本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖以及進(jìn)一步制備d-氨基葡萄糖鹽的方法。
背景技術(shù)：
：n-乙酰-d-氨基葡萄糖(n-acetyl-d-glucosamine，nag或glcnac)，又稱n-乙酰-氨基葡萄糖、n-乙酰葡糖胺，是生物細(xì)胞內(nèi)許多重要多糖的基本組成單位，在生物體內(nèi)具有重要生理功能。n-乙酰-d-氨基葡萄糖在臨床上可用于：增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的功能；抑制惡性腫瘤或纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)；有效治療各種炎癥；作為糖尿病患者低熱量甜味劑和嬰幼兒食品添加劑等。水解n-乙酰-d-氨基葡萄糖可用于生產(chǎn)d-氨基葡萄糖鹽酸鹽，后者可作為抗癌、防癌、降血脂、降血壓的食品補(bǔ)充劑，是目前殼多糖保健食品系列中第三代保健功能性食品添加劑。此外，n-乙酰-d-氨基葡萄糖在醫(yī)藥行業(yè)中是合成抗癌藥物氯脲霉素的主要原料；作為生化試劑還可用作抗細(xì)菌感染的免疫佐劑和人體抗流感病毒的活化劑。當(dāng)今世界各地，有大量患者忍受不同程度關(guān)節(jié)炎痛苦，僅美國(guó)就有3300萬人忍受骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)疼痛，我國(guó)有1.5億人以上。由于d-氨基葡萄糖產(chǎn)品在關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)疼痛的治療與保健方面具有特別功效，因而得到廣泛應(yīng)用，已成為目前國(guó)外市場(chǎng)非常重要的原料藥品種。n-乙酰-d-氨基葡萄糖據(jù)認(rèn)為具有與d-氨基葡萄糖相似的效果，已知攝取n-乙酰-d-氨基葡萄糖能誘導(dǎo)產(chǎn)生新的軟骨，并阻止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)作，或在一些病例中，用來治療骨關(guān)節(jié)炎。由于d-氨基葡萄糖有苦味，而n-乙酰-d-氨基葡萄糖有蔗糖50％的甜味，并且很容易被攝取，因此，n-乙酰-d-氨基葡萄糖作為d-氨基葡萄糖的替代物質(zhì)已引起關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外氨基葡萄糖的來源主要以生物提取為主。生物提取主要是從蝦蟹殼中提取甲殼素或殼聚糖，再經(jīng)濃鹽酸水解制備，或用檸檬酸渣經(jīng)酸堿提取而得。年生產(chǎn)量在2萬噸左右。但是，用蝦蟹殼提取時(shí)，每獲得1噸產(chǎn)品將產(chǎn)生大量廢渣和100噸以上廢水；用檸檬酸渣提取時(shí)，每獲得1噸產(chǎn)品將產(chǎn)生30-50噸廢酸渣，是高污染工藝，在許多地方已禁止使用。而且，來自水產(chǎn)品殼提取的氨基葡萄糖對(duì)許多有水產(chǎn)品過敏的患者不適宜，有水產(chǎn)品過敏的人使用后可能會(huì)造成嚴(yán)重的過敏問題，甚至危及生命。此外，生物提取純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)品有魚腥味，不穩(wěn)定。另外，由于環(huán)境污染，從蝦蟹殼中提取得到的氨基葡萄糖不可避免的受到重金屬污染。因此，生物提取方法生產(chǎn)氨基葡萄糖，從數(shù)量和質(zhì)量上都難以滿足人們的需求，須開辟新的替代方法。若采用化學(xué)合成方法來制備，更存在如下三個(gè)缺點(diǎn)：生產(chǎn)成本高；嚴(yán)重的環(huán)境污染；有安全性隱患。該方法目前國(guó)內(nèi)外已不采用。相比較而言，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖是一條良好的途徑，微生物發(fā)酵法是以葡萄糖和無機(jī)鹽為原料，選用優(yōu)良菌種進(jìn)行液體發(fā)酵，并經(jīng)分離、濃縮、純化直接生產(chǎn)氨基葡萄糖。生產(chǎn)過程中無有害氣體產(chǎn)生。發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基葡萄糖無魚腥味，生產(chǎn)不受資源限制。而且利用代謝工程進(jìn)行菌種改良，產(chǎn)量高，工業(yè)化大生產(chǎn)潛力大。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖在技術(shù)工藝上有重大變革，替代傳統(tǒng)的生物提取，不僅在成本方面占有優(yōu)勢(shì)，在減少三廢污染方面也具有一定的環(huán)保貢獻(xiàn)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖常規(guī)方法包括：涉及用微生物產(chǎn)生的酶降解來自蝦殼原料產(chǎn)生的甲殼素生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法(例如，us5998173，“processforproducingn-acetyl-d-glucosamine”)；用微生物(木霉菌)產(chǎn)生的酶酶解或用酸部分水解純化來自真菌渣(如檸檬酸發(fā)酵使用的黑曲霉菌的菌渣)的甲殼素生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法(例如，us20030073666a1，“n-acetyl-d-glucosamineandprocessforproducingn-acetyl-d-glucosamine”)；用木霉菌直接使用葡萄糖為碳源，不需要來自真菌渣或蝦殼產(chǎn)生的甲殼素和殼多糖寡糖為碳源，發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法(例如，us20110059489a1，“methodforfermentativeproductionofn-acetyl-d-glucosaminebymicroorganism”)；通過培養(yǎng)綠藻病毒(chlorovirus)感染的小球藻細(xì)胞或者導(dǎo)入了源自綠藻病毒的基因的重組大腸桿菌來生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法(例如，jp2004283144a，“methodforproducingglucosamineandn-acetylglucosamine”)；使用遺傳修飾的微生物，特別是遺傳修飾的大腸桿菌，發(fā)酵生產(chǎn)d-氨基葡萄糖或n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法(例如，us6,372,457，“processandmaterialsforproductionofglucosamine”；wo2004/003175，“processandmaterialsforproductionofglucosamineandn-acetylglucosamine”)。用微生物或微生物產(chǎn)生的酶來降解源自甲殼類動(dòng)物如蟹、蝦類的殼的甲殼素生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法，較為傳統(tǒng)，存在產(chǎn)量低、成本高和動(dòng)物源不足等問題。通過培養(yǎng)用綠藻病毒感染的小球藻細(xì)胞生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法，涉及壓碎細(xì)胞獲取n-乙酰-d-氨基葡萄糖的步驟，存在操作復(fù)雜等問題。用木霉菌直接使用葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法，具有不需要使用來自甲殼類動(dòng)物殼或真菌渣產(chǎn)生的甲殼素或殼多糖寡糖等碳源的優(yōu)點(diǎn)，但木霉菌等真菌發(fā)酵溫度低(27℃)、時(shí)間長(zhǎng)(10天)、產(chǎn)量偏低(15mg/ml)，從而存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、易污染雜菌等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制了該方法的工業(yè)化應(yīng)用。顯然，針對(duì)氨基葡萄糖不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，用遺傳修飾的微生物生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一條有應(yīng)用前景的重要方法。而新的遺傳修飾的微生物可通過基因重組、基因轉(zhuǎn)移、基因突變、基因刪除、基因超表達(dá)、代謝途徑改變等許多方式獲得。美國(guó)專利us6,372,457中公開了通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)d-氨基葡萄糖的方法和材料。該發(fā)明包括用于該發(fā)明生產(chǎn)氨基葡萄糖之方法的遺傳修飾的微生物，以及重組核酸分子和由所述重組核酸分子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。該發(fā)明所述遺傳修飾的微生物，主要針對(duì)能提高氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的遺傳修飾，包括多種基因突變或氨基酸缺失和取代。但該專利未涉及通過內(nèi)源性氨基葡萄糖-6-磷酸合酶基因啟動(dòng)子更換或缺失等改變，導(dǎo)致氨基葡萄糖-6-磷酸合酶活性的提高或降低。另外，該專利主要通過氨基葡萄糖-6-磷酸合酶的遺傳修飾生產(chǎn)的目的產(chǎn)物僅為d-氨基葡萄糖，未涉及n-乙酰-d-氨基葡萄糖生產(chǎn)。而且，由于d-氨基葡萄糖在發(fā)酵液中很不穩(wěn)定，降解產(chǎn)物可能對(duì)微生物有毒性，這種通過遺傳修飾生產(chǎn)d-氨基葡萄糖的方式，其產(chǎn)量很低，實(shí)際應(yīng)用存在局限性。wo2004/003175中公開了用于生產(chǎn)d-氨基葡萄糖和n-乙酰-d-氨基葡萄糖的生物合成方法。該方法通過發(fā)酵基因修飾微生物以產(chǎn)生氨基葡萄糖和/或n-乙酰-d-氨基葡萄糖。該發(fā)明還公開了用于生產(chǎn)氨基葡萄糖和n-乙酰-d-氨基葡萄糖的基因修飾微生物。此外，該發(fā)明還描述了回收通過發(fā)酵法生產(chǎn)的n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法，包括產(chǎn)生高純度n-乙酰-d-氨基葡萄糖的方法。該發(fā)明還公開了由n-乙酰-d-氨基葡萄糖生產(chǎn)d-氨基葡萄糖的方法。該發(fā)明所述遺傳修飾的微生物,主要針對(duì)增加氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的遺傳修飾。酵母氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(gna1)在大腸桿菌中表達(dá)可將氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化為乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸，在先前的文獻(xiàn)中也已有報(bào)道和證實(shí)(miot1,yamada-okabet,arisawam,yamada-okabeh:saccharomycescerevisiaegna1,anessentialgeneencodinganovelacetyltransferaseinvolvedinudp-n-acetylglucosaminesynthesis,jbiolchem.,1999jan1；274(1):424-9.)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的代謝途徑，采用新的遺傳修飾方法改造微生物，并利用該微生物以更高效率和更高產(chǎn)量生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽。具體而言，本發(fā)明通過提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(udp-n-acetyl-d-glucosamine-2-epimerase，wecb)的作用，加強(qiáng)微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖(udp-n-acetyl-d-glucosamine，udp-glcnac)轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰-d-氨基甘露糖(n-acetyl-d-mannosamine，mannac)，從而使該微生物以更高效率和更高產(chǎn)量生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽。本發(fā)明在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上還進(jìn)一步涉及如下內(nèi)容中的一種或多種：1.通過提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(d-glucosamine-6-phosphatedeaminase，nagb)的作用，優(yōu)選同時(shí)降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase，glms，又稱作l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶，l-glutamine:d-fructose-6-phosphateaminotransferase)的作用，加強(qiáng)微生物中葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，glc-6-p)氨基化為d-氨基葡萄糖-6-磷酸(d-glucosamine-6-phosphate，glcn-6-p)。d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)所催化的反應(yīng)是可逆的，氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)所催化的反應(yīng)雖是不可逆的，但有嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制問題，當(dāng)nagb催化的反應(yīng)向由glc-6-p生成glcn-6-p的方向進(jìn)行時(shí)，其和glms功能相同，可替代glms，而且無產(chǎn)物抑制問題。提高nagb的作用，加快nagb催化反應(yīng)向由glc-6-p生成glcn-6-p的方向進(jìn)行，優(yōu)選同時(shí)降低glms的作用，減弱glms的產(chǎn)物抑制問題，達(dá)到增加glcn-6-p的目的，從而使該微生物以更高效率和更高產(chǎn)量生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽。2.通過提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase，glms，又稱作l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶，l-glutamine:d-fructose-6-phosphateaminotransferase)的作用，并同時(shí)降低d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(d-glucosamine-6-phosphatedeaminase，nagb)的作用，加強(qiáng)微生物中葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，glc-6-p)氨基化為d-氨基葡萄糖-6-磷酸(d-glucosamine-6-phosphate，glcn-6-p)。d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)所催化的反應(yīng)是可逆的，當(dāng)nagb催化的反應(yīng)向由glcn-6-p生成glc-6-p的方向進(jìn)行時(shí)，其和glms功能相反，會(huì)抵消glms的作用。降低nagb的作用，阻止nagb催化反應(yīng)向由glcn-6-p生成glc-6-p的方向進(jìn)行，并同時(shí)超表達(dá)glms，加快glms催化glc-6-p氨基化為glcn-6-p，達(dá)到增加glcn-6-p的目的，從而使該微生物以更高效率和更高產(chǎn)量生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽。3.降低微生物中與目標(biāo)產(chǎn)物再次被攝入細(xì)胞內(nèi)或有益中間產(chǎn)物被降解相關(guān)的酶或者蛋白的作用，提高微生物中糖轉(zhuǎn)化率和n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量，從而使該微生物以更高效率和更高產(chǎn)量生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽。包括但不限于如下內(nèi)容中的一種或多種：(1)降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(mannosetransportereiim，p/iiiman，manxyz)的作用，阻止n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)等己糖轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)降解。(2)降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(n-acetylneuraminatelyase，nana)的作用，阻止微生物中n-乙酰-d-氨基甘露糖(n-acetyl-d-mannosamine，mannac)降解。