亞歷山大病相關基因突變、其檢測方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳神經疾病領域，具體而言涉及亞歷山大病領域。更具體而言，本發(fā)明公開了亞歷山大病相關基因突變、其檢測方法及其用途。本發(fā)明提供了亞歷山大病的生物標記物，即突變的GFAP基因或蛋白：c.1289G>A、p.R430H；檢測突變的GFAP基因或蛋白的方法；所述方法中使用的引物對和探針；以及包含所述引物對和探針的試劑盒。
【專利說明】亞歷山大病相關基因突變、其檢測方法及其用途
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及遺傳神經疾病領域，具體而言涉及亞歷山大病。
【背景技術】
[0002]亞歷山大病是一種罕見的致命性的遺傳神經性退化疾病。1949年由亞歷山大首先提出此病，是一種由于星型膠質細胞功能異常導致的腦白質營養(yǎng)不良性疾病。典型病例表現為以額葉為主的白質異常和巨腦，組織學檢測顯示腦內存在Rosenthal纖維，為中間絲等幾種類型細胞細胞骨架的組成部分，包括中樞神經系統(tǒng)星形膠質細胞和室管膜細胞。亞歷山大病的診斷標準:以額葉為主的廣泛腦白質異常；腦室周緣Tl加權像呈高信號而T2加權像呈低信號；基底節(jié)和丘腦異常；腦干異常，特別累及了中腦和延髓；一個或多個結構(包括腦室周緣、額葉白質、視交叉、穹隆、基底節(jié)、丘腦、齒狀核和腦干)的對比強化。以上5條標準符合4條即可確診。
[0003]亞歷山大病的遺傳方式尚不十分清楚，多為散發(fā)病例，也有一些家系報道，可能為常染色體顯性遺傳。根據發(fā)病年齡及臨床表現的不同，通?？煞譃閶雰盒?、青年型和成年型。嬰兒型，目前為最常見類型，多在2歲以內起病，表現為智力發(fā)育遲緩、肢無力、肌張力降低、吸吮、飲水困難、構音不清、小腦性共濟失調，70%的患者有癲癇發(fā)作、巨腦。嬰兒型亞歷山大病的病情嚴重，常在10歲前死亡。青年型，比嬰兒型少見，在4-14歲起病，男女均可發(fā)病臨床特征與嬰兒型有很多相似處，不同點為少見癲癇發(fā)作、巨腦表現。青年型亞歷山大病的病情發(fā)展相對緩慢。成年型，罕見，在20-70歲起病，男女均可發(fā)病，首先表現為下丘腦、腦干和脊髓受損的癥狀。成年型亞歷山大病的病情進展緩慢，臨床上不易與多發(fā)性硬化相鑒別。研究表明，雖然各種類型亞歷山大病的臨床表型不同，但是截止到目前發(fā)現的各種類型亞歷山大病的大部分病例均為GFAP基因突變，但是也有部分確診為亞歷山大病患者中并沒有發(fā)現GFAP基因突變。另外，2%存在GFAP基因突變的人表型正常。對于GFAP基因突變的病例，相同的GFAP突變位點，男女患者臨床癥狀不同，這提示性別可能會影響亞歷山大疾病的發(fā)展程度。對于GFAP基因突變的家系病例，相同的GFAP基因突變位點，但是家系內患者臨床癥狀不同，這提示可能存在修飾基因或者其他因素導致患者的臨床特性不一致。
[0004]因此，有必要深入研究亞歷山大病的遺傳機制。而且，本領域仍然需要發(fā)現亞歷山大病相關的基因突變，以及檢測亞歷山大病的方法。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明涉及到的一個患病家系，兩個患者，同母異父，父母正常。兩名患者臨床表型不一致，而影像學MRI檢測發(fā)現兩名患者均具有成年型亞歷山大疾病的特征。
[0006]本發(fā)明人經過不懈的努力，發(fā)現了亞歷山大病基因的新突變，并由此提供了下述發(fā)明:
[0007]本發(fā)明涉及亞歷山大病基因新的突變，具體為:GFAP基因c.1289G>A (p.R430H)；HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)，其中 GFAP 蛋白突變 p.R430H 發(fā)生在 GFAP-ε 上。
[0008]在第一方面，本發(fā)明涉及亞歷山大病的生物標記物，即突變的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白，所述生物標記物是具有選自如下的突變基因或蛋白:
[0009]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0010]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0011]在一個實施方案中，本發(fā)明的突變GFAP基因分別為具有以下突變的SEQ ID N0:1:c.1289G>A。
[0012]在一個實施方案中，本發(fā)明的突變HDAC6基因分別為具有以下突變的SEQ IDNO:2:c.2566C>T。
[0013]在一個實施方案中，本發(fā)明的突變的GFAP-ε蛋白為具有以下突變的SEQ IDNO:3:p.R430H。
[0014]在一個實施方案中，本發(fā)明的突變的HDAC6蛋白為具有以下突變的SEQ ID NO:4:p.P856S。
[0015]在第二方面，本發(fā)明涉及一種檢測亞歷山大病的方法，所述方法包括檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點，如果有突變位點，則所述受試者被鑒定為患有亞歷山大病或易患亞歷山大病，或者其后代會患有亞歷山大病或易患亞歷山大病，所述突變位點選自如下任一種或其組合:
