本發(fā)明屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真核表達(dá)體系及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，il-2)，又名t細(xì)胞生長(zhǎng)因子(tcellgrowthfactor，tcrf)。il-2是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下，由t淋巴細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的在機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要調(diào)節(jié)作用的一種細(xì)胞因子。il-2是人體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物質(zhì)，與其他免疫相關(guān)細(xì)胞因子有協(xié)同和拮抗作用，共同完成人體免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)作用；其能夠刺激nk、ctl、lak等細(xì)胞的活化和增殖，也能促使t淋巴細(xì)胞、nk細(xì)胞等產(chǎn)生干擾素、腫瘤壞死因子等，在抗病毒、抗細(xì)菌感染和抗腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程中，存在免疫逃避導(dǎo)致的免疫監(jiān)視功能異常。腫瘤患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，如nk、ctl、lak等，不能正常發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷效果。而前述免疫殺傷細(xì)胞的活化和增殖均是以il-2為基礎(chǔ)的[dhupkarp,gordonn.interleukin-2:oldandnewapproachestoenhanceimmune-therapeuticefficacy.advexpmedbiol.2017；995:33-51.]。如果能夠適時(shí)提供外源il-2，就有可能協(xié)助患者的免疫系統(tǒng)改善對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷功能。這就是il-2進(jìn)行腫瘤免疫治療的免疫學(xué)基礎(chǔ)。目前的il-2體內(nèi)注射免疫治療方法只是非特異地提高患者體內(nèi)的il-2蛋白水平，其免疫調(diào)節(jié)作用和促腫瘤殺傷能力較弱，而且缺乏特異性調(diào)節(jié)病灶腫瘤微環(huán)境il-2水平、促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性免疫治療的作用[humrichjy,riemekasteng.clinicaltrials:theriseofil-2therapy-anovelbiologictreatmentforsle.natrevrheumatol.2016dec；12(12):695-696.]。

γ干擾素(ifnγ)屬于ii型干擾素，是一種分泌型蛋白，分泌進(jìn)而去除信號(hào)肽后其分子由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為40kda，以同源二聚體或四聚體的形式存在。ifnγ主要由t細(xì)胞和nk細(xì)胞產(chǎn)生，其基因位于人的12號(hào)染色體上。ifnγ在臨床上常用于抗病毒和抗腫瘤治療[textora,listopadjj,wührmannll,perezc,kruschinskia,chmielewskim,abkenh,blankensteint,charoj.efficacyofcart-celltherapyinlargetumorsreliesuponstromaltargetingbyifnγ.cancerres.2014dec1；74(23):6796-805.]。ifnγ的體內(nèi)應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒感染的抑制，從而在免疫調(diào)控方面獲得廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，ifnγ在體內(nèi)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，阻礙惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的功能。臨床研究結(jié)果表明，ifnγ對(duì)白血病、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤及骨髓瘤等均可以產(chǎn)生明顯的抑制效果。ifnγ主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫免疫細(xì)胞活性，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)原位腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移病灶中腫瘤細(xì)胞的殺傷，也可以通過(guò)直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死等方式直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期、抑制腫瘤組織的血管生成抑制腫瘤細(xì)胞增殖。但是目前的ifnγ體內(nèi)注射治療方法只能實(shí)現(xiàn)患者體內(nèi)ifnγ蛋白水平的非特異性提高，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境中ifnγ水平的特異性高效靶向調(diào)節(jié)[konjevicg,radenkovics,srdict,jurisicv,stamatoviclj,milovicm.associationofdecreasednkcellactivityandifnγexpressionwithpstatdysregulationinbreastcancerpatients.jbuon.2011apr-jun；16(2):219-26.]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系，該真核表達(dá)體系通過(guò)使被轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞同時(shí)表達(dá)il-2蛋白和ifnγ蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞特異性的基因免疫治療，既能在病灶局部微環(huán)境提高細(xì)胞因子含量進(jìn)而高效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性直接影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生針對(duì)靶細(xì)胞的特異性治療效果；在實(shí)現(xiàn)病灶微環(huán)境及靶細(xì)胞中il-2和ifnγ比例可控的前提下，提高il-2和ifnγ表達(dá)水平。

為解決上述問(wèn)題，一方面，本發(fā)明在于提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系的制備方法，包括以下步驟：

(1)以化學(xué)合成的寡核苷酸單鏈混合物為靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物：gacacgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttg(seqidno.2)