(3)降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(n-acetylglucosamine-6-phosphatedeacetylase，naga)的作用，阻止微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸(n-acetyl-d-glucosamine-6-phosphate，glcnac-6-p)轉(zhuǎn)變?yōu)閐-氨基葡萄糖-6-磷酸(d-glucosamine-6-phosphate，glcn-6-p)。(4)降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(n-acetylglucosaminespecificenzymeiinag，nage)的作用，阻止n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)被轉(zhuǎn)入微生物細(xì)胞內(nèi)降解。(5)通過提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(phosphoglucosaminemutase，glmm)的作用，加強(qiáng)微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸(d-glucosamine-6-phosphate，glcn-6-p)轉(zhuǎn)變?yōu)閐-氨基葡萄糖-1-磷酸(d-glucosamine-1-phosphate，glcn-1-p)。(6)通過提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(bifunctionaln-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase/glucosamine-1-phosphateacetyltransferase，glmu)的作用，加強(qiáng)微生物中d-氨基葡萄糖-1-磷酸(d-glucosamine-1-phosphate，glcn-1-p)轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸(n-acetyl-d-glucosamine-1-phosphate，glcnac-1-p)，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)閡dp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖(udp-n-acetyl-d-glucosamine，udp-glcnac)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽的方法，該方法包括：a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物包含至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾；和b)收集從培養(yǎng)步驟a)中產(chǎn)生的n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)。優(yōu)選，進(jìn)一步包括c)由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)脫乙?；玫絛-氨基葡萄糖鹽。在本發(fā)明中，提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾選自a)微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的酶活性增加；和/或b)微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)被過量表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的作用，可以通過篩選編碼具有udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的酶活性增加的基因突變體來實(shí)現(xiàn)。篩選wecb基因突變體可以通過易錯(cuò)pcr技術(shù)得到高頻突變基因來完成。為提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的作用，也可以通過增加其基因拷貝數(shù)、更換比天然啟動(dòng)子有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子等方式過量表達(dá)udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)來實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)方面，編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的核酸序列含有至少一種增加udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的酶活性的遺傳修飾。優(yōu)選，所述遺傳修飾包括在對(duì)應(yīng)于氨基酸序列seqidno：17的下述位置處的取代中的一種或多種：第34位半胱氨酸被絲氨酸取代、第145位組氨酸被天冬氨酸取代、第226位半胱氨酸被苯丙氨酸取代和245位纈氨酸被甘氨酸取代；更優(yōu)選，編碼所述udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的核酸序列為seqidno：26；所述udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的氨基酸序列為seqidno：27。在另一個(gè)方面，所述的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)具有與seqidno：17的氨基酸序列至少約30％相同，優(yōu)選至少約50％相同，進(jìn)一步優(yōu)選至少約70％相同，進(jìn)一步優(yōu)選至少約80％相同，更進(jìn)一步優(yōu)選至少約90％相同，最優(yōu)選至少約95％相同的氨基酸序列，其中所述的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)具有酶活性。在另一個(gè)方面中，所述的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)具有seqidno：17的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因拷貝數(shù)增加。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中包含內(nèi)源性天然啟動(dòng)子、具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、融合序列等。優(yōu)選，重組核酸分子中包含具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，重組核酸分子中包含trc啟動(dòng)子。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，具有比trp更高的轉(zhuǎn)錄效率和受laci阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在本發(fā)明中，重組核酸分子轉(zhuǎn)化微生物，選自游離型(即重組核酸分子被裝入質(zhì)粒中)和整合型(即重組核酸分子被整合到微生物的基因組中)。優(yōu)選，重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括至少一種對(duì)編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的遺傳修飾。優(yōu)選，編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被具有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，編碼udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被trc啟動(dòng)子替換。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述微生物進(jìn)一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種：(1)包含至少一種能提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾，優(yōu)選同時(shí)包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾；(2)包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾，并同時(shí)包含至少一種能降低d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾。在上述第(1)個(gè)方面中，提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾選自a)微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的酶活性增加；和/或b)微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)被過量表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的作用，可以通過篩選編碼具有d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的酶活性增加的基因突變體來實(shí)現(xiàn)。篩選nagb基因突變體可以通過易錯(cuò)pcr技術(shù)得到高頻突變基因來完成。為提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的作用，也可以通過增加其基因拷貝數(shù)、更換比天然啟動(dòng)子有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子等方式過量表達(dá)d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)來實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)方面，編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的核酸序列含有至少一種增加d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的酶活性的遺傳修飾。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的基因拷貝數(shù)增加。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中包含內(nèi)源性天然啟動(dòng)子、具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、融合序列等。優(yōu)選，重組核酸分子中包含具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，重組核酸分子中包含trc啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，重組核酸分子轉(zhuǎn)化微生物，選自游離型(即重組核酸分子被裝入質(zhì)粒中)和整合型(即重組核酸分子被整合到微生物的基因組中)。優(yōu)選，重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括至少一種對(duì)編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的遺傳修飾。優(yōu)選，編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被具有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，編碼d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被trc啟動(dòng)子替換。在本發(fā)明中，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的酶活性降低；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的表達(dá)減少，包括但不限于：編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾為編碼微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在上述第(2)個(gè)方面中，提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾選自a)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的酶活性增加；和/或b)微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)被過量表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的作用，可以通過篩選編碼具有氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的酶活性增加的基因突變體來實(shí)現(xiàn)。篩選glms基因突變體可以通過易錯(cuò)pcr技術(shù)得到高頻突變基因來完成。為提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的作用，也可以通過增加其基因拷貝數(shù)、更換比天然啟動(dòng)子有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子等方式過量表達(dá)氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)來實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)方面，編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的核酸序列含有至少一種增加氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的酶活性的遺傳修飾。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的基因拷貝數(shù)增加。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中包含內(nèi)源性天然啟動(dòng)子、具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、融合序列等。優(yōu)選，重組核酸分子中包含具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，重組核酸分子中包含trc啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，重組核酸分子轉(zhuǎn)化微生物，選自游離型(即重組核酸分子被裝入質(zhì)粒中)和整合型(即重組核酸分子被整合到微生物的基因組中)。優(yōu)選，重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括至少一種對(duì)編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的遺傳修飾。優(yōu)選，編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被具有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，編碼氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被trc啟動(dòng)子替換。在本發(fā)明中，降低微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾選自a)微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的酶活性降低；和/或b)微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的表達(dá)減少，包括但不限于：編碼微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾為編碼微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述微生物進(jìn)一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種：(1)包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾；(2)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾；(3)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾；(4)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾；(5)包含至少一種能提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)作用的遺傳修飾；(6)包含至少一種能提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)作用的遺傳修飾。