癌患者尿液樣本檢測結(jié)果，形成兩個分別對應(yīng)55℃、61.8℃的熔融曲線峰。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

用于檢測tp53基因啟動子突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別tp53基因外顯子5中157、158、175位點的突變設(shè)計的熒光標記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

外顯子5突變的供體探針：

5’-aagcgcctcacaacctccgtcatgtgct-flc-3’

外顯子5突變的受體探針：

5’-lc640-tgcttgtagatggccatggcgcggacg-phos-3’.

(2)檢測tp53基因外顯子5中突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-tatctgagcagcgctcatggtg-3’

下游引物：5’-ccctgactttcaactctgtctcc-3’

(3)mastermix，其包括：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例2

用于檢測tp53基因外顯子7中244、245、248位點突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別tp53基因外顯子7中244、245、248位點突變的熒光標記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

外顯子7的位點突變的供體探針：5’-ggagtcttccagtgtgatgatggtg-flc-3’

外顯子7的位點突變的受體探針：5’-lc640-tgggcctccggttcatgccgc-phos-3’

(2)檢測tp53基因外顯子7中位點突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-cctaggttggctctgactgta-3’

下游引物：5’-gtggcaagtggctcctga-3’

(3)mastermix，其包括：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例3

用于檢測tp53基因外顯子8中268、273、275、282位點突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別tp53基因外顯子8中268、273、275、282的位點突變的熒光標記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

外顯子8的位點突變的供體探針：5’-gccggtctctcccaggacaggcac-flc-3’

外顯子8的位點突變的受體探針：5’-lc640-cgcacctcaaagctgttccgtccc-phos-3’

(2)檢測tp53基因外顯子8中的位點突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-ccttactgcctcttgcttctc-3’

下游引物：5’-cttgcggagattctcttcctc-3’

(4)mastermix，其包括：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(5)使用說明書一份。

實施例4

與實施例3相比，除mastermix包括：1×pcr緩沖液、0.05μm的dntps、0.8u/mg的onetaqdna聚合酶和15ng的dna模板以外，其它與實施例3相同。

實施例5

與實施例3相比，除mastermix包括：1×pcr緩沖液、1μm的dntps、0.5u/mg的onetaqdna聚合酶和20ng的dna模板以外，其它與實施例3相同。

實施例6

與實施例3相比，除mastermix包括：1×pcr緩沖液、0.6μm的dntps、8u/mg的onetaqdna聚合酶和5ng的dna模板以外，其它與實施例3相同。

實施例7

利用實施例1的試劑盒檢測tp53基因外顯子5中157、158、175位點的突變，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的尿液，離心提取尿液細胞，提取細胞全dna，利用含有seqidno.7-8所示片段的特異性引物對模板dna進行實時pcr擴增；

上游引物：5’-tatctgagcagcgctcatggtg-3’(seqidno.7)；

下游引物：5’-ccctgactttcaactctgtctcc-3’(seqidno.8)；

pcr擴增反應(yīng)體系如下：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶、10ng的dna模板、特異性引物、供體探針和受體探針；

pcr反應(yīng)條件如下：

(2)將步驟(1)擴增后的片段加入特異性識別tp53基因外顯子5第157、158、175位點突變的熒光標記探針進行加溫熔解；

外顯子5突變的供體探針：5’-aagcgcctcacaacctccgtcatgtgct-flc-3’

外顯子5突變的受體探針：5’-lc640-tgcttgtagatggccatggcgcggacg-phos-3’.

加溫熔解反應(yīng)條件如下：

(3)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷tp53基因外顯子5中的位點突變情況。

檢測原理如圖1所示，從圖1可以說明當檢測tp53外顯子5中的位點突變時，突變特異性探針與基因組dna特異性結(jié)合，而野生型dna則因為有單點的不配對，而形成“泡”，從而顯示較低的熔點。

如果目的基因tp53外顯子5無點突變存在，則在探針與dna之間出現(xiàn)單個非互補鹼基，融解溫度下降。

實施例8

利用實施例2的試劑盒檢測tp53基因外顯子7中244、245、248位點突變，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的尿液，離心提取尿液細胞，提取細胞全dna，利用含有seqidno.9-10所示片段的特異性引物對模板dna進行實時pcr擴增；