下游引物：gacacggatccttactgggatgctcttcgacc(seqidno.3)

在含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通過(guò)pcr反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得第一輪pcr產(chǎn)物；

以第一輪pcr反應(yīng)液為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，進(jìn)行第二次擴(kuò)增；進(jìn)行電泳回收基因片段；

(2)將步驟(1)電泳所得基因片段在限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi存在下進(jìn)行雙酶切，得到酶切的基因片段；

(3)載體pires2-egfp在限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi存在下進(jìn)行雙酶切，得到酶切的載體片段，序列如seqidno:6所示；

(4)連接基因片段和載體片段，構(gòu)建pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中第一輪pcr反應(yīng)體系為：寡核苷酸單鏈混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul濃度為25mmol/l；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul5u/ul；ddh2o補(bǔ)足至50ul。擴(kuò)增時(shí)，dntp濃度為25mmol/l，pfu聚合酶為5u/ul。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中第一輪pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反應(yīng)循環(huán)22次；72℃6min。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中第二輪pcr反應(yīng)體系為：第一輪pcr產(chǎn)物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul25mmol/l；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul5u/ul；ddh2o補(bǔ)足至41ul。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中第二輪pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反應(yīng)循環(huán)22次；72℃6min。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中雙酶切的酶切條件為：步驟(1)基因片段20ul；限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer5ul；ddh2o補(bǔ)足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中雙酶切的酶切條件為：pires2-egfp1.5ug；限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer10ul；ddh2o補(bǔ)足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)中連接反應(yīng)條件為：酶切的基因片段6ul；酶切的載體片段，5ul；10×t4dnaligasebuffer2ul；t4dnaligase1ul，5u/ul；ddh2o補(bǔ)足至20ul；連接混合液于16℃水浴連接2h。

另一方面，本發(fā)明提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系，所述真核表達(dá)體系同時(shí)包含il-2基因的核苷酸序列和ifnγ基因的核苷酸序列，其中，所述il-2基因的核苷酸序列如seqidno:4所示；所述ifnγ基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。

進(jìn)一步地，所述真核表達(dá)體系同時(shí)含有il-2和ifnγ蛋白的編碼基因，其編碼基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

另一方面，本發(fā)明提供含有il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系的重組菌。

所述重組菌是指將真核表達(dá)體系導(dǎo)入目的菌得到的重組菌。

本發(fā)明提供一種dna片段，其包括如下三種之一：1)編碼區(qū)為seqidno:1所示的dna分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且具有相同功能的dna分子；3)與1)限定的dna序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且具有相同功能的dna分子。

另一方面，本發(fā)明提供il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系在腫瘤免疫治療中的用途。

本發(fā)明真核表達(dá)體系的制備方法具有較高的回收率和較好的保持基因的生物活性，適合大規(guī)模純化和制備，易于產(chǎn)業(yè)化。

本發(fā)明通過(guò)將il-2基因、ifnγ基因插入載體構(gòu)建成新的表達(dá)體系，在目的細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染，獲得蛋白表達(dá)，得到產(chǎn)量和純度高的il-2蛋白和ifnγ蛋白。并具有目的細(xì)胞中兩種蛋白的表達(dá)比例可控的特性，控制二者的表達(dá)量為1:1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供一種共表達(dá)il-2和ifnγ蛋白的真核表達(dá)體系，采用載體來(lái)同時(shí)負(fù)載il-2基因和ifnγ基因，能夠通過(guò)同一真核表達(dá)體系調(diào)控il-2蛋白和ifnγ蛋白表達(dá)水平；并可以減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源性基因序列的引入；同時(shí)實(shí)現(xiàn)il-2蛋白與ifnγ蛋白相對(duì)表達(dá)量可控，控制表達(dá)量接近1:1的比例，便于對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行精確的細(xì)胞免疫功能誘導(dǎo)。該真核表達(dá)體系可用于對(duì)包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞的基因調(diào)控，及對(duì)靶細(xì)胞免疫微環(huán)境的誘導(dǎo)，既能靶向性的針對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生特應(yīng)性抗腫瘤效應(yīng)，又能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫誘導(dǎo)和免疫殺傷作用。其中il-2是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，ifnγ是發(fā)揮腫瘤靶向性抑制作用的細(xì)胞因子，二者聯(lián)合使用，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)后，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能進(jìn)行調(diào)控，并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向性治療，通過(guò)克服傳統(tǒng)基因表達(dá)載體啟動(dòng)子之間的相互抑制現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷。本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單，易于操作。