在上述第(1)個(gè)方面中，降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾包括但不限于：編碼微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾為編碼微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)的內(nèi)源性基因完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在上述第(2)個(gè)方面中，降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾包括但不限于：編碼微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾為編碼微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)的內(nèi)源性基因完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在上述第(3)個(gè)方面中，降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾包括但不限于：編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾為編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)的內(nèi)源性基因完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在上述第(4)個(gè)方面中，降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾包括但不限于：編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)的內(nèi)源性基因的部分或完全缺失、或部分或完全失活，和/或編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的部分或完全缺失、或部分或完全失活。優(yōu)選，降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾為編碼微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)的內(nèi)源性基因完全缺失，即被刪除。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在上述第(5)個(gè)方面中，提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)作用的遺傳修飾選自a)微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)被過量表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的作用，可以通過篩選編碼具有磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的酶活性增加的基因突變體來實(shí)現(xiàn)。篩選glmm基因突變體可以通過易錯(cuò)pcr技術(shù)得到高頻突變基因來完成。為提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的作用，也可以通過增加其基因拷貝數(shù)、更換比天然啟動(dòng)子有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子等方式過量表達(dá)磷酸葡糖胺變位酶(glmm)來實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)方面，編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的核酸序列含有至少一種增加磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的酶活性的遺傳修飾。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的基因拷貝數(shù)增加。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中包含內(nèi)源性天然啟動(dòng)子、具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、融合序列等。優(yōu)選，重組核酸分子中包含具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，重組核酸分子中包含trc啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，重組核酸分子轉(zhuǎn)化微生物，選自游離型(即重組核酸分子被裝入質(zhì)粒中)和整合型(即重組核酸分子被整合到微生物的基因組中)。優(yōu)選，重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括至少一種對(duì)編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的遺傳修飾。優(yōu)選，編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被具有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，編碼磷酸葡糖胺變位酶(glmm)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被trc啟動(dòng)子替換。在上述第(6)個(gè)方面中，提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)作用的遺傳修飾選自a)微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的酶活性增加；和/或b)微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)被過量表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的作用，可以通過篩選編碼具有雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的酶活性增加的基因突變體來實(shí)現(xiàn)。篩選glmu基因突變體可以通過易錯(cuò)pcr技術(shù)得到高頻突變基因來完成。為提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的作用，也可以通過增加其基因拷貝數(shù)、更換比天然啟動(dòng)子有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子等方式過量表達(dá)雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)來實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含至少一種能提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)作用的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物用至少一種包含編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在一個(gè)方面，編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的核酸序列含有至少一種增加雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的酶活性的遺傳修飾。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的基因拷貝數(shù)增加。在另一個(gè)方面，重組核酸分子中包含內(nèi)源性天然啟動(dòng)子、具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、融合序列等。優(yōu)選，重組核酸分子中包含具有比內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，重組核酸分子中包含trc啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，重組核酸分子轉(zhuǎn)化微生物，選自游離型(即重組核酸分子被裝入質(zhì)粒中)和整合型(即重組核酸分子被整合到微生物的基因組中)。優(yōu)選，重組核酸分子被整合到微生物的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括至少一種對(duì)編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子的遺傳修飾。優(yōu)選，編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被具有更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換，例如hce啟動(dòng)子、gap啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t7啟動(dòng)子等；更優(yōu)選，編碼雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)的基因的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子被trc啟動(dòng)子替換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如下優(yōu)選的實(shí)施方案：1.根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽的方法，該方法包括：a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物包含：至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾；和至少一種能提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾；和b)收集從培養(yǎng)步驟a)中產(chǎn)生的n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)。優(yōu)選，所述微生物還包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾。2.根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)和/或d-氨基葡萄糖鹽的方法，該方法包括：a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，所述微生物包含：至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾；至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾；和至少一種能降低d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾；和b)收集從培養(yǎng)步驟a)中產(chǎn)生的n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)。在上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步包括c)由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)脫乙?；玫絛-氨基葡萄糖鹽。在上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物進(jìn)一步包含：至少一種能降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾；至少一種能降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾；至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾；和至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾。在上述任意實(shí)施方案的一個(gè)方面中，上述任意重組核酸分子的表達(dá)是可誘導(dǎo)的，包括但不限于被乳糖誘導(dǎo)，例如，通過在培養(yǎng)液中添加乳糖等可實(shí)現(xiàn)被乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域已知的各種常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基。在一個(gè)方面中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包含碳源。在另一個(gè)方面中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包含氮源。在另一個(gè)方面中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包含碳源和氮源。在另一個(gè)方面中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包含碳源、氮源和無機(jī)鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本領(lǐng)域已知的各種碳源均可用于本發(fā)明，包括有機(jī)碳源和/或無機(jī)碳源。優(yōu)選，碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種。優(yōu)選，碳源的濃度維持在約0.1％-約5％。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本領(lǐng)域已知的各種氮源均可用于本發(fā)明，包括有機(jī)氮源和/或無機(jī)氮源。優(yōu)選，氮源選自氨水、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、硝酸鈉、尿素、酵母浸膏、肉類浸膏、蛋白胨、魚粉、豆粉、麥芽、玉米漿和棉籽粉中的一種或多種。優(yōu)選，本發(fā)明采用補(bǔ)料發(fā)酵法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，補(bǔ)糖液包含葡萄糖和核糖，優(yōu)選，葡萄糖濃度為10％-85％(w/v)，核糖濃度為0.5％-15％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選，葡萄糖濃度為55％-75％(w/v)，核糖濃度為5％-7％(w/v)；根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，補(bǔ)糖液包含葡萄糖和葡萄糖酸鹽，優(yōu)選，葡萄糖濃度為10％-85％(w/v)，葡萄糖酸鹽濃度為0.5％-15％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選，葡萄糖濃度為55％-75％(w/v)，葡萄糖酸鹽濃度為2％-3％(w/v)；根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，補(bǔ)糖液包含葡萄糖、核糖和葡糖酸鹽，優(yōu)選，葡萄糖濃度為10％-85％(w/v)，核糖濃度為0.5％-15％(w/v)，葡萄糖酸鹽濃度為0.5％-15％(w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選，葡萄糖濃度為55％-75％(w/v)，核糖濃度為5％-7％(w/v)，葡萄糖酸鹽濃度為2％-3％(w/v)。優(yōu)選，葡萄糖酸鹽為葡萄糖酸鈉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在約20℃-約45℃進(jìn)行所述培養(yǎng)步驟，進(jìn)一步優(yōu)選，在約33℃-約37℃進(jìn)行所述培養(yǎng)步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在約ph4.5-約ph8.5進(jìn)行所述培養(yǎng)步驟。在一個(gè)方面中，在約ph6.7-約ph7.2進(jìn)行所述培養(yǎng)步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域已知的各種常規(guī)方法收集n-乙酰-d-氨基葡萄糖(glcnac)。優(yōu)選，可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中的胞外產(chǎn)物中收集n-乙酰-d-氨基葡萄糖。進(jìn)一步優(yōu)選，該收集步驟包括選自如下的步驟：(a)從去除微生物的發(fā)酵液中沉淀n-乙酰-d-氨基葡萄糖；(b)從去除微生物的發(fā)酵液中結(jié)晶n-乙酰-d-氨基葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明，收集步驟進(jìn)一步包括將發(fā)酵液脫色的步驟。脫色步驟可以包括但不限于在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行沉淀或結(jié)晶之前、在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行一次或多次沉淀或結(jié)晶重溶解之后進(jìn)行，脫色包括活性炭處理和/或色譜脫色。所述色譜脫色包括使所述發(fā)酵液與離子交換樹脂接觸的步驟，離子交換樹脂包括但不限于陰離子交換樹脂和/或陽離子交換樹脂，例如使發(fā)酵液與陰離子和陽離子交換樹脂的混合床接觸。根據(jù)本發(fā)明，可以通過使n-乙酰-d-氨基葡萄糖脫乙酰化得到d-氨基葡萄糖鹽，所述鹽包括但不限于鹽酸鹽、硫酸鹽、鈉鹽、磷酸鹽和硫酸氫鹽等。