本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種針對多種pde-5抑制劑藥物(包括西地那非、瓦地那非、紅地那非、米羅那非及其結(jié)構(gòu)類似物)的免疫檢測方法。

背景技術(shù)：

西地那非、瓦地那非、紅地那非、米羅那非等藥物為pde-5抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙，屬于處方藥。然而，一些保健食品生產(chǎn)企業(yè)為突出產(chǎn)品的功效，違法在保健食品中添加化學(xué)藥物，如在抗疲勞產(chǎn)品中非法添加枸櫞酸西地那非、他達(dá)那非、瓦地那非、紅地那非等，對消費(fèi)者身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前市場許多聲稱具有補(bǔ)腎壯陽類、抗疲勞類、增強(qiáng)免疫力等作用的保健食品，違法添加了化學(xué)藥品的現(xiàn)象可謂是觸目驚心。添加的成分主要為：西地那非、他達(dá)拉非、瓦地那非，紅地那非等。2016年5月國家食藥監(jiān)通報(bào)，補(bǔ)酒中查出西地那非，多家企業(yè)被查；2012年山西藥監(jiān)局公布的10種禁售保健食品中，7種含有pde-5抑制劑，分別為西地那非，瓦地那非等；與此同時(shí)，北京、江蘇無錫、安徽銅陵、江蘇南通、南京、重慶、湖南衡陽等地的食品藥品監(jiān)督部門在當(dāng)?shù)氐难a(bǔ)腎、壯陽、抗疲勞保健食品抽檢中均檢出西地那非等pde-5抑制劑；不僅如此，還有一些尚未被批準(zhǔn)的西地那非的結(jié)構(gòu)類似物被非法添加在保健食品、能量飲料、中草藥中。2016年5月，食藥監(jiān)總局發(fā)布通告：明確禁止食品或保健食品添加西地那非等藥物

在不知情的情況下服用了添加pde-5抑制劑類藥物的保健食品極易引發(fā)毒副作用，會出現(xiàn)頭暈、昏暈、甚至青光眼，造成對腎功能、心臟功能、心血管疾病的嚴(yán)重?fù)p害。長期服用，還會導(dǎo)致食用者勃起不倒，傷及陰部肌肉組織，甚至加重陽痿，甚至變?yōu)橛谰眯躁栶?。因此針對多種pde-5抑制劑殘留問題，建立一種快速、有效的檢測方法顯得尤為重要。

pde-5抑制劑類藥物的檢測最常使用的方法為儀器分析法，hasegawa等利用lc-ms測定了保健食品中他達(dá)拉非、西地那非、伐地那非的含量。國內(nèi)進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(snt4054-2014)中已把hplc-ms法作為進(jìn)出口保健食品中西地那非、他達(dá)那非、伐地那非的檢測方法之一。該方法在片劑、膠囊劑中對三者的測定低限為1.0mg/kg，回收率在90～105％之間；口服溶液劑中對三者的的測定低限為0.01mg/l，回收率在94.5～108％之間。雖然上述幾種儀器分析法的檢測精確度高，但因其儀器化程度高、檢測時(shí)間長、過程繁瑣、檢測費(fèi)用昂貴，因而通常作為實(shí)驗(yàn)室確證方法，無法滿足現(xiàn)場或者大批量的快速篩查檢測。而免疫分析法因成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，成為常用的篩選方法，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種抗體同時(shí)檢測多種pde-5抑制劑藥物的的免疫方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中多種pde-5抑制劑藥物檢測技術(shù)的缺陷和不足，提供一種針對多種pde-5藥物(包括西地那非、瓦地那非、紅地那非、米羅那非及其結(jié)構(gòu)類似物)的半抗原、人工抗原、抗體，從而構(gòu)建了一種針對多種pde-5抑制劑藥物的免疫檢測方法。

本發(fā)明的目的是提供一種針對多種pde-5藥物的半抗原、人工抗原、抗體。

本發(fā)明另一目的是提供所述半抗原、人工抗原和抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的是提供一種直接檢測多種pde-5抑制劑藥物的免疫分析方法。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種可用于制備多種pde-5抑制劑藥物的檢測制劑的小分子化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：

式(i)所示小分子化合物在檢測多種pde-5抑制劑藥物方面的應(yīng)用，或在制備檢測多種pde-5抑制劑藥物的人工抗原和/或抗體等檢測制劑方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種用于檢測多種pde-5抑制劑藥物的人工抗原，其結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示：

一種用于檢測多種pde-5抑制劑藥物的人工抗原，其結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示：

優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或人血藍(lán)蛋白。

更優(yōu)選地，所述載體蛋白為牛血清蛋白或卵血清蛋白。

具體優(yōu)選地，式(ii)所述結(jié)構(gòu)作為免疫原，載體蛋白為牛血清蛋白(bsa)，式(iii)所示結(jié)構(gòu)作為包被原，載體蛋白為蛋清蛋白(ova)。