附圖說(shuō)明

圖1步驟一所得的基因片段的電泳圖；

圖2pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系圖譜；

圖3pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系的鑒定電泳結(jié)果圖；

圖4肝癌細(xì)胞表達(dá)目的蛋白結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括pcr擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、dna片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無(wú)特殊說(shuō)明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1構(gòu)建質(zhì)粒

步驟一、獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的基因片段

經(jīng)過(guò)dnaworks設(shè)計(jì)后，以化學(xué)合成的寡核苷酸單鏈混合物為模板(化學(xué)合成方法采用固相亞磷酰胺三酯法，參考文獻(xiàn)pon,r.t.solid-phasesupportsforoligonucleotidesynthesis.methodsinmolecularbiology(totowa,nj,unitedstates)(1993),20(protocolsforoligonucleotidesandanalogs),465–496)，大小987bp，設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物(如seqidno:2所示)：

gacacgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttg

下游引物(如seqidno:3所示)：

gacacggatccttactgggatgctcttcgacc

在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通過(guò)pcr反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得第一輪pcr產(chǎn)物，其中，引物濃度為1od溶于400ulddh2o，pcr反應(yīng)體系如下(50μl)：寡核苷酸單鏈混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul(25mmol/l)；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddh2o補(bǔ)足至50ul。

pcr反應(yīng)程序如下：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反應(yīng)22次循環(huán)；72℃6min。

以第一輪pcr產(chǎn)物為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，進(jìn)行第二次擴(kuò)增，其中，引物濃度為1od溶于400ulddh2o，

pcr反應(yīng)體系如下(50μl)：第一輪pcr產(chǎn)物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul(25mmol/l)；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddh2o補(bǔ)足至41ul。

pcr反應(yīng)反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反應(yīng)22次循環(huán)；72℃6min。

兩次pcr擴(kuò)增結(jié)束之后，進(jìn)行電泳回收基因片段，電泳檢測(cè)大小為987bp，其具有如seqidno:1所示的dna序列，電泳情況具體如圖1所示。第1排為擴(kuò)增前的寡核苷酸單鏈混合物；第2排為第一次擴(kuò)增產(chǎn)物；第3排為第二次擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)兩次擴(kuò)增，將化學(xué)合成的少量寡核苷酸單鏈的量進(jìn)行提升，以便進(jìn)一步的插入質(zhì)粒載體。

步驟二、含有特異性酶切位點(diǎn)的基因片段的酶切

步驟一電泳所得基因片段在限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi存在下進(jìn)行雙酶切，酶切條件如下：步驟一電泳所得基因片段20ul；限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer5ul；ddh2o補(bǔ)足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，電泳回收目的條帶，得到酶切的基因片段。

步驟三、pires2-egfp載體的酶切

載體pires2-egfp在限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi存在下進(jìn)行雙酶切，酶切條件如下：pires2-egfp1.5ug；限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer10ul；ddh2o補(bǔ)足至50ul；酶切反應(yīng)體系在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3h，電泳回收目的條帶，得到酶切的載體片段，其具有如seqidno:6所示的dna序列。

步驟四、構(gòu)建真核表達(dá)體系

連接基因片段和載體片段，構(gòu)建pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系(重組載體)。連接反應(yīng)體系如下(20μl)：酶切的基因片段6ul；酶切的載體片段，5ul；10×t4dnaligasebuffer2ul；t4dnaligase1ul，5u/ul；ddh2o補(bǔ)足至20ul；上述連接混合液于16℃水浴連接2h，構(gòu)建得到pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系，具體如圖2所示。

步驟五、pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系的鑒定

在dh5a感受態(tài)細(xì)菌中，加入步驟四的連接反應(yīng)液，取陽(yáng)性菌菌落液50μl，37℃條件下培養(yǎng)后，進(jìn)行菌液酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下：pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系0.5ug；限制性?xún)?nèi)切酶nhei和bamhi，各0.3ul，10u/ul；fdbuffer2ul；ddh2o補(bǔ)足至20ul；酶切反應(yīng)條件：37℃，水浴2小時(shí)。