[0016]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0017]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0018]在一個實施方案中，GFAP基因為SEQ ID N0:1的序列表不。
[0019]在一個實施方案中，GFAP- ε蛋白為SEQ ID NO:3的序列表示。
[0020]在一個實施方案中，HDAC6基因為SEQ ID NO:2的序列表示。
[0021]在一個實施方案中，HDAC6蛋白為SEQ ID NO:4的序列表示。
[0022]在一個實施方案中，本發(fā)明的檢測亞歷山大病的方法包括如下至少一組引物擴增的步驟:
[0023]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0024]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0025]在一個實施方案中，本發(fā)明的檢測亞歷山大病的方法中檢測突變位點通過選自如下的技術進行:測序、電泳、核酸雜交、原位雜交、PCR、逆轉錄酶鏈反應和變性高效液相色
-1'TfeP曰。
[0026]在本發(fā)明第二方面的方法中，優(yōu)選檢測雜合的突變GFAP基因。
[0027]在本發(fā)明第二方面的方法中，優(yōu)選檢測純合的突變HDAC6基因。
[0028]在第三方面，本發(fā)明涉及一種檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法，所述方法包括檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點，所述突變位點選自如下任一種或其組合:
[0029]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0030]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0031]在一個實施方案中，GFAP基因為SEQ ID NO:1的序列表示。
[0032]在一個實施方案中，GFAP- ε蛋白為SEQ ID NO:3的序列表示。[0033]在一個實施方案中，HDAC6基因為SEQ ID NO:2的序列表示。
[0034]在一個實施方案中，HDAC6蛋白為SEQ ID NO:4的序列表示。
[0035]在一個實施方案中，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法包括如下至少一組引物擴增的步驟:
[0036]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0037]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0038]在一個實施方案中，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法中檢測突變位點通過選自如下的技術進行:測序、電泳、核酸雜交、原位雜交、PCR、逆轉錄酶鏈反應和變性高效液相色譜。
[0039]在第四方面，本發(fā)明涉及通過PCR檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物對，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0040]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0041]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0042]其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上前后設計，使得擴增該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。 [0043]在第五方面，本發(fā)明涉及與突變GFAP和/或HDAC6基因互補的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0044]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0045]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0046]所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因的互補區(qū)包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。
[0047]在第六方面，本發(fā)明涉及檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對，其中所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0048]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0049]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0050]其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上設計，使得其擴增產物涵蓋該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566 位。