例如，可以在酸性和加熱條件下脫乙酰化水解n-乙酰-d-氨基葡萄糖得到d-氨基葡萄糖鹽，優(yōu)選，在30％-37％鹽酸溶液中、60℃-90℃下脫乙?；鈔-乙酰-d-氨基葡萄糖得到d-氨基葡萄糖鹽酸鹽；也可以在udp-3-o-n-乙酰葡萄糖胺脫乙?；缸饔孟滤鈔-乙酰-d-氨基葡萄糖得到d-氨基葡萄糖，并進(jìn)一步成鹽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種微生物，所述微生物包含至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾。上文已經(jīng)對(duì)這一遺傳修飾進(jìn)行了詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述微生物進(jìn)一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種：(1)包含至少一種能提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾，優(yōu)選同時(shí)包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾；(2)包含至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾，并同時(shí)包含至少一種能降低d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾。上文已經(jīng)對(duì)這些遺傳修飾進(jìn)行了詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述微生物進(jìn)一步包含下述遺傳修飾中的一種或多種：(1)包含至少一種能降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾；(2)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾；(3)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾；(4)包含至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾；(5)包含至少一種能提高微生物中磷酸葡糖胺變位酶(glmm)作用的遺傳修飾；(6)包含至少一種能提高微生物中雙功能酶n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(glmu)作用的遺傳修飾。上文已經(jīng)對(duì)這些遺傳修飾進(jìn)行了詳細(xì)描述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如下優(yōu)選的實(shí)施方案：1.根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種微生物，所述微生物包含：至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾；和至少一種能提高微生物中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾。優(yōu)選，所述微生物還包含至少一種能降低氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾。2.根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種微生物，所述微生物包含：至少一種能提高微生物中udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)作用的遺傳修飾；至少一種能提高微生物中氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)作用的遺傳修飾；和至少一種能降低d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)作用的遺傳修飾。在上述優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物進(jìn)一步包含：至少一種能降低微生物中甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(manxyz)作用的遺傳修飾；至少一種能降低微生物中n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(nana)作用的遺傳修飾；至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(naga)作用的遺傳修飾；和至少一種能降低微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(nage)作用的遺傳修飾。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種具有更高酶活性的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)，其具有seqidno：27所示的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼上述udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的核酸分子，所述核酸分子具有seqidno：26所示的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含上述核酸分子的載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含上述載體的微生物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基因組中包含上述核酸分子的微生物。在本發(fā)明中，微生物可以是任意的微生物(例如細(xì)菌、原生生物、藻類、真菌或其它微生物)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物包括但不限于細(xì)菌、酵母或真菌。優(yōu)選，所述的微生物選自細(xì)菌或酵母。進(jìn)一步優(yōu)選，細(xì)菌包括但不限于選自埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢桿菌屬(bacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、假單胞菌屬(pseudomonas)或鏈霉菌屬(streptomyces)的屬的細(xì)菌；更優(yōu)選，細(xì)菌包括但不限于選自大腸桿菌(escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、短乳桿菌(lactobacillusbrevis)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)或淺青紫鏈霉菌(streptomyceslividans)的種的細(xì)菌。進(jìn)一步優(yōu)選，酵母包括但不限于選自糖酵母屬(saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(schizosaccharomyces)、念珠菌屬(candida)、漢遜酵母屬(hansenula)、畢赤酵母屬(pichia)、克魯維酵母屬(kluveromyces)和紅法夫?qū)?phaffia)的酵母；更優(yōu)選，酵母包括但不限于選自釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、白色念珠菌(candidaalbicans)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、巴氏畢赤酵母(pichiapastoris)、加拿大畢赤酵母(pichiacanadensis)、馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)或紅法夫酵母(phaffiarohodozyma)。優(yōu)選，所述的微生物為真菌；進(jìn)一步優(yōu)選，真菌包括但不限于選自曲霉屬(aspergillus)、犁頭霉屬(absidia)、根霉屬(rhizopus)、金孢子菌屬(chrysosporium)、脈孢霉屬(neurospora)或木霉屬(trichoderma)的屬的真菌；更優(yōu)選，真菌包括但不限于選自黑曲霉(aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、藍(lán)色犁頭霉(absidiacoerulea)、米根霉(rhizopusoryzae)、勞肯諾溫斯金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、粗糙脈孢霉(neurosporacrassa)、間型脈孢霉(neurosporaintermedia)或里氏木霉(trichodermareesei)。特別優(yōu)選的大腸桿菌菌株包括k-12、b和w，最優(yōu)選k-12。盡管大腸桿菌作為優(yōu)選的微生物且用作本發(fā)明各種實(shí)施方案的實(shí)例，但是應(yīng)理解在本發(fā)明方法中可以使用產(chǎn)生n-乙酰-d-氨基葡萄糖且可以通過遺傳修飾以提高n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的任意其它微生物。用于本發(fā)明的微生物也可以稱作生產(chǎn)生物體。在本發(fā)明中，術(shù)語n-乙酰-d-氨基葡萄糖可以稱作2-乙酰氨基-2-脫氧-d-葡萄糖。術(shù)語n-乙酰-d-氨基葡萄糖、n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸和n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分別縮寫為glcnac、glcnac-6-p和glcnac-1-p。n-乙酰-d-氨基葡萄糖也縮寫為nag。與n-乙酰-d-氨基葡萄糖和衍生物類似，術(shù)語d-氨基葡萄糖、d-氨基葡萄糖-6-磷酸和d-氨基葡萄糖-1-磷酸可以分別縮寫為glcn、glcn-6-p和glcn-1-p。類似地，術(shù)語n-乙酰-d-氨基甘露糖、n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-磷酸、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸可以分別縮寫為mannac、mannac-6-p、glc、glc-6-p、fru-6-p。術(shù)語提高微生物中酶的作用是指微生物中該酶的活性增加和/或該酶被過量表達(dá)，從而提高了微生物中由該酶所催化的底物生成產(chǎn)物的量。術(shù)語降低微生物中酶的作用是指微生物中該酶的活性降低和/或該酶的表達(dá)減少，從而降低了微生物中由該酶所催化的底物生成產(chǎn)物的量。術(shù)語酶活性增加是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力增加。其涵蓋了在酶受產(chǎn)物抑制作用和酶對(duì)底物親合力不變的情況下酶自身催化化學(xué)反應(yīng)的能力增加，和/或由于酶受產(chǎn)物抑制作用降低導(dǎo)致和/或酶對(duì)底物親合力增加所導(dǎo)致的酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力增加。術(shù)語酶受產(chǎn)物抑制作用降低是指催化反應(yīng)的酶的活性受其終產(chǎn)物特異抑制作用而降低。術(shù)語酶對(duì)底物親合力增加是指酶對(duì)所催化的底物的親合力增加。圖1以大腸桿菌為例解釋了本發(fā)明公開的用于大規(guī)模生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖的氨基糖代謝途經(jīng)中遺傳修飾的主要方面。就圖1而言，粗體箭頭表示本發(fā)明涉及的通過遺傳改造產(chǎn)生和/或增加代謝流量。圖1公開了數(shù)種用于合成n-乙酰-d-氨基葡萄糖的不同方法，包括對(duì)wecb的修飾，可進(jìn)一步包括對(duì)nagb、glms或其組合的修飾，還可以進(jìn)一步包括對(duì)manxyz、nana、naga、nage、glmm、glmu或其組合的修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，其它微生物具有類似的糖代謝途經(jīng)，且在這類途經(jīng)中基因和蛋白質(zhì)具有類似的結(jié)構(gòu)和功能。因此，本發(fā)明所討論的除適用于大腸桿菌外同樣適用于其它微生物且其它微生物顯然包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名稱，這取決于該酶來源于什么樣的微生物。下面是本文涉及的許多酶的可選名稱和來自一些生物體的編碼這類酶的具體基因名稱。這些酶的名稱可以互換使用或如果合適用于給定的序列或生物體，但本發(fā)明意圖包括來自任意生物體的指定功能的酶。例如，本文一般稱作“n-乙酰-d-氨基甘露糖激酶”的酶催化由n-乙酰-d-氨基甘露糖磷酸化為n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-p。來自大腸桿菌的n-乙酰-d-氨基甘露糖激酶一般稱作nank。來自各種生物體的n-乙酰-d-氨基甘露糖激酶是本領(lǐng)域中公知的，且可用于本發(fā)明遺傳改造策略中。本文一般稱作“n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-p異構(gòu)酶”的酶催化由n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-p轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-p。來自大腸桿菌的n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-p異構(gòu)酶一般稱作nane。來自各種生物體的n-乙酰-d-氨基甘露糖-6-p異構(gòu)酶是本領(lǐng)域中公知的，且可用于本發(fā)明遺傳改造策略中。本文一般稱作“udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶”的酶催化由udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰-d-氨基甘露糖。來自大腸桿菌的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶一般稱作wecb。來自各種生物體的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶是本領(lǐng)域中公知的，且可用于本發(fā)明遺傳改造策略中。例如，本文描述了來自大腸桿菌的udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶具有由seqidno：16表示的核酸序列編碼、由seqidno：17表示的氨基酸序列。本文一般稱作“d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶”的酶催化d-氨基葡萄糖-6-磷酸和水形成葡萄糖-6-磷酸和銨的可逆反應(yīng)。該酶也稱作d-氨基葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、glcn6p脫氨酶、磷酸d-氨基葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸d-氨基葡萄糖異構(gòu)酶、d-氨基葡萄糖磷酸酯脫氨酶和2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖-6-磷酸乙酮醇異構(gòu)酶(脫氨)。來自各種生物體的d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶是本領(lǐng)域中公知的，且可用于本發(fā)明遺傳改造策略中。在大腸桿菌和其它細(xì)菌中，該酶一般稱作nagb。本文一般稱作“d-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶”的酶催化由葡萄糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成d-氨基葡萄糖-6-磷酸和谷氨酸。該酶也稱作d-氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(異構(gòu)化)、磷酸己糖氨基轉(zhuǎn)移酶、d-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶、d-氨基葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(形成谷氨酰胺)、l-谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶和glcn6p合酶。來自各種生物體的d-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶是本領(lǐng)域中公知的，且可用于本發(fā)明遺傳改造策略中。來自大腸桿菌和其它細(xì)菌的d-氨基葡萄糖-6-磷酸合酶一般稱作glms。本文一般稱作“n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶”的酶將n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸水解成d-氨基葡萄糖-6-磷酸和乙酸酯。來自各種生物體的n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶是本領(lǐng)域中公知的且可用于本發(fā)明的遺傳改造策略中。例如，本文描述了來自大腸桿菌的稱作naga。本文一般稱作“n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶”的酶催化n-乙酰-d-氨基甘露糖降解為n-乙酰神經(jīng)氨酸。