上述人工抗原在檢測多種pde-5抑制劑藥物方面的應(yīng)用，或在制備檢測多種pde-5抑制劑藥物的人工抗原和/或抗體等檢測制劑方面的應(yīng)用，也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

作為一種可選擇的實(shí)施方案，利用式(i)結(jié)構(gòu)制備式(ii)和式(iii)所示人工抗原的方法可采用活潑酯法：將所述的norneovardenafil半抗原溶于dmf中，攪拌加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，然后再加入載體蛋白，4℃下攪拌反應(yīng)過夜；偶聯(lián)混合物于4℃下生理鹽水透析2天得到目標(biāo)產(chǎn)物；所述半抗原與載體蛋白的摩爾比為100～60:1。

具體地，所述活潑酯法制備人工抗原包括如下步驟：

(1)將5mg的式(i)所示的norneovardenafil半抗原溶解于0.3mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)；

(2)在步驟(1)得到的溶液中分別加入1.5倍于norneovardenafil半抗原摩爾質(zhì)量的dcc(n，n-二環(huán)己基碳二亞胺)和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，室溫避光反應(yīng)過夜；

(3)將載體蛋白(12.3mgbsa、10mgova)分別溶于6ml的0.01mpbs緩沖液中，再加入步驟(1)得到的溶液，并于4℃反應(yīng)過夜。

其中，優(yōu)選地，所述pbs緩沖液的ph值為7.4～8.0。

一種以式(ii)所示的人工抗原為免疫原制備得到用于檢測多種pde-5抑制劑藥物的抗體(包括單克隆抗體、多克隆抗體或基因工程抗體)，以及該抗體在檢測多種pde-5抑制劑藥物方面的應(yīng)用，或在制備檢測多種pde-5抑制劑藥物的人工抗原和/或抗體等檢測制劑方面的應(yīng)用，也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種檢測多種pde-5抑制劑藥物的免疫檢測方法，包括以下步驟：

s1.將式(ii)所示的人工抗原作為免疫原免疫動物制備抗體，并與標(biāo)記酶結(jié)合制備得到酶標(biāo)抗體；

s2.將式(iii)所示的人工抗原作為包被原包被在微孔板上；采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定樣品中多種pde-5抑制劑藥物的含量。

具體是：包括以下步驟：

s1.將式(ii)所示的norneovardenafil人工抗原免疫動物制備多克隆抗體，并與標(biāo)記酶結(jié)合制備得到酶標(biāo)抗體；

s2.將式(iii)所示的norneovardenafil人工抗原作為包被原包被在微孔板上，將步驟s1制備得到多克隆抗體加入微孔板中；

s3.加入待測樣品，采用間接競爭elisa測定待測樣品中pde-5抑制劑的含量。

另外，所述免疫檢測方法在檢測樣品中多種pde-5抑制劑藥物含量方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

優(yōu)選地，所述樣品為保健食品或保健藥品。

優(yōu)選地，上文所述多種pde-5抑制劑藥物為瓦地那非、西地那非、紅地那非、米羅那非及其結(jié)構(gòu)類似物。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首先通過分析幾種pde-5抑制劑藥物空間結(jié)構(gòu)，合成了一種新型的小分子化合物作為半抗原用于制備人工抗原，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的抗原進(jìn)行動物免疫后得到更優(yōu)質(zhì)、高效、廣譜性的抗體。

利用本發(fā)明的人工抗原免疫動物得到的抗體用于檢測pde-5抑制劑類藥物，首次實(shí)現(xiàn)同時(shí)對保健食品等樣品中多種pde-5抑制劑藥物殘留檢測，且抗體效價(jià)可達(dá)1：500000，對西地那非的最大檢測范圍為0.97～70.72ng/ml，ic50為8.32ng/ml；對瓦地那非的最大檢測范圍為1.45～22.72ng/ml，ic50為5.70ng/ml；對紅地那非的最大檢測范圍為0.74～27.68ng/ml，ic50為4.54ng/ml；對米羅那非的最大檢測范圍為0.20～22.8ng/ml，ic50為2.16ng/ml。

所述抗體具有特異性高、靈敏度好、準(zhǔn)確度高等顯著優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明提供的抗原和抗體，可用于建立針對多種pde-5抑制劑藥物的酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，檢測快速、大大縮短了檢測時(shí)間，且實(shí)現(xiàn)多殘留的檢測，檢出限更低、靈敏度更，從而用于快速檢測食品中殘留的pde-5抑制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為norneovardenafil免疫抗原、載體蛋白紫外掃描圖。

圖2為半抗原所制備抗體對多種pde-5抑制劑藥物的抑制曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。

除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1免疫原/包被原的制備

1、本發(fā)明通過分析幾種pde-5抑制劑藥物空間結(jié)構(gòu)，合成了一種新型的小分子化合物，如式(i)所示，可作為半抗原用于制備人工抗原、抗體用于檢測多種pde-5抑制劑藥物。