上游引物：5’-cctaggttggctctgactgta-3’(seqidno.9)；

下游引物：5’-gtggcaagtggctcctga-3’(seqidno.10)；

pcr擴增反應(yīng)體系如下：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶、10ng的dna模板、特異性引物、供體探針和受體探針；

pcr反應(yīng)條件與實施例7中相同。

(2)將步驟(1)擴增后的片段加入特異性識別tp53基因外顯子7中244、245、248位點突變的熒光標記探針進行加溫熔解；

外顯子7的突變的供體探針：5’-ggagtcttccagtgtgatgatggtg-flc-3’

外顯子7的突變的受體探針：5’-lc640-tgggcctccggttcatgccgc-phos-3’

加溫熔解反應(yīng)條件與實施例7中相同

(3)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷tp53基因外顯子7中的位點突變情況。

實施例9

利用實施例3的試劑盒檢測tp53基因外顯子8中268、273、275、282的位點突變，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的尿液，離心提取尿液細胞，提取細胞全dna，利用含有seqidno.11-12所示片段的特異性引物對模板dna進行實時pcr擴增；

上游引物：5’-ccttactgcctcttgcttctc-3’(seqidno.11)；

下游引物：5’-cttgcggagattctcttcctc-3’(seqidno.12)；

pcr擴增反應(yīng)體系如下：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶、10ng的dna模板、特異性引物、供體探針和受體探針；

pcr反應(yīng)條件與實施例7中相同。

(2)將步驟(1)擴增后的片段加入特異性識別tp53基因外顯子8中268、273、275、282的位點突變的熒光標記探針進行加溫熔解；

外顯子8的突變的供體探針：5’-gccggtctctcccaggacaggcac-flc-3’

外顯子8的突變的受體探針：5’-lc640-cgcacctcaaagctgttccgtccc-phos-3’

加溫熔解反應(yīng)條件與實施例7中相同。

(3)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷tp53基因外顯子8中的位點突變情況。

實施例10

聯(lián)合檢測tp53基因外顯子5、7、8突變的試劑盒。

(1)特異性識別tp53基因外顯子5中157、158、175位點突變、外顯子7中244、245、248位點突變、外顯子8中268、273、275、282位點突變的熒光標記探針。

外顯子5的位點突變的供體探針：

5’-aagcgcctcacaacctccgtcatgtgct-flc-3’

外顯子5的位點突變的受體探針：

5’-lc640-tgcttgtagatggccatggcgcggacg-phos-3’.

外顯子7的突變的供體探針：

5’-ggagtcttccagtgtgatgatggtg-flc-3’

外顯子7的突變的受體探針：

5’-lc640-tgggcctccggttcatgccgc-phos-3’

外顯子8的突變的供體探針：

5’-gccggtctctcccaggacaggcac-flc-3’

外顯子8的突變的受體探針：

5’-lc640-cgcacctcaaagctgttccgtccc-phos-3’

所述6種熒光標記探針混合包裝于同一容器中。

(2)同時擴增tp53基因外顯子7、10、15突變片段的試劑盒。

外顯子5上游引物：5’-tatctgagcagcgctcatggtg-3’；

外顯子5下游引物：5’-ccctgactttcaactctgtctcc-3’；

外顯子7上游引物：5’-cctaggttggctctgactgta-3’

外顯子7上游引物：5’-gtggcaagtggctcctga-3’

外顯子8上游引物：5’-ccttactgcctcttgcttctc-3’

外顯子8上游引物：5’-cttgcggagattctcttcctc-3’