來自各種生物體的n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶是本領(lǐng)域中公知的且可用于本發(fā)明的遺傳改造策略中。例如，本文描述了來自大腸桿菌的n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶稱作nana。本文一般稱作“磷酸葡糖胺變位酶”的酶催化d-氨基葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為d-氨基葡萄糖-1-磷酸。來自各種生物體的磷酸d-氨基葡萄糖變位酶是本領(lǐng)域中公知的且可用于本發(fā)明的遺傳改造策略中。該酶在大腸桿菌和其它細(xì)菌的磷酸葡糖胺變位酶一般稱作glmm。本文一般稱作“d-氨基葡萄糖-1-磷酸n-乙酰轉(zhuǎn)移酶”的酶將d-氨基葡萄糖-1-磷酸和乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化成n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸，并釋放coa。作為一種雙功能酶，它還具有n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的功能，也稱作udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖焦磷酸化酶、udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖二磷酸化酶，將n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖。來自各種生物體的d-氨基葡萄糖-1-磷酸n-乙酰轉(zhuǎn)移酶和n-乙酰-d-氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域中公知的且可用于本發(fā)明的遺傳改造策略中。該酶在大腸桿菌和其它細(xì)菌中稱作glmu?！皌rc啟動(dòng)子”經(jīng)過巧妙的設(shè)計(jì)可用于原核表達(dá)，例如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。trc啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的且可用于本發(fā)明的遺傳改造策略中。例如，本文描述了的trcpromoter具有seqidno：28表示的核苷酸序列。正如wo2004/003175發(fā)明公開的，d-氨基葡萄糖在用于大腸桿菌生長(zhǎng)的一般ph范圍內(nèi)極不穩(wěn)定。d-氨基葡萄糖和/或其降解產(chǎn)物對(duì)菌株產(chǎn)生毒性作用。甚至當(dāng)在進(jìn)行細(xì)胞接種前將濃度低至20g/l的d-氨基葡萄糖在培養(yǎng)基(ph7.0)中預(yù)保溫3.5小時(shí)的時(shí)候也觀察到毒性。毒性至少部分是由于起始ph為7.0的培養(yǎng)基中的d-氨基葡萄糖降解產(chǎn)物所致。glcn在較低ph條件下更為穩(wěn)定，d-氨基葡萄糖在ph4.7以下不會(huì)降解。但是，大腸桿菌在低于6-7的ph條件下生長(zhǎng)緩慢。因此，在相對(duì)低ph下在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行d-氨基葡萄糖生產(chǎn)的方案難以施行。根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞內(nèi)glc-6-p在nagb和glms催化下變成d-氨基葡萄糖-6-p(glcn-6-p)，并進(jìn)一步在glmm和glmu催化生成udp-n-乙?；?d-氨基葡萄糖(udp-glcnac)，在udp-n-乙酰-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)催化下變成n-乙?；?d-氨基甘露糖(mannac)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)閚-乙酰基-d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcnac-6-p)，在磷酸酶作用下去磷酸化，排出細(xì)胞外成為n-乙?；?d-氨基葡萄糖(glcnac)。本發(fā)明的方法，避免了d-氨基葡萄糖的生成，從而避免了d-氨基葡萄糖和/或其降解產(chǎn)物對(duì)菌株產(chǎn)生毒性作用。因此，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明證實(shí)可通過微生物發(fā)酵方法直接生產(chǎn)完全天然的n-乙酰-d-氨基葡萄糖；該生產(chǎn)新方法無重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)，無抗生素、藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)，生產(chǎn)不受原料供應(yīng)影響，可長(zhǎng)期穩(wěn)定生產(chǎn)，且產(chǎn)量高、成本低；所生產(chǎn)的n-乙酰-d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖產(chǎn)品具有非動(dòng)物源性，不使用蝦殼的甲殼素，使用葡萄糖等碳源發(fā)酵，屬于素食產(chǎn)品，且無水產(chǎn)品過敏源。將本文引述或描述的各公開文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。附圖說明圖1大腸桿菌中n-乙酰-d-氨基葡萄糖生物合成途徑和代謝工程策略圖具體實(shí)施方式下文將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下列實(shí)施例僅為示例性地說明和解釋本發(fā)明，而不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。凡基于本
發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均涵蓋在本發(fā)明旨在保護(hù)的范圍內(nèi)。除非另有說明，實(shí)施例中使用的原料和試劑均為市售商品。下面是本發(fā)明涉及和/或所述的各種基因修飾微生物的目錄。實(shí)施例1本實(shí)施例描述了構(gòu)建阻斷與n-乙酰-d-氨基葡萄糖被攝入及有益中間產(chǎn)物被降解有關(guān)的代謝途徑的大腸桿菌突變株所述生產(chǎn)菌株的親本菌株是at-001(escherichiacoliatcc27325)，屬于大腸桿菌k-12衍生株，來自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)。阻斷菌種對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖攝入及中間代謝產(chǎn)物降解，可以減少代謝過程中的損耗，增加目標(biāo)產(chǎn)物(n-乙酰-d-氨基葡萄糖)的積累。構(gòu)建這種突變型宿主菌株，可通過將其染色體基因組上manxyz、nana、naga和nage基因序列完全或部分刪除，使其功能失效，從而使n-乙酰-d-氨基葡萄糖累積。這種染色體上基因序列刪除，可以采用red重組技術(shù)完成。red重組是一種基于λ噬菌體red操縱子和rac噬菌體rece/rect系統(tǒng)介導(dǎo)的dna同源重組技術(shù)。通過該技術(shù)可以簡(jiǎn)單、快速地對(duì)任意大的dna分子進(jìn)行插入、敲除、突變等多種修飾。red重組技術(shù)簡(jiǎn)單地說，首先向菌體中轉(zhuǎn)入帶有表達(dá)重組酶基因的pkd46質(zhì)粒，然后電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆，最后，將重組后菌種中抗性基因消除。以下描述了具體的操作過程：1、刪除manxyz基因序列甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白eiim，p/iiiman(mannosetransportereiim，p/iiiman，manxyz)可以用作n-乙酰-d-氨基葡萄糖的第二轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將n-乙酰-d-氨基葡萄糖等己糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，從而使排出胞外并積累的目標(biāo)產(chǎn)物運(yùn)回胞內(nèi)降解。將manxyz基因序列刪除，可以阻止細(xì)胞外n-乙酰-d-氨基葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)降解。(1)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段1)pcr擴(kuò)增fkanrf片段fkanrf片段，即frt-kanr-frt片段，是指將卡拉霉素抗性基因(kanr)的兩端裝有flp重組酶特異性識(shí)別的frt位點(diǎn)堿基序列。設(shè)計(jì)引物：正向引物(mfkanf-f)seqidno.1，反向引物(mfkanf-r)seqidno.2。模板：ppic9k。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。fkanrf大?。?.28kb。其核苷酸序列seqidno.3。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。2)pcr擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)manxyz序列seqidno.4，設(shè)計(jì)刪除manxyz序列的同源臂正向引物(manxyzko-f)seqidno.5，反向引物(manxyzko-r)seqidno.6。模板：擴(kuò)增的fkanrfpcr片段。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-001菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒pkd46載體是帶有表達(dá)red重組酶基因的質(zhì)粒，表達(dá)exo、bet和gam三基因片段，3個(gè)基因置于阿拉伯糖啟動(dòng)子下，經(jīng)l-阿拉伯糖誘導(dǎo)就可以大量表達(dá)。為達(dá)到通過red重組修飾染色體上目標(biāo)基因的目的，有必要將pkd46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliatcc27325菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。其中，0.1mcacl2的制備：用無水cacl2配1m的cacl2，用蒸氣壓力為15lbf/in2的高壓滅菌20min，分裝1.5ml于-20℃保存，用時(shí)融化后按1:10比例稀釋配成0.1m的cacl2。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆①電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoliatcc27325菌種at-001接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(1)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克隆：加入1ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-002-01(at-001，△manxyz::fkanrf)。(3)抗性基因的消除為便于后續(xù)工作，可消除所獲得菌種(陽性克隆)中的抗性基因。消除抗性基因可借助pcp20質(zhì)粒完成。pcp20是帶有氨芐青霉素和氯霉素抗性基因的質(zhì)粒，熱誘導(dǎo)后可表達(dá)flp重組酶，該酶可特異性識(shí)別frt位點(diǎn)，通過重組可將frt位點(diǎn)間的序列刪除，只保留一個(gè)frt位點(diǎn)。將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-002-02(at-001，△manxyz)。2、刪除nana基因序列n-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶(n-acetylneuraminatelyase，nana)能夠?qū)⑽⑸镏械膎-乙酰-d-氨基甘露糖(mannac)降解成n-乙酰-d-神經(jīng)氨酸(neu5ac)。將nanketa操縱子中的nana基因序列刪除，可以阻止n-乙酰-d-氨基甘露糖(mannac)降解成n-乙酰-d-神經(jīng)氨酸(neu5ac)。(1)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)nane-nank前段nana序列seqidno.7，設(shè)計(jì)nana序列刪除的同源臂引物：正向引物(nanako-f)seqidno.8，反向引物(nanako-r)seqidno.9。模板：擴(kuò)增的fkanrfpcr片段。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-002-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliat-002-02(at-001，△manxyz)菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆①電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoli菌種at-002-02接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(1)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克隆：加入1ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-003-01(at-002-02，△nana::fkanrf)。(3)抗性基因的消除將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-003-02(at-002-02，△nana)。3、刪除naga基因序列n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶(n-acetylglucosamine-6-phosphatedeacetylase，naga)能將微生物中n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcnac-6-p)轉(zhuǎn)變?yōu)閐-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcn-6-p)。將nag操縱子(nage-nagbacd)中的naga基因序列刪除，可以阻止n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcnac-6-p)轉(zhuǎn)變?yōu)閐-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcn-6-p)。(1)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)ncbi查找nc_000913，escherichiacolistr.k-12n-乙酰-d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶基因naga序列seqidno.10，設(shè)計(jì)naga序列刪除的同源臂引物：正向引物(nagako-f)seqidno.11，反向引物(nagako-r)seqidno.12。模板：擴(kuò)增的fkanrfpcr片段。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-003-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliat-003-02(at-002-02，△nana)菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克?、匐娹D(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoli菌種at-003-02接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(1)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克隆：加入1ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-004-01(at-003-02，△naga::fkanrf)。(3)抗性基因的消除將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-004-02(at-003-02，△naga)。4、刪除nage基因序列將n-乙酰-d-氨基葡萄糖特異酶iinag(n-acetyl-glucosamine-specificenzymeiinag，nage)的基因序列nage刪除，可阻止細(xì)胞外glcnac被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞內(nèi)降解。(1)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)ncbi查找nc_000913，escherichiacolistr.k-12nagb啟動(dòng)子和nage基因序列seqidno.13，設(shè)計(jì)刪除nage基因序列的同源臂正向引物(nageko-f1)seqidno.14，反向引物(nageko-r1)seqidno.15。模板：擴(kuò)增的fkanrfpcr片段。