2、本發(fā)明所用免疫原與包被原的制備方法中，其區(qū)別在于載體蛋白的使用類型，所述免疫原載體蛋白主要采用牛血清蛋白(bsa)，所述包被原載體蛋白主要采用蛋清蛋白(ova)，所用偶聯(lián)方法為活潑酯法。以下述免疫原的制備方法為例。

(1)活潑酯法：取半抗原norneovardenafil5mg(0.015mol)溶于0.3mldmf中，加入4.78mgdcc(0.023mol)、2.65mgnhs(0.023mol)，4℃攪拌過夜，此為a液；取12.3mg牛血清蛋白溶于6ml、ph＝7.4的pbs緩沖液中，將a液逐滴加入其中，4℃反應(yīng)過夜，離心取上清，生理鹽水透析3d，每天更換4次透析液，得到norneovardenafil免疫原。

另外以同樣的方法制備得到norneovardenafil包被原。

將免疫原或包被原稀釋至1mg/ml，分裝與離心管中，于-20℃保存，以供使用。免疫原和包被原具有如式(ii)(iii)所示結(jié)構(gòu)：

式(ii)所示的免疫原中載體蛋白為牛血清蛋白(bsa)，式(iii)所示的包被原中載體蛋白為蛋清蛋白(ova)。

(2)對載體蛋白、半抗原及其相應(yīng)的免疫原進(jìn)行紫外掃描測定(200～400nm)，發(fā)現(xiàn)免疫原同時(shí)具備半抗原和載體蛋白的特征吸收峰(圖1)，說明免疫原偶聯(lián)成功。

實(shí)施例2抗體制備及鑒定

將制備好的免疫原與等量的免疫佐劑(第一次免疫用不完全弗氏佐劑，以后加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑)乳化均勻，免疫動物。將2.5～3kg的新西蘭大白兔分別采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每間隔3周加免一次。第四次加強(qiáng)免疫后1周耳緣靜脈取血，并利用間接競爭elisa測定血清效價(jià)。當(dāng)效價(jià)不再上升時(shí)，采用耳緣靜脈加強(qiáng)免疫。一周后心臟采血，水浴0.5～1h，4℃、10000離心15min，取上清即為抗血清?？寡宀捎昧蛩徜@沉淀法純化的到多克隆抗體，與-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

間接競爭elisa測定抗體陽性滴度以2.1倍于陰性血的測定值為準(zhǔn)，結(jié)果表明半抗原對應(yīng)的抗血清效價(jià)為1:500000。

實(shí)施例3抗體的特異性及靈敏度

1、依據(jù)如上效果，使用抗血清繪制酶聯(lián)免疫分析(elisa)標(biāo)準(zhǔn)曲線；使用磷酸吐溫緩沖液(pbst，0.1mol/l，ph＝7.4)作為所有樣品的稀釋液：將50μl系列濃度的藥物標(biāo)準(zhǔn)品和50μl適當(dāng)稀釋倍數(shù)的多特異性抗體加入96孔酶標(biāo)板中，競爭反應(yīng)后通過酶標(biāo)分析儀測定吸光值(od)。以od值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，應(yīng)用origin9.1軟件四參數(shù)對函數(shù)進(jìn)行曲線擬合：y＝(a-d)/[1+(x/c)b]+d

其中，a和d分別代表藥物濃度最小和最大的吸光值(od)，c為中點(diǎn)濃度，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度等于c時(shí)的od值為(a+d)/2，正處于曲線的拐點(diǎn)處，半數(shù)抑制量濃度為ic50，b表示曲線的陡峭程度，稱斜率因子：以ic10為檢測限，以ic20～ic80為檢測范圍。建立elisa的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見表1。

結(jié)合附圖及附表可知，以幾種pde-5抑制劑藥物為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具備典型的s型曲線，檢測靈敏度好。由于該抗體能直接識別多種pde-5抑制劑藥物，因此該方法可以直接測食品中的pde-5抑制劑藥物的含量。

表1抗血清對幾種pde-5抑制劑藥物的檢測參數(shù)

2、另外，抗體對pde-5抑制劑類藥物類似物的檢測結(jié)果如表2所示，制備的多克隆抗體對主要使用的幾種pde-5抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能類似物均有識別，并能直接檢測其含量。

表2抗體對主要使用的pde-5抑制劑類藥物的結(jié)構(gòu)與功能類似物檢測參數(shù)

因此，本發(fā)明構(gòu)建了一種檢測多種pde-5抑制劑藥物的免疫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將式(ii)所示的norneovardenafil人工抗原作為免疫原免疫動物制備norneovardenafil抗體，并與標(biāo)記酶結(jié)合制備得到酶標(biāo)抗體；

(2)將式(iii)所示的norneovardenafil人工抗原作為包被原包被在微孔板上；采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定樣品中多種pde-5抑制劑藥物的含量。