分別取上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖3。

電泳結(jié)果顯示：

1)電泳后發(fā)現(xiàn)，片段分別為表達(dá)蛋白的序列部分和真核表達(dá)體系載體部分，所述表達(dá)蛋白的序列部分大小為987bp，其具有如seqidno:1所示的dna序列，所述真核表達(dá)體系載體部分大小為5220bp，其具有如seqidno:6所示的dna序列。

2)電泳結(jié)果圖顯示：從左到右8個(gè)條帶代表的克隆中，1、3、4、5、6、7、8為陽(yáng)性克隆，2為步驟一的寡核苷酸單鏈，9為marker。

將陽(yáng)性克隆的重組載體(即真核表達(dá)體系)測(cè)序，其含有目的蛋白的編碼基因片段，為序列表中seqidno:1所示的dna序列，從5’端至3’端依次包括：

酶切位點(diǎn)：seqidno:1所示的第1～6位；

il-2編碼基因序列：seqidno:1所示的第7～465位；

蛋白連接點(diǎn)：seqidno:1所示的第466～480位；

ifnγ編碼基因序列：seqidno:1所示的第481～981位；

酶切位點(diǎn)：seqidno:1所示的第982～987位。

實(shí)施例2肝癌細(xì)胞表達(dá)目的蛋白：

將hepg2人肝癌細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶工作液消化5min脫壁后，輕輕吹打，分散為單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以0.5×10⁶/孔的細(xì)胞數(shù)量，以含有10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5％co2和相對(duì)濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度達(dá)50％時(shí)，棄去培養(yǎng)液后，采用pbs液輕柔沖洗細(xì)胞3次，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

將2μg的pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系和pires2質(zhì)粒載體分別稀釋在0.1mlopti-medium中，20℃放置10min。同時(shí)，將10μl的lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋在0.1mlopti-medium中，20℃放置10min。分別將稀釋的2種質(zhì)粒體系與稀釋的lipofection2000轉(zhuǎn)染試劑充分混勻后，20℃放置30min，形成2種轉(zhuǎn)染試劑混合物。

分別將2種質(zhì)粒體系形成的轉(zhuǎn)染試劑混合物，分組加入如前準(zhǔn)備好的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5％co2和相對(duì)濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。棄去培養(yǎng)液，采用pbs液輕柔沖洗細(xì)胞3次后，繼續(xù)以含有10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5％co2和相對(duì)濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h、72h，分別檢測(cè)pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系和pires2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后的ifnγ和il-2蛋白表達(dá)水平，以未轉(zhuǎn)染對(duì)照組為陰性對(duì)照。

westernblot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：

分別收集各時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，以pbs洗3次。加入蛋白樣品裂解液，充分裂解所有細(xì)胞。將裂解好的細(xì)胞粘液刮至培養(yǎng)皿的一側(cè)，以移液器轉(zhuǎn)移至1.5毫升離心管中。進(jìn)一步使用超聲細(xì)胞破碎儀破碎dna，破碎實(shí)驗(yàn)條件：冰上操作，設(shè)置超聲130w,20khz,pulse20％；超聲20s/次，共三次。破碎后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

常規(guī)勻漿提取蛋白、蛋白質(zhì)變性。采用考馬斯亮藍(lán)比色法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)電泳。電泳完畢后用去離子水沖洗干凈，使用三明治電轉(zhuǎn)法，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后置于5％的脫脂奶粉中封閉，4℃過(guò)夜。棄去封閉液，用tbst漂洗2-3次，加入1:500稀釋的ifnγ或il-2蛋白一抗，室溫下?lián)u床孵育2h，tbst漂洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u床孵育1h，tbst漂洗后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色，最后以凝膠成像儀保存圖像，如圖4所示。

結(jié)果如圖4可見(jiàn)，第1、4條帶分別為pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系轉(zhuǎn)染48h、72h的蛋白染色結(jié)果；第2、5條帶為pires2質(zhì)粒載體的蛋白染色結(jié)果；第3、6條帶為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的蛋白染色結(jié)果。結(jié)果顯示，pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達(dá)體系轉(zhuǎn)染后，hepg2肝癌細(xì)胞中，ifnγ和il-2蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且72h時(shí)的表達(dá)水平均高于48h。pires2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后的ifnγ和il-2蛋白的表達(dá)水平與control組沒(méi)有差別。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院

<120>il-2和ifnγ蛋白共表達(dá)的真核表達(dá)體系及其制備方法和應(yīng)用

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