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-004-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliat-004-02(at-003-02，△naga)菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆①電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoli菌種at-004-02接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(1)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克?。杭尤?ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-005-01(at-004-02，△nage::fkanrf)。(3)抗性基因的消除將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-005-02(at-004-02，△nage)。實(shí)施例2本實(shí)施例描述了udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因wecb的克隆和大腸桿菌中轉(zhuǎn)化wecb/ptrc99a質(zhì)粒，以及ptrc-wecb基因盒向大腸桿菌染色體中的整合。1、wecb基因的克隆、在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化wecb/ptrc99a質(zhì)粒及其對(duì)n乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響將大腸桿菌udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(udp-n-acetyl-d-glucosamine-2-epimerase，wecb)基因wecb，置于trc啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)化菌種，使之過量表達(dá)，可加強(qiáng)udp-glcnac(udp-n-acetylglucosamine，udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖)變成mannac(n-acetyl-d-mannosamine，n-乙酰-d-氨基甘露糖或n-乙酰-d-甘露糖胺)。1)大腸桿菌wecb基因的克隆根據(jù)ncbi查找大腸桿菌wecb基因核苷酸序列seqidno.16，其氨基酸序列seqidno.17。設(shè)計(jì)引物：正向引物(trcwecb-f)seqidno.18，反向引物(trcwecb-r)seqidno.19。模板：at-001(escherichiacoliatcc27325)基因組。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物大?。?.13kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。將所獲得的pcr擴(kuò)增片段和puc57-t載體連接并測(cè)序鑒定，獲得wecb/puc57。2)將wecb基因置于trc啟動(dòng)子控制下的質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化①質(zhì)粒構(gòu)建：擴(kuò)增質(zhì)粒wecb/puc57，分別用ncoi和hindiii酶切質(zhì)粒wecb/puc57和載體ptrc99a，瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收wecb片段和ptrc99a片段，用t4dna連接酶，16℃將連接過夜，并鑒定，得到wecb/ptrc99a質(zhì)粒。②感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的at-005-02菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。③質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlwecb/ptrc99a質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。得到重組菌wecb/ptrc99a(at-005-02)3)wecb/ptrc99a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響將重組菌wecb/ptrc99a(at-005-02)和對(duì)照菌種，做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于3ml的lb液體培養(yǎng)基試管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培養(yǎng)約8小時(shí)。lb液體培養(yǎng)基成分：5g/l酵母粉,10g/l蛋白胨,10g/lnacl。然后取種子培養(yǎng)液，3％接種于含50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液(m9培養(yǎng)液)250ml搖瓶中。起始o(jì)d600約0.5，37℃下，225rpm培養(yǎng)，發(fā)酵周期72小時(shí)。在第24小時(shí)、48小時(shí)，用10mnaoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至7.0。根據(jù)發(fā)酵液糖耗情況，分次加入65％葡萄糖液維持葡萄糖濃度在20g/l。發(fā)酵結(jié)束，取1ml發(fā)酵液，離心。用hplc法測(cè)定n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量。①n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量的hplc法測(cè)定緩沖液：將3.5g磷酸氫二鉀加入1l容量瓶中，加水足以溶解，加0.25ml氨水，再加水稀釋混勻，用磷酸調(diào)ph到7.5，以水定容。流動(dòng)相：乙腈：緩沖液(75:25)。稀釋液：乙腈和水(50:50)。標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0mg/mluspn-乙酰-d-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(rs)溶于稀釋液中。樣品溶液：1.0mg/mln-乙酰-d-氨基葡萄糖樣品溶于稀釋液中。液相條件：型號(hào)：lc檢測(cè)器：uv195nm色譜柱：4.6-mm×15-cm；3-μmpackingl8流速：1.5ml/min柱溫：35℃進(jìn)樣體積：10μl②m9培養(yǎng)液的配制先配制5×m9培養(yǎng)基：將在約800ml雙蒸水(ddh2o)中加入64gna2hpo4·7h2o、15gkh2po4、2.5gnacl、5.0gnh4cl，溶解后，加水至1000ml。121℃滅菌30分鐘。再分別配制1mmgso4、1mcacl2、20％葡萄糖，并單獨(dú)滅菌。然后按表1配制m9培養(yǎng)液，其中，1000×微量元素溶液按表2配制。表1.m9培養(yǎng)液成分成分用量(ml/l)5×m92001mmgso421mcacl20.120％葡萄糖201000×微量元素溶液1ddh2o至1000ph6.9表2.1000×微量元素溶液成分成分用量(g/l)cocl2·6h2o0.01cuso4·5h2o0.01mnso4·h2o0.033feso4·7h2o0.50znso4·7h2o0.38h3bo30.01namoo4·2h2o0.01ph3③wecb/ptrc99a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)搖瓶發(fā)酵n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量情況見表3。結(jié)果表明：對(duì)照菌種at-005-02產(chǎn)量很低，未檢出，而wecb基因在trc啟動(dòng)子控制下過量表達(dá)的重組菌wecb/ptrc99a(at-005-02)產(chǎn)量明顯提高。表3.重組菌wecb/ptrc99a(at-005-02)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量菌種n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量(g/l)at-005-02(at-004-02，△nage)(對(duì)照)未檢出wecb/ptrc99a(at-005-02)4.2±0.42、ptrc-wecb基因盒向大腸桿菌染色體中整合以nage基因位點(diǎn)為ptrc-wecb基因盒在染色體上的整合位點(diǎn)。為達(dá)到ptrc-wecb基因盒向大腸桿菌染色體中的整合，首先，擴(kuò)增帶trc啟動(dòng)子的wecb片段ptrc-wecb，以及兩側(cè)帶有flp重組酶識(shí)別位點(diǎn)(frt位點(diǎn))的卡拉霉素抗性基因片段：frt-kanr-frt(fkanrf)，并拼接。然后，再一次設(shè)計(jì)刪除nage基因序列同源臂的引物，并以ptrc-wecb和fkanrf拼接的片段為模板，擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段。具體操作過程如下：(1)pcr擴(kuò)增ptrc-wecb片段模板：wecb/ptrc99a。設(shè)計(jì)引物：正向引物(trcff-f)seqidno.20，反向引物(trcff-r)seqidno.21。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。產(chǎn)物大小：1.3kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(2)pcr擴(kuò)增fkanrf片段設(shè)計(jì)引物：正向引物(mfkanf-f)seqidno.1，反向引物(mfkanf-r)seqidno.2。模板：ppic9k。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。fkanrf大?。?.28kb。其核苷酸序列seqidno.3。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(3)擴(kuò)增與ptrc-wecb對(duì)接的fkanrf設(shè)計(jì)引物：正向引物(fkanf-f)seqidno.22，反向引物(fkanf-r)seqidno.23。模板：fkanrf。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。二次擴(kuò)增的fkanrf大小：1.3kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(4)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：再一次設(shè)計(jì)刪除nage基因序列同源臂的正向引物(nageko-f2)seqidno.24，反向引物(nageko-r2)seqidno.25。模板：ptrc-wecbpcr片段和二次擴(kuò)增的fkanrfpcr片段，1：1混合。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+ptrc-wecb-fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(5)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-004-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliat-004-02菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入到10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆①電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoli菌種at-004-02接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(4)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克隆：加入1ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-042-01(at-004-02，△nage::ptrc-wecb-fkanrf)。(6)抗性基因的消除將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-042-02(at-004-02，△nage::ptrc-wecb)。3、ptrc-wecb基因盒整合對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響將在染色體nage基因位點(diǎn)上整合有ptrc-wecb基因盒的重組菌at-042-02和對(duì)照菌種，做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于3ml的lb液體培養(yǎng)基試管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培養(yǎng)約8小時(shí)。然后取種子培養(yǎng)液，3％接種于含50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液(m9培養(yǎng)液)250ml搖瓶中。起始o(jì)d600約0.5，37℃下，225rpm培養(yǎng)，發(fā)酵周期72小時(shí)。在第24小時(shí)、48小時(shí)，用10mnaoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至7.0。根據(jù)發(fā)酵液糖耗情況，分次加入65％葡萄糖液維持葡萄糖濃度在20g/l。發(fā)酵結(jié)束，取1ml發(fā)酵液，離心。用hplc法測(cè)定n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量情況見表4。結(jié)果表明：對(duì)照菌種at-001、at-005-02產(chǎn)量很低，未檢出，而ptrc-wecb基因盒整合重組菌產(chǎn)量明顯提高，且較未整合的重組菌wecb/ptrc99a(at-005-02)產(chǎn)量亦有明顯提高。表4.ptrc-wecb基因盒整合重組菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量菌種n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量(g/l)at-001(對(duì)照)未檢出at-005-02(at-004-02，△nage)(對(duì)照)未檢出wecb/ptrc99a(at-005-02)4.1±0.5at-042-02(at-004-02，△nage::ptrc-wecb)7.0±0.8實(shí)施例3本實(shí)施例描述篩選突變的udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶(wecb)的基因，所述基因編碼酶活性增加的udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶。為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)菌株中的n-乙酰-d-氨基葡萄糖合成量，篩選編碼具有酶活性增加的udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶的基因突變體。為了達(dá)到該目的，用易錯(cuò)pcr技術(shù)擴(kuò)增克隆的基因，通過用于擴(kuò)增的dna聚合酶，在導(dǎo)致高頻錯(cuò)配的條件下擴(kuò)增所述基因，以便在pcr產(chǎn)物中得到高頻突變。具體操作過程如下：1、易錯(cuò)pcr擴(kuò)增大腸桿菌udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶基因wecb利用taqdna聚合酶不具有3'-5'校對(duì)功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度(8mmol/l)和不同濃度dntp的濃度下(其中，datp和dgtp濃度為1.5mmol/l；dttp和dctp濃度為3.0mmol/l)，來控制隨機(jī)突變的頻率，向目的基因中引入隨機(jī)突變，構(gòu)建突變庫；模板濃度a260值為1000ng/ml，酶濃度為5u/μl，引物濃度為100μm。易錯(cuò)pcr反應(yīng)體系(50μl)：10×pcr反應(yīng)緩沖液5μl，dntp(2.5mm)5μl，mgcl2(2.5mm)5μl，正向引物(trcwecb-f，seqidno.18)1μl，反向引物(trcwecb-r，seqidno.19)1μl，dna模板(wecb/puc57)0.1μl，taqdna聚合酶0.5μl，ddh2o32.4μl。pcr程序：96℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45個(gè)循環(huán)；最后75℃延伸15min，采用膠回收方法回收pcr產(chǎn)物(產(chǎn)物大?。?.13kb)；取5μl產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，-20℃保存?zhèn)溆谩?