[0051]在一個實施方案中，所述檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒包含選自如下的至少一組引物:
[0052]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0053]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0054]在第七方面，本發(fā)明涉及檢測突變GFAP和/或HDAC6基因的試劑盒，包含一個或多個核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0055]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0056]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0057]所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因上包含選自如下位置的基因組序列或cDNA序列上的區(qū)域互補:GFAP基因cDNA序列弟1289似和/或HDAC6基因cDNA序列弟2566位。
[0058]在第八方面，本發(fā)明涉及GFAP基因的突變外顯子7A和/或HDAC6基因突變外顯子25。
[0059]在本發(fā)明中，引物對SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6用于擴增GFAP基因的野生型或突變外顯子7A ;引物對SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8用于擴增HDAC6基因的野生型或突變外顯子25。
[0060]本發(fā)明人發(fā)現，本發(fā)明的GFAP基因的雜合突變即致病；而本發(fā)明的HDCA6基因雜合并不致病，如本文中患者的母親，本發(fā)明的HDCA6基因突變使患者的臨床病癥不同。
[0061]本發(fā)明發(fā)現了亞歷山大病相關基因的2個新的突變位點，對該基因位點的檢測可能用于亞歷山大病患者的輔助診斷，并且可能有利于明確亞歷山大病患者的分子診斷。因此，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法可以用于診斷亞歷山大病的目的，例如產前診斷、植入前遺傳學診斷(PGD)、患者篩查。然而，本發(fā)明的方法并不僅限于用于診斷疾病的目的。
[0062]另外，本發(fā)明的檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法也可以用于非診斷疾病的目的。所述的非檢測疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多態(tài)性，用于家族演化研究。本發(fā)明可以對亞歷山大病的發(fā)病機理提供重要線索，對亞歷山大病的診斷治療具有十分重要的意義。這樣的應用也是本領域技術人員可以理解的。
[0063]例如，根據本文的描述可以看出，有些個體攜帶本發(fā)明所述的突變HDAC6基因但不患亞歷山大病，例如僅一條染色體攜帶突變的雜合基因型。對這部分人群的檢測可以任何不涉及診斷疾病的目的，因為這些個體并不患病。但對于他們進行檢測的結果可以作為例如有用信息使用，例如作為育前檢查的重要指標，指導生育，或者用于突變攜帶者篩查，或者作為SNP分布和多態(tài)性研究的工具或者追蹤基因突變或家族演化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1患者家系圖，示出患者(I1-2、I1-4)及其父母(1-1-3)、兄弟姐妹(ΙΙ-1、ΙΙ-3和I1-5-7)和子女(II1-1-4)的關系圖。圓表示女性，方框表示男性。
[0065]圖2患者腦部MRI圖，其中患者Ptl (b、C、d、e、g),患者Pt2 (a、f)。
[0066]圖3GFP轉錄本結構圖。
[0067]圖4患者Ptl、Pt2及患者母親GFP突變位點的測序。
[0068]圖5患者Ptl、Pt2及患者母親HDAC6突變位點的測序圖。Wt是指野生型。
[0069]圖6HDAC6功能驗證。Ct指對照。
[0070]野生型HDAC6基因和GFAP基因的cDNA和所編碼的蛋白序列說明(下劃線示出本發(fā)明相關的突變發(fā)生的位置):
[0071]GFAPcDNA，示出野生型GFAP基因的cDNA的核苷酸序列，1296nt (SEQ ID NO:1):
[0072]A TGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCCGCTCCTACGTCTCCTCAGGGGAGATGATGGTGGGGGGCCTGGCTCCTGGCCGCCGTCTGGGTCCTGGCACCCGCCTCTCCCTGGCTCGAATGCCCCCTCCACTCCCGACCCGGGTGGATTTCTCCCTGGCTGGGGCACTCAATGCTGGCTTCAAGGAGACCCGGGCCAGTGAGCGGGCAGAGATGATGGAGCTCAATGACCGCTTTGCCAGCTACATCGAGAAGGTTCGCTTCCTGGAACAGCAAAACAAGGCGCTGGCTGCTGAGCTGAACCAGCTGCGGGCCAAGGAGCCCACCAAGCTGGCAGACGTCTACCAGGCTGAGCTGCGAGAGCTGCGGCTGCGGCTCGATCAACTCACCGCCAACAGCGCCCGGCTGGAGGTTGAGAGGGACAATCTGGCACAGGACCTGGCCACTGTGA