所述三對引物混合包裝于同一容器中。

(3)mastermix，其包括：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例11

利用實施例10的試劑盒檢測tp53基因點突變進行檢測，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的尿液，離心提取尿液細胞，提取細胞全dna，利用含有特異性引物對模板dna進行實時pcr擴增；

pcr擴增反應(yīng)體系如下：1×pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶、10ng的dna模板、特異性引物、供體探針和受體探針；

pcr反應(yīng)條件如下：

(2)將步驟(1)擴增后的片段加入特異性熒光標記探針進行加溫熔解；

加溫熔解反應(yīng)條件如下：

(3)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷tp53基因的位點突變情況。

檢測原理如圖1所示，從圖1可以說明當檢測tp53存在位點突變時，突變特異性探針與基因組dna特異性結(jié)合，而野生型dna則因為有單點的不配對，而形成“泡”，從而顯示較低的熔點。

檢測結(jié)果如圖2-4所示，如果目的基因tp53上存在上述點突變，探針與擴增產(chǎn)物之間完全配對熔解溫度較高，為61.8±2℃；如果目的基因tp53無上述點突變存在，則在探針與dna之間出現(xiàn)單個非互補鹼基，融解溫度較低，為55±2℃。如果同時出現(xiàn)61.8℃±2的熔解峰和55±2℃的熔解峰，則表明樣本中既存在tp53上述位點發(fā)生突變的癌變細胞，也存在tp53上述位點未發(fā)生突變的野生型正常細胞。

實施例12：

臨床樣本雙盲篩檢測

采集68例臨床確診患有早期膀胱癌患者的尿液樣本，以35例正常人體檢留存尿液樣本作為對照，進行檢測。以實施例7的方法進行檢測，檢出32例陽性樣本，檢出率為47.06％；以實施例8的方法進行檢測，檢出15例陽性樣本，檢出率為22.06％；以實施例9的試劑盒進行檢測，檢出44例陽性樣本，檢出率為64.70％。實施例7-9的方法，未檢出假陽性結(jié)果。采用單外顯子進行檢測，雖然陽性準確率高，但檢出率較低，難以達到臨床篩查的要求。

以實施例11的方法進行檢測，檢出59例陽性樣本，其中1例為假陽性。陽性樣本檢出率為85.29％(58/68)，假陽性率為1.69％(1/59)，陽性結(jié)果符合率/準確率為98.31％(58/59)，陰性結(jié)果符合率/準確率為97.14％(34/35)。上述結(jié)果表明，實施例10-11中同時對tp53基因外顯子5、7、8的突變進行檢測的方法和試劑盒是最優(yōu)選的技術(shù)方案，相互之間干擾小，準確率高、檢出率符合臨床要求，適合于膀胱癌的早期篩查。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準。

序列表

<110>申請人名稱

<120>一種檢測tp53基因突變以診斷膀胱癌的方法及試劑盒

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aagcgcctcacaacctccgtcatgtgct28

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgcttgtagatggccatggcgcggacg27

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggagtcttccagtgtgatgatggtg25

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tgggcctccggttcatgccgc21

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gccggtctctcccaggacaggcac24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cgcacctcaaagctgttccgtccc24

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tatctgagcagcgctcatggtg22

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ccctgactttcaactctgtctcc23

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cctaggttggctctgactgta21

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gtggcaagtggctcctga18

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ccttactgcctcttgcttctc21

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cttgcggagattctcttcctc21

<210>13

<211>300

<212>dna

<213>外顯子5

<400>13

ctgccgtcttccagttgctttatctgttcacttgtgccctgactttcaactctgtctcct60

tcctcttcctacagtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacct120

gccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatgg180

ccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagc240

gctgctcagatagcgatggtgagcagctggggctggagagacgacagggctggttgccca300

<210>14

<211>240

<212>dna

<213>外顯子7

<400>14

gcttgccacaggtctccccaaggcgcactggcctcatcttgggcctgtgttatctcctag60

gttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggc120

ggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccaggtcaggagcc180

acttgccaccctgcacactggcctgctgtgccccagcctctgcttgcctctgacccctgg240

<210>15

<211>300

<212>dna

<213>外顯子8

<400>15

ggttgggagtagatggagcctggttttttaaatgggacaggtaggacctgatttccttac60

tgcctcttgcttctcttttcctatcctgagtagtggtaatctactgggacggaacagctt120

tgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccg180

caagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgaggtaagcaagc240

aggacaagaagcggtggaggagaccaagggtgcagttatgcctcagattcacttttatca300