、構(gòu)建udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶的基因突變體庫將上述pcr產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶ncoi和hindiii雙酶切消化后，與用ncoi和hindiii內(nèi)切酶消化的ptrc99a質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，然后用連接產(chǎn)物混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌at-005-02，獲得大量克隆轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體突變庫。3、篩選高酶活突變體從轉(zhuǎn)化菌體突變庫中，隨機(jī)挑取突變克隆640株，以野生型wecb/ptrc99a(at-005-02)為對(duì)照，分別接種至含50μg/ml青霉素(amp)的5mllb培養(yǎng)基中，37℃、150rpm培養(yǎng)18h后，10000rpm，5mim離心收集菌體。棄上清后，在4℃下重懸于1mlpbs(ph值7.5，10mmol/l)溶液中，在冰浴條件下選取300v電壓，超聲3s間歇6s對(duì)其進(jìn)行超聲破碎10min，離心取上清作為酶粗提液，進(jìn)行酶活測(cè)定。udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶的活性檢測(cè)：以u(píng)dp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化為n-乙酰-d-氨基甘露糖多少為依據(jù)。也就是udp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖減少為測(cè)定標(biāo)記。酶活單位定義：在酶促反應(yīng)條件下，每分鐘減少相當(dāng)于1μmoludp-n-乙酰-d-氨基葡萄糖所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(iu)。具體操作如下：以20ml反應(yīng)體系為酶活測(cè)定體系，其中含45mmol/l磷酸緩沖液(ph7.5)、10mmmgcl2and100nciofudpglcnac及5mg粗酶液。酶活反應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行孵育30min。加乙醇終止反應(yīng)。帶放射性化合物用紙色譜分離。用液相閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定其放射性強(qiáng)度。所用溶劑體系為正丙醇：1m醋酸鈉，ph5.0：水(7：1：2)。根據(jù)udpglcnac轉(zhuǎn)化為mannac的多少，計(jì)算udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶的活性單位。結(jié)果表明：最高突變體菌株的酶活為653iu/ml，對(duì)照菌株的酶活為21.0iu/ml。通過易錯(cuò)pcr對(duì)wecb進(jìn)行改造，獲得酶活力大大提高的突變株。挑選該酶活性最高的突變體菌株，提取質(zhì)粒測(cè)序。結(jié)果表明：該udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶突變體基因序列如seqidno.26所示，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如seqidno.27所示。與野生型的udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶基因序列比對(duì)，共發(fā)生了5處堿基點(diǎn)突變：101g/c，433c/g，677g/t，734t/g，1038t/c；致氨基酸4處錯(cuò)義突變，其突變點(diǎn)分別為：c34s(第34位半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸)，h145d(第145位組氨酸變?yōu)樘於彼?，c226f(第226位半胱氨酸變?yōu)楸奖彼?，v245g(第245位纈氨酸變?yōu)楦拾彼?。將該突變基因命名為wecbm。4、ptrc-wecbm基因盒向大腸桿菌染色體nage基因位點(diǎn)上整合以nage基因位點(diǎn)為ptrc-wecbm基因盒在染色體上的整合位點(diǎn)。為達(dá)到ptrc-wecbm基因盒向大腸桿菌染色體中的整合，首先，擴(kuò)增帶trc啟動(dòng)子的wecbm片段ptrc-wecbm，以及兩側(cè)帶有flp重組酶識(shí)別位點(diǎn)(frt位點(diǎn))的卡拉霉素抗性基因片段：frt-kanr-frt(fkanrf)，并拼接。然后，再一次設(shè)計(jì)刪除nage基因序列同源臂的引物，并以ptrc-wecbm和fkanrf拼接的片段為模板，擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段。具體操作過程如下：(1)pcr擴(kuò)增ptrc-wecbm片段模板：wecbm/ptrc99a。設(shè)計(jì)引物：正向引物(trcff-f)seqidno.20，反向引物(trcff-r)seqidno.21。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。產(chǎn)物大小：1.3kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(2)pcr擴(kuò)增fkanrf片段設(shè)計(jì)引物：正向引物(mfkanf-f)seqidno.1，反向引物(mfkanf-r)seqidno.2。模板：ppic9k。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。fkanrf大?。?.28kb。其核苷酸序列seqidno.3。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(3)擴(kuò)增與ptrc-wecbm對(duì)接的fkanrf設(shè)計(jì)引物：正向引物(fkanf-f)seqidno.22，反向引物(fkanf-r)seqidno.23。模板：fkanrf。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。二次擴(kuò)增的fkanrf大?。?.3kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。(4)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：再一次設(shè)計(jì)刪除nage基因序列同源臂的正向引物(nageko-f2)seqidno.24，反向引物(nageko-r2)seqidno.25。模板：ptrc-wecbmpcr片段和二次擴(kuò)增的fkanrfpcr片段，1：1混合。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+ptrc-wecbm-fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。(5)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-004-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。1)轉(zhuǎn)化pkd46質(zhì)粒①感受態(tài)制備：首先，將保存于-20℃的escherichiacoliat-004-02菌液，按1:50-100接種于10mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。再將培養(yǎng)液加入10ml離心管中，4000g×5min，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮5min。最后，4000g×5min離心，棄去上清，用冰浴的0.1mcacl25ml懸浮。-4℃靜置12小時(shí)，自然沉降。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取自然沉降的菌體250μl，加入5μlpkd46質(zhì)粒，-4℃，30min。然后，42℃水浴1.5min，加入soc培養(yǎng)基0.7ml，30℃搖2小時(shí)。取0.2ml菌液，涂青霉素平板。30℃過夜(12-16小時(shí))培養(yǎng)。挑單克隆，加入5mllb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽質(zhì)粒鑒定。保存陽性菌種備用。2)電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆①電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備：將含pkd46escherichiacoli菌種at-004-02接種于含有氨芐青霉素(amp)lb培養(yǎng)基的試管，250rpm搖床過夜，第二天以1％的量接種至含有amp的lb培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，待od600達(dá)到0.2左右后，加入0.2％的l-阿拉伯糖，30℃誘導(dǎo)35分鐘，直至od600達(dá)到0.4左右。冰浴冷卻。用超純水洗一次，10％甘油洗兩次，最后用10％甘油重懸，甘油用量以使菌體被濃縮500-1000倍的終濃度為宜。②電擊轉(zhuǎn)化：將2mm電轉(zhuǎn)杯從70％乙醇中取出，用滅菌超純水洗2次，紫外燈照射30分鐘。4℃預(yù)冷30分鐘。取90μl最終重懸的細(xì)胞，移至預(yù)冷的離心管，加入5μl(100ng以上)步驟(4)得到的全長(zhǎng)pcr片段(線性dna)，用槍輕輕吸打混勻，冰浴30分鐘。電轉(zhuǎn)參數(shù)：2500v，200ω，25μf。③復(fù)蘇與篩選陽性克隆：加入1ml的lb液體培養(yǎng)基，37℃，100rpm，1小時(shí)。然后每200μl涂布一個(gè)卡拉霉素(kan)平板，一共5個(gè)。均勻、涂干。30℃培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。挑在卡拉霉素抗性下生長(zhǎng)的克隆，作pcr鑒定，篩選陽性克隆。所獲得菌種編號(hào)：at-043-01(at-004-02，△nage::ptrc-wecbm-fkanrf)。(6)抗性基因的消除將pcp20轉(zhuǎn)入上述卡拉霉素抗性克隆，30℃培養(yǎng)8h，后提高到42℃過夜，熱誘導(dǎo)flp重組酶表達(dá)，質(zhì)粒逐漸丟失。用接種環(huán)蘸菌液在無抗生素培養(yǎng)基上劃板，挑長(zhǎng)出的單克隆點(diǎn)到卡拉霉素抗性平板上，未生長(zhǎng)的為卡拉霉素抗性基因已被flp重組酶刪除的克隆。用鑒定引物作pcr對(duì)卡拉霉素抗性消失的克隆進(jìn)行鑒定。所獲得菌種編號(hào)：at-043-02(at-004-02，△nage::ptrc-wecbm)。5、ptrc-wecbm基因盒整合對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響將在染色體nage基因位點(diǎn)上整合有ptrc-wecbm基因盒的重組菌at-043-02和對(duì)照菌種，做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于3ml的lb液體培養(yǎng)基試管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培養(yǎng)約8小時(shí)。然后取種子培養(yǎng)液，3％接種于含50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液(m9培養(yǎng)液)250ml搖瓶中。起始o(jì)d600約0.5，37℃下，225rpm培養(yǎng)，發(fā)酵周期72小時(shí)。在第24小時(shí)、48小時(shí)，用10mnaoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至7.0。根據(jù)發(fā)酵液糖耗情況，分次加入65％葡萄糖液維持葡萄糖濃度在20g/l。發(fā)酵結(jié)束，取1ml發(fā)酵液，離心。用hplc法測(cè)定n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量情況見表5。結(jié)果表明：對(duì)照菌種at-005-02產(chǎn)量很低，未檢出，突變的ptrc-wecbm基因盒整合重組菌at-043-02產(chǎn)量明顯提高，且較未突變的對(duì)照菌種at-042-02產(chǎn)量亦有明顯提高。表5.ptrc-wecbm基因盒整合重組菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量菌種n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量(g/l)at-005-02(at-004-02，△nage)(對(duì)照)未檢出at-042-02(at-004-02，△nage::ptrc-wecb)7.1±0.8at-043-02(at-004-02，△nage::ptrc-wecbm)10.9±0.9以上結(jié)果顯示：不僅udp-n-乙酰氨基葡萄糖-2-異構(gòu)酶超表達(dá)可明顯提高n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量，通過易錯(cuò)pcr技術(shù)篩選突變體也可大大提高n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量，這是由于所獲得的該異構(gòu)酶突變體酶活性增加所致。實(shí)施例4本實(shí)施例描述整合有ptrc-wecbm盒的大腸桿菌菌株，其中將氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)的基因glms和/或d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(nagb)的基因nagb的內(nèi)源性天然啟動(dòng)子更換和/或刪除對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響。1、將nagb基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子換成trc啟動(dòng)子，進(jìn)一步刪除glms基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子，對(duì)整合有ptrc-wecbm盒的大腸桿菌菌株n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響。(1)將nagb基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子換成trc啟動(dòng)子將nag調(diào)節(jié)子(nage-nagbacd)中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(d-glucosamine-6-phosphatedeaminase，nagb)基因啟動(dòng)子刪除，更換成trc啟動(dòng)子。d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(d-glucosamine-6-phosphatedeaminase，nagb)所催化的反應(yīng)是可逆的，過量表達(dá)nagb，加快nagb的正向催化反應(yīng)，達(dá)到增加d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcn-6-p)目的。首先，擴(kuò)增trc啟動(dòng)子片段與fkanrf片段，并拼接。然后，設(shè)計(jì)同源臂引物，擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段。a)擴(kuò)增trc啟動(dòng)子序列根據(jù)公開信息，查得trc啟動(dòng)子序列：seqidno.28。設(shè)計(jì)引物：正向引物(kantrcred-f)seqidno.29，反向引物(kantrcred-r)seqidno.30。模板：ptrc99apcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。產(chǎn)物大?。?66bp。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。b)擴(kuò)增兩側(cè)帶有flp重組酶識(shí)別位點(diǎn)(frt位點(diǎn))的卡拉霉素抗性基因：fkanrf設(shè)計(jì)引物：正向引物(mfkanf-f)seqidno.1，反向引物(mfkanf-r)seqidno.2。模板：ppic9k。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。fkanrf大?。?.28kb。其核苷酸序列seqidno.3。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。c)擴(kuò)增與trc啟動(dòng)子對(duì)接的fkanrf設(shè)計(jì)引物：正向引物(fkanfred-f1)seqidno.31，反向引物(fkanfred-r1)seqidno.32。模板：fkanrf。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。二次擴(kuò)增的fkanrf大?。?.3kb。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。d)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)ncbi查找nc_000913，escherichiacolistr.k-12nagb啟動(dòng)子序列和nage基因序列seqidno.13，設(shè)計(jì)刪除nagb啟動(dòng)子同源臂的正向引物(nagbko-f1)seqidno.33，反向引物(nagbko-r1)seqidno.34。模板：trc啟動(dòng)子pcr片段和二次擴(kuò)增的fkanrfpcr片段，1：1混合。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+trc啟動(dòng)子+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。e)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-043-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。所獲得菌種編號(hào)：at-044(at-043-02，△nagbpromotor::trcpromoter)。(2)刪除glms基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子刪除氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase，glms)基因啟動(dòng)子序列。氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)又稱l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶(l-glutamine：d-fructose-6-phosphateaminotransferase)，能夠催化葡萄糖-6-磷酸(glc-6-p)氨基化為d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcn-6-p)，但有嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制問題，將其啟動(dòng)子序列刪除，使該酶喪失表達(dá)，可解除glcn-6-p的產(chǎn)物抑制。首先，擴(kuò)增fkanrf片段，然后，設(shè)計(jì)同源臂引物，擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段1)擴(kuò)增兩側(cè)帶有flp重組酶識(shí)別位點(diǎn)(frt位點(diǎn))的卡拉霉素抗性基因：fkanrf設(shè)計(jì)引物：正向引物(mfkanf-f)seqidno.1，反向引物(mfkanf-r)seqidno.2。模板：ppic9k。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。fkanrf大小：1.28kb。其核苷酸序列seqidno.3。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收片段。2)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)ncbi查找nc_000913，escherichiacolistr.k-12l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶(glms)基因啟動(dòng)子序列seqidno.35，設(shè)計(jì)glms基因啟動(dòng)子序列刪除的同源臂正向引物(proglmsko-f)seqidno.36，反向引物(proglmsko-r)seqidno.37。模板：fkanrfpcr片段。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。3)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-044菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。所獲得菌種編號(hào)：at-045(at-044，△glmspromotor)。(3)將nagb啟動(dòng)子更換為更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子及進(jìn)一步刪除glms啟動(dòng)子對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響對(duì)整合有ptrc-wecbm盒的菌株，將nagb啟動(dòng)子更換為更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，以及進(jìn)一步刪除glms啟動(dòng)子的重組菌做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于3ml的lb液體培養(yǎng)基試管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培養(yǎng)約8小時(shí)。然后取種子培養(yǎng)液，3％接種于含50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液(m9培養(yǎng)液)250ml搖瓶中。起始o(jì)d600約0.5，37℃下，225rpm培養(yǎng)，發(fā)酵周期72小時(shí)。在第24小時(shí)、48小時(shí)，用10mnaoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至7.0。根據(jù)發(fā)酵液糖耗情況，分次加入65％葡萄糖液維持葡萄糖濃度在20g/l。發(fā)酵結(jié)束，取1ml發(fā)酵液，離心。用hplc法測(cè)定n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量情況見表6。結(jié)果表明：將nagb啟動(dòng)子更換為trc啟動(dòng)子的重組菌對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量明顯增加，進(jìn)一步刪除glms啟動(dòng)子后n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量有更大提高。表6.更換nagb啟動(dòng)子以及進(jìn)一步刪除glms啟動(dòng)子的重組菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量菌種n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量(g/l)at-043-02(對(duì)照)10.8±1.0at-044(at-043-02，△nagbpromotor::trcpromoter)13.5±1.2at-045(at-044，△glmspromotor)19.0±1.22、將glms基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子換成trc啟動(dòng)子，進(jìn)一步刪除nagb基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子，對(duì)整合有ptrc-wecbm盒的大腸桿菌菌株n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響。(1)將glms基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子換成trc啟動(dòng)子將l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶(l-glutamine：d-fructose-6-phosphateaminotransferase)基因啟動(dòng)子序列更換為trc啟動(dòng)子序列。l-谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶又稱氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glucosamine-6-phosphatesynthase，glms)，將其啟動(dòng)子序列更換為trc啟動(dòng)子序列，可過量表達(dá)glms，加快glms催化功能，達(dá)到增加d-氨基葡萄糖-6-磷酸(glcn-6-p)目的。首先，擴(kuò)增trc啟動(dòng)子序列片段與fkanrf片段，并拼接。然后，設(shè)計(jì)同源臂引物，擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段。1)擴(kuò)增red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)glms基因啟動(dòng)子序列seqidno.35，設(shè)計(jì)更換為trc啟動(dòng)子的同源臂正向引物(proglmsptrc-f)seqidno.38，反向引物(proglmsptrc-r)seqidno.39。模板：trc啟動(dòng)子pcr片段和二次擴(kuò)增的fkanrfpcr片段，1：1混合。pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+trc啟動(dòng)子+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-043-02菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。所獲得菌種編號(hào)：at-046(at-043-02，△glmspromotor::trcpromoter)。(2)刪除nagb基因內(nèi)源性天然啟動(dòng)子將nag調(diào)節(jié)子(nage-nagbacd)中d-氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶(d-glucosamine-6-phosphatedeaminase，nagb)基因啟動(dòng)子序列刪除，使nagb失去功能，可消除nagb逆向催化功能，減少glcn-6-p生成glc-6-p。首先，擴(kuò)增fkanrf片段，然后，設(shè)計(jì)同源臂引物，制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)片段。1)制備red重組打靶用線性dna全長(zhǎng)pcr片段設(shè)計(jì)同源臂引物：根據(jù)nagb啟動(dòng)子和nage基因序列seqidno.13，設(shè)計(jì)刪除nagb啟動(dòng)子序列的同源臂正向引物(nagbko-f2)seqidno.40，反向引物(nagbko-r2)seqidno.41。模板：fkanrfpcr片段pcr反應(yīng)條件：第一步：94℃變性1min；第二步：94℃30s，55℃30s，72℃40s，循環(huán)30次；第三步：72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物：同源臂+fkanrf+同源臂。將pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離、純化回收，得到100ng/μl的線性dna全長(zhǎng)pcr片段用于red重組打靶。2)red重組操作首先，將pkd46載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌at-046菌株中。然后，電轉(zhuǎn)化制備好的打靶用線性dna片段，篩選陽性克隆。最后，消除抗性基因。所獲得菌種編號(hào)：at-047(at-046，△nagbpromotor)。(3)將glms啟動(dòng)子更換為更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子及進(jìn)一步刪除nagb啟動(dòng)子對(duì)n-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的影響對(duì)整合有ptrc-wecbm盒的菌株，將glms啟動(dòng)子更換為更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子，以及進(jìn)一步刪除nagb啟動(dòng)子的重組菌做搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)。取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于3ml的lb液體培養(yǎng)基試管(13×150mm)中，30℃，225rpm，培養(yǎng)約8小時(shí)。然后取種子培養(yǎng)液，3％接種于含50ml的發(fā)酵培養(yǎng)液(m9培養(yǎng)液)250ml搖瓶中。起始o(jì)d600約0.5，37℃下，225rpm培養(yǎng)，發(fā)酵周期72小時(shí)。在第24小時(shí)、48小時(shí)，用10mnaoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph至7.0。根據(jù)發(fā)酵液糖耗情況，分次加入65％葡萄糖液維持葡萄糖濃度在20g/l。發(fā)酵結(jié)束，取1ml發(fā)酵液，離心。用hplc法測(cè)定n-乙酰-d-氨基葡萄糖含量。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量情況見表7。結(jié)果表明：將glms啟動(dòng)子更換為trc啟動(dòng)子的重組菌對(duì)n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量增加效果不明顯，但同時(shí)刪除nagb啟動(dòng)子后n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量較對(duì)照菌種有明顯提高。表7.更換glms啟動(dòng)子以及進(jìn)一步刪除nagb啟動(dòng)子的重組菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量菌種n-乙酰-d-氨基葡萄糖產(chǎn)量(g/l)at-043-02(對(duì)照)10.9±1.1at-046(at-043-02，△glmspromotor::trcpromoter)11.2±1.2at-047(at-046，△nagbpromotor)15.6±1.3實(shí)施例5本實(shí)施例描述以10l發(fā)酵罐生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)以重組工程菌株at-047作為生產(chǎn)菌種，以10l發(fā)酵罐做生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)。1、種子培養(yǎng)(1)一級(jí)種子培養(yǎng)：挑取新鮮培養(yǎng)的lb平板培養(yǎng)基上單克隆菌株，接種于8ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、225rpm培養(yǎng)8小時(shí)。(2)二級(jí)種子培養(yǎng)：取6ml一級(jí)種子培養(yǎng)液，接種于含200ml的m9培養(yǎng)液的1000ml搖瓶中，37℃、225rpm培養(yǎng)16小時(shí)。至od600值為6.0-10，約為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基按表8配制，其中，微量元素溶液按表9配制，復(fù)合維生素溶液按表10配制。表8.發(fā)酵培養(yǎng)基注：①微量元素溶液?jiǎn)为?dú)滅菌后加入，維生素溶液過濾后加入；②葡萄糖：濃度65％(w/v)，單獨(dú)滅菌，在接種前加入，葡萄糖加入量：6.0g/l；③以上合并一起后，用10mnh4oh調(diào)ph至7.0；④發(fā)酵培養(yǎng)基在加入葡萄糖之前為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始裝液量(培養(yǎng)基的初始體積占發(fā)酵罐總?cè)萘矿w積)：50％。表9.微量元素溶液成分用量(g/l)cacl2·2h2o10fecl3·6h2o10mnso4·5h2o2.5alcl3·6h2o2.5cocl2·6h2o1.75znso4·2h2o0.5namoo4·2h2o0.5cuso4·5h2o0.25h3bo30.125ph3～4表10.復(fù)合維生素溶液成分用量(mg/l)葉酸folicacid2維生素b2riboflavin100維生素b1thiaminehcl1500煙酸nicotinicacid500維生素b6pyridoxinehcl500泛酸鈣ca-panthothenate500生物素biotin1維生素b12vitaminb12102、接種將二級(jí)種子液按40ml/l接種至發(fā)酵罐，接種量：2.5-5％(以體積計(jì))，起始o(jì)d600為0.3-0.5。3、工藝參數(shù)利用10l自控發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，以機(jī)帶軟件對(duì)其進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)在線控制?？刂茀?shù)為：空氣流量按0.5-1vvm.；溶氧≥20％，以增加轉(zhuǎn)速和通氣調(diào)節(jié)；溫度37℃；ph值7.0，自動(dòng)流加飽和氨水以保持恒定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗完，即溶氧回升時(shí)開始補(bǔ)糖。補(bǔ)糖速度以控制殘?zhí)菨舛?.45g/l以下為標(biāo)準(zhǔn)。補(bǔ)糖液葡萄糖為濃度65％(w/v)，并加入2.5％葡萄糖酸鈉或6％核糖。60-72h發(fā)酵中止?？傃b液量：75-80％。4、實(shí)例(10l發(fā)酵罐)(1)菌種編號(hào)：at-047。批號(hào)：00204。(2)種子液濃度：od600為2.6。(3)基料：4l。(4)接種量200ml。(5)補(bǔ)糖速度：控制殘?zhí)菨舛?.45g/l以下。(6)補(bǔ)糖液：葡萄糖為濃度65％(w/v)并加入2.5％葡萄糖酸鈉。(7)跟蹤指標(biāo)：檢測(cè)od600、殘?zhí)呛?發(fā)酵液中殘存葡萄糖)。(8)產(chǎn)物：n-乙酰-d-氨基葡萄糖。效價(jià)：72小時(shí)135.0g/l。實(shí)施例6本實(shí)施例描述n-乙酰-d-氨基葡萄糖和d-氨基