GGCAGAAGCTCCAGGATGAAACCAACCTGAGGCTGGAAGCCGAGAACAACCTGGCTGCCTATAGACAGGAAGCAGAT
GAAGCCACCCTGGCCCGTCTGGATCTGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGGAGGAGGAGATCCGGTTCTTGAGGAAGAT
CCACGAGGAGGAGGTTCGGGAACTCCAGGAGCAGCTGGCCCGACAGCAGGTCCATGTGGAGCTTGACGTGGCCAAGC
CAGACCTCACCGCAGCCCTGAAAGAGATCCGCACGCAGTATGAGGCAATGGCGTCCAGCAACATGCATGAAGCCGAA
GAGTGGTACCGCTCCAAGTTTGCAGACCTGACAGACGCTGCTGCCCGCAACGCGGAGCTGCTCCGCCAGGCCAAGCA
CGAAGCCAACGACTACCGGCGCCAGTTGCAGTCCTTGACCTGCGACCTGGAGTCTCTGCGCGGCACGAACGAGTCCC
TGGAGAGGCAGATGCGCGAGCAGGAGGAGCGGCACGTGCGGGAGGCGGCCAGTTATCAGGAGGCGCTGGCGCGGCTG
GAGGAAGAGGGGCAGAGCCTCAAGGACGAGATGGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAGGACCTGCTCAATGTCAAGCT
GGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTAGAGGGCGAGGAGAACCGGATCACCATTCCCGTGCAGA
CCTTCTCCAACCTGCAGATTCGAGGGGGCAAAAGCACCAAAGACGGGGAAAATCACAAGGTCACAAGATATCTCAAA
AGCCTCACAATACGAGTTATACCAATACAGGCTCACCAGATTGTAAATGGAACGCCGCCGGCTCGCGGTTAG
[0073]HDAC6cDNA，示出野生型 HDAC6 基因的 cDNA 的核苷酸序列，3648nt(SEQ ID N0:2):
[0074]ATGACCTCAACCGGCCAGGATTCCACCACAACCAGGCAGCGAAGAAGTAGGCAGAACCCCCAGTCGCCCCCTCAGGACTCCAGTGTCACTTCGAAGCGAAATATTAAAAAGGGAGCCGTTCCCCGCTCTATCCCCAATCTAGCGGAGGTAAAGAAGAAAGGCAAAATGAAGAAGCTCGGCCAAGCAATGGAAGAAGACCTAATCGTGGGACTGCAAGGGATGGATCTGAACCTTGAGGCTGAAGCACTGGCTGGCACTGGCTTGGTGTTGGATGAGCAGTTAAATGAATTCCATTGCCTCTGGGATGACAGCTTCCCGGAAGGCCCTGAGCGGCTCCATGCCATCAAGGAGCAACTGATCCAGGAGGGCCTCCTAGATCGCTGCGTGTCCTTTCAGGCCCGGTTTGCTGAAAAGGAAGAGCTGATGTTGGTTCACAGCCTAGAATATATTGATCTGATGGAAACAACCCAGTACATGAATGAGGGAGAACTCCGTGTCCTAGCAGACACCTACGACTCAGTTTATCTGCATCCGAACTCATACTCCTGTGCCTGCCTGGCCTCAGGCTCTGTCCTCAGGCTGGTGGATGCGGTCCTGGGGGCTGAGATCCGGAATGGCATGGCCATCATTAGGCCTCCTGGACATCACGCCCAGCACAGTCTTATGGATGGCTATTGCATGTTCAACCACGTGGCTGTGGCAGCCCGCTATGCTCAACAGAAACACCGCATCCGGAGGGTCCTTATCGTAGATTGGGATGTGCACCACGGTCAAGGAACACAGTTCACCTTCGACCAGGACCCCAGTGTCCTCTATTTCTCCATCCACCGCTACGAGCAGGGTAGGTTCTGGCCCCACCTGAAGGCCTCTAACTGGTCCACCACAGGTTTCGGCCAAGGCCAAGGATATACCATCAATGTGCCTTGGAACCAGGTGGGGATGCGGGATGCTGACTACATTGCTGCTTTCCTGCACGTCCTGCTGCCAGTCGCCCTCGAGTTCCAGCCTCAGCTGGTCCTGGTGGCTGCTGGATTTGATGCCCTGCAAGGGGACCCCAAGGGTGAGATGGCCGCCACTCCGGCAGGGTTCGCCCAGCTAACCCACCTGCTCATGGGTCTGGCAGGAGGCAAGCTGATCCTGTCTCTGGAGGGTGGCTACAACCTCCGCGCCCTGGCTGAAGGCGTCAGTGCTTCGCTCCACACCCTTCTGGGAGACCCTTGCCCCATGCTGGAGTCACCTGGTGCCCCCTGCCGGAGTGCCCAGGCTTCAGTTTCCTGTGCTCTGGAAGCCCTTGAGCCCTTCTGGGAGGTTCTTGTGAGATCAACTGAGACCGTGGAGAGGGACAACATGGAGGAGGACAATGTAGAGGAGAGCGAGGAGGAAGGACCCTGGGAGCCCCCTGTGCTCCCAATCCTGACATGGCCAGTGCTACAGTCTCGCACAGGGCTGGTCTATGACCAAAATATGATGAATCACTGCAACTTGTGGGACAGCCACCACCCTGAGGTACCCCAGCGCATCTTGCGGATCATGTGCCGTCTGGAGGAGCTGGGCCTTGCCGGGCGCTGCCTCACCCTGACACCGCGCCCTGCCACAGAGGCTGAGCTGCTCACCTGTCACAGTGCTGAGTACGTGGGTCATCTCCGGGCCACAGAGAAAATGAAAACCCGGGAGCTGCACCGTGAGAGTTCCAACTTTGACTCCATCTATATCTGCCCCAGTACCTTCGCCTGTGCACAGCTTGCCACTGGCGCTGCCTGCCGCCTGGTGGAGGCTGTGCTCTCAGGAGAGGTTCTGAATGGTGCTGCTGTGGTGCGTCCCCCAGGACACCACGCAGAGCAGGATGCAGCTTGCGGTTTTTGCTTTTTCAACTCTGTGGCTGTGGCTGCTCGCCATGCCCAGACTATCAGTGGGCATGCCCTACGGATCCTGATTGTGGATTGGGATGTCCACCACGGTAATGGAACTCAGCACATGTTTGAGGATGACCCCAGTGTGCTATATGTGTCCCTGCACCGCTATGATCATGGCACCTTCTTCCCCATGGGGGATGAGGGTGCCAGCAGCCAGA
TCGGCCGGGCTGCGGGCACAGGCTTCACCGTCAACGTGGCATGGAACGGGCCCCGCATGGGTGATGCTGACTACCTA
GCTGCCTGGCATCGCCTGGTGCTTCCCATTGCCTACGAGTTTAACCCAGAACTGGTGCTGGTCTCAGCTGGCTTTGA
TGCTGCACGGGGGGATCCGCTGGGGGGCTGCCAGGTGTCACCTGAGGGTTATGCCCACCTCACCCACCTGCTGATGG
GCCTTGCCAGTGGCCGCATTATCCTTATCCTAGAGGGTGGCTATAACCTGACATCCATCTCAGAGTCCATGGCTGCC
TGCACTCGCTCCCTCCTTGGAGACCCACCACCCCTGCTGACCCTGCCACGGCCCCCACTATCAGGGGCCCTGGCCTC
AATCACTGAGACCATCCAAGTCCATCGCAGATACTGGCGCAGCTTACGGGTCATGAAGGTAGAAGACAGAGAAGGAC
CCTCCAGTTCTAAGTTGGTCACCAAGAAGGCACCCCAACCAGCCAAACCTAGGTTAGCTGAGCGGATGACCACACGA
GAAAAGAAGGTTCTGGAAGCAGGCATGGGGAAAGTCACCTCGGCATCATTTGGGGAAGAGTCCACTCCAGGCCAGAC
TAACTCAGAGACAGCTGTGGTGGCCCTCACTCAGGACCAGCCCTCAGAGGCAGCCACAGGGGGAGCCACTCTGGCCC
AGACCATTTCTGAGGCAGCCATTGGGGGAGCCATGCTGGGCCAGACCACCTCAGAGGAGGCTGTCGGGGGAGCCACT
CCGGACCAGACCACCTCAGAGGAGACTGTGGGAGGAGCCATTCTGGACCAGACCACCTCAGAGGATGCTGTTGGGGG
AGCCACGCTGGGCCAGACTACCTCAGAGGAGGCTGTAGGAGGAGCTACACTGGCCCAGACCACCTCGGAGGCAGCC ATGGAGGGAGCCACACTGGACCAGACTACGTCAGAGGAGGCTCCAGGGGGCACCGAGCTGATCCAAACTCCTCTAGC
CTCGAGCACAGACCACCAGACCCCCCCAACCTCACCTGTGCAGGGAACTACACCCCAGATATCTCCCAGTACACTGA
TTGGGAGTCTCAGGACCTTGGAGCTAGGCAGCGAATCTCAGGGGGCCTCAGAATCTCAGGCCCCAGGAGAGGAGAAC
CTACTAGGAGAGGCAGCTGGAGGTCAGGACATGGCTGATTCGATGCTGATGCAGGGATCTAGGGGCCTCACTGATCA
GGCCATATTTTATGCTGTGACACCACTGCCCTGGTGTCCCCATTTGGTGGCAGTATGCCCCATACCTGCAGCAGGCC
TAGACGTGACCCAACCTTGTGGGGACTGTGGAACAATCCAAGAGAATTGGGTGTGTCTCTCTTGCTATCAGGTCTAC
TGTGGTCGTTACATCAATGGCCACATGCTCCAACACCATGGAAATTCTGGACACCCGCTGGTCCTCAGCTACATCGA
CCTGTCAGCCTGGTGTTACTACTGTCAGGCCTATGTCCACCACCAGGCTCTCCTAGATGTGAAGAACATCGCCCACC
AGAACAAGTTTGGGGAGGATATGCCCCACCCACACTAA
[0075]GFP蛋白序列，示出GFAPcDNA序列編碼的膠質纖維酸性蛋白的氨基酸序列，43Iaa(SEQ ID N0:3):
[0076]MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRGGKSTKDGENHKVTRYLKSLTIRVIPIQAHQIVNGTPPARG
[0077]HDAC6蛋白序列，示出HDAC6cDNA序列編碼的組蛋白去乙?；?的氨基酸序列，1215aa (SEQ ID N0:4):
[0078]MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIPNLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVGLQGMDLNLEAEALAGTGLVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQARFAEKEELMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVYLHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAIIRPPGHHAQHSLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQFTFDQDPSVLYFSIHRYEQGRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTINVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQGDPKGEMAATPAGFAQLTHLLMGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCPMLESPGAPCRSAQASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEEDNVEESEEEGPffEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMMNHCNLWDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCHSAEYVGHLRATEKMKTRELHRESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAVAARHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSLHRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFTVNVAWNGPRMGDADYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPEGYAHLTHLLMGLASGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPPPLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYffRSLRVMKVEDREGPSSSKLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAGMGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQPSEAATGGATLAQTISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTSEDAVGGATLGQTTSEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSEEAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLIGSLRTLELGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTDQAIFYAVTPLPWCPHLVAVCPIPAAGLDVTQPC⑶CGTIQENWVCLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQAYVHHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH
【具體實施方式】
[0079]發(fā)明人收集到一個意大利的異父同胞家系，父母(圖1中I中的1-3)表型正常，異父同胞的女性患者(I1-2)和男性患者(I1-4)均表現為神經類疾病，但是兩者臨床癥狀不同。
[0080]患者Ptl (圖1，11-2)，女，68歲。55歲發(fā)病，起病隱襲、智力減退伴隨中度共濟失調、構音障礙、吞咽困難、腭肌陣攣。61歲腦電圖EEG檢查表現出非特異性刺激性異常、PEV改變、EMG正常、眼球運動正常、簡易精神狀態(tài)檢查MMSE得分為22/30。該綜合征病程發(fā)病緩慢、起病時出現尿失禁。
[0081]患者Pt2 (圖1，11_4)，男，60歲。52歲因隱襲性漸進性行走困難就診、患者46歲時出現右下肢僵硬無力、3-5年后逐漸累及到右上肢和左上下肢。56歲需輔助輪椅行走；發(fā)音、吞咽困難；伴隨嚴重四痙攣、雙側踝陣攣；雙側巴賓斯基征；雙側顳肌、骨間肌和脛骨前肌發(fā)育不良。感官檢驗和植物神經系統(tǒng)檢查均正常，例如眼球運動正常。肌電圖EMG顯示神經源性異常、無自發(fā)顫動。神經傳導研究表明，下肢運動性軸索型神經病變、外周感覺神經傳導正常。上述檢測結果顯示患者具有嚴重的肢體和延髓區(qū)運動神經元疾病(MND);病程呈緩慢、漸進性發(fā)展；患者無認知功能減退。
[0082]顱腦MRI (來自患者Ptl和Pt2在醫(yī)院檢查的圖像。圖2，其中患者Ptl (b、c、d、e、g)，患者Pt2 (a、f))示兩個患者均表現出輕微的惡化，包括蝌蚪狀的延髓和頸脊髓萎縮，前后中央腦回和額底區(qū)呈現萎縮段，齒狀核，腦室周緣、皮質下白質異常信號，與文獻中亞歷山大病患者MRI的癥狀極為相似。
[0083]由于患者Ptl和Pt2為同母異父，因此對mtDNA進行了測序，未發(fā)現mtDNA基因突變，排除了線粒體遺傳mtDNA基因突變導致的疾病。發(fā)明人對GFAP的9個外顯子進行了sanger測序未見突變，因此發(fā)明人利用Agilent Sureselect50M Kit結合Solexa高通量測序技術對病例PtI和Pt2進行了外顯子組測序，具體方法參見實施列3。
[0084]結果，發(fā)明人在病例Ptl中發(fā)現有87380個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6866處的插入/缺失，在病例Pt2中發(fā)現有89065個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6760處的插入/缺失。隨后通過 dbSNP 數據庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi)、千人基因組數據庫(www.1OOOgenomes.0rg/)、HapMap8 數據庫(http://hapmap.ncb1.nlm.nih.gov/)等公共數據庫的過濾，去掉所有已知的且在數據庫中等位基因頻率大于0.005的變異。去掉同義突變，將剩下的非同義/剪接位點突變和微小插入缺失進行優(yōu)先選擇:根據患者癥狀，優(yōu)先考慮已知亞歷山大病致病基因GFAP基因，發(fā)明人找到了 GFAP基因上的一個新突變，G到A的錯義突變c.1289G>A，導致R430H的氨基酸改變。
[0085]為 了進一步解釋Ptl和Pt2臨床癥狀差異是否還有其他突變導致，發(fā)明人進一步用 Endeavour software (http://homes.esat.kuleuven.be/bioiuser/endeavour/tool/endeavourweb.php)對候選基因進行優(yōu)先級排序,位于染色體Xpll.23的HDAC6基因綜合排名第一，該基因編碼組蛋白去乙酰化酶6?；颊逷t2為半合子突變，C到T的錯義突變c.25660T,導致P856S氨基酸改變。
[0086]然后，發(fā)明人又通過Polyphen2 (http: / / genetics, bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT (http: //sift, bi 1.a-star.edu.Sg)、Mutpred (http: //mutpred.mutdb.0rg)、Pmut (http://mmb.pcb.ub.es/PMut)軟件按照標準方法進行預測,進一步確認了上述2個
突變基因。
[0087]已知，GFAP基因(0MM:*137780)位于17號染色體，編碼膠質纖維酸性蛋白。膠質纖維酸性蛋白被認為是星形膠質細胞的成熟標志。對于健康成人，星形膠質細胞占中樞神經系統(tǒng)細胞總數的40%。GFAP蛋白是細胞質內中間絲蛋白的主要構成部分，在膠質細胞分化中參與細胞骨架的形成。已有實驗證實GFAP蛋白在腦損傷發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。GFAP基因突變會導致腦內Rosenthal纖維的積累，而腦內Rosenthal纖維是確診亞歷山大病的組織學前提。由于選擇性剪接，GFAP基因存在多個轉錄本，見圖3，GFAP-a (GenBank登錄號 ΝΡ_002046.1)，含有 9 個外顯子。GFAP- ε (GenBank 登錄號 ΝΡ_001124491.1)，由于選擇性剪接，C末端最后35個氨基酸與GFAP-α不同。GFAP-κ (GenBank登錄號NP_001229305.1)C末端與GFAP-α不同，存在7B外顯子。最常見的轉錄本是GFAP-a，截止到目前，GFAP基因的突變都是在這個轉錄本上。臨床上遺傳檢測通常檢測該轉錄本上9個外顯子是否存在突變。但是目前仍有少數確診的患者該基因未發(fā)現突變。發(fā)明人在GFAP- a轉錄本上尚未找到致病突變，通過外顯子測序后意外發(fā)現，2個患者GFAP-ε轉錄本外顯子7Α編碼區(qū)上均存在c.1289G>A和p.R430H的雜合突變。這個突變也可以在GFAP-κ轉錄本的3，-UTR上找到。
[0088]已知HDAC6基因位于X染色體，編碼組蛋白去乙?；?，為HDAC家族中b類成員之一，催化組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基去乙酰化。HDAC6蛋白擁有兩個獨特的催化區(qū)域，且高度同源，均有去乙酰化酶活性，決定了它可以使不同底物去乙?；?。C末端有一個保守的半胱氨酸和組氨酸富含區(qū)構成鋅指結構ZnF-UBP。在體內，HDAC6蛋白能夠催化組蛋白和非組蛋白如去乙?；福隗w內HDAC6蛋白除有組蛋白去乙?；富钚酝?，還可介導非組蛋白如a-微管蛋白(tubulin)、熱休克蛋白90 (HSP90)和抗氧化蛋白去乙酰化。在小鼠和果蠅的模型中，HDAC6基因的突變會導致如帕金森病、亨廷頓病神經退行性變疾病。a -微管蛋白是HDAC6蛋白去乙?；牡孜镏?，在體內去乙?；奈⒐艿鞍卓焖俳饩?，而乙?；腶-微管蛋白易于聚集而有利于微管的穩(wěn)定。有意思的是，與肌萎縮性側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis)疾病相關的 RNA 結合調控因子 TDP-43 和 FUS/TLS 以HDAC6mRNA作為特異性底物。在果蠅模型中，沉默TDP-43導致HDAC6基因下調表達，而過量表達HDAC6基因，使患脊髓小腦性共濟失調的果蠅癥狀得到緩解。
[0089]由于外顯子組測序存在一定程度的假陽性，接下來，發(fā)明人又利用Sanger測序方法，對這兩個基因的突變位點在家系內進行了驗證，GFAP基因在患者Ptl和Pt2中均為雜合突變，而在家系內1-2 (母親)、11-6、11-7、111-1、111_4均無突變(見圖4)。HDAC6基因在患者Pt2中為半合子突變，患者Ptl中無突變，家系內1-2 (母親)為雜合突變，11-6、I1-7均無突變(見圖5)。EVS外顯子數據庫(http://evs.gs.Washington.edu/EVS)中未發(fā)現這兩個位點的突變。
[0090]為了進一步解釋HDAC6基因突變導致患者Pt2特有的運動神經元疾病表型，發(fā)明人測定了 Ptl和Pt2患者以及正常人成纖維細胞中HDAC6基因的表達量，結果表明兩個患者及對照中HDAC6基因表達量并無明顯差異(圖6A)。接著發(fā)明人利用免疫沉淀的方法檢測到患者Pt2乙?；摩?微管蛋白較患者Ptl及對照明顯增加(圖6B)。免疫細胞化學染色顯示患者Pt2成纖維細胞核周區(qū)域乙?；?-微管蛋白成塊異常聚集(圖6C，上排、中排為20倍鏡，下排為100倍鏡)。從圖6D可以明顯地看出患者Pt2成纖維細胞中多葉核/多形核的比例較對照和患者Ptl顯著性增加，而對照和患者Ptl之間無顯著性差異。因此可以推測HDAC6基因突變，導致微管組織中心功能失調，打破了 α -微管蛋白乙?；c去乙?；膭討B(tài)平衡，最終導致神經退行性病變，使患者表現出運動神經元疾病的癥狀。
[0091]因此，綜上所述，發(fā)明人認為本發(fā)明找到的GFAP基因的突變是成年型亞歷山大疾病的另一致病突變位點，而HDAC6基因的半合子突變使Pt2患者具有不同于患者Ptl的臨床表型(見表1)。
[0092]表1.2名患者的基因突變位點
【權利要求】
1.一種亞歷山大病的生物標記物，所述生物標記物包括突變的GFAP基因或蛋白: c.1289G>A、p.R430H。
2.權利要求1的生物標記物，所述生物標記物還包括突變的HDAC6基因或蛋白: c.2566C>T、p.P856S。
3.權利要求1或2的生物標記物，所述突變GFAP蛋白為SEQID N0:3的序列中具有以下突變:
p.R430H。
4.權利要求2的生物標記物，所述突變HDAC6蛋白為SEQID N0:4的序列中具有以下突變:
p.P856S。
5.一種檢測受試者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突變位點的方法，所述突變位點選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S。
6.權利要求5的方法，包括如下至少一組引物擴增的步驟:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
7.檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物對，所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上前后設計，使得擴增該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
8.與突變GFAP和/或HDAC6基因互補的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T, 所述探針與突變GFAP和/或HDAC6基因的互補區(qū)包括選自如下的基因組序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
9.檢測突變GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對，并且/或者包含一個或多個核酸探針，其中所述突變是選自如下任一種或其組合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物對分別基于選自如下的位置在基因組序列或cDNA序列上設計，使得其擴增產物涵蓋該位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
10.權利要求9的試劑盒，所述引物對選自如下的一組或兩組:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
【文檔編號】C12N15/11GK103966226SQ201310047545
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優(yōu)先權日:2013年2月6日
【發(fā)明者】方明艷, 蓋齊·達尼埃萊, 王海榮, 劉軒竹, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請人:深圳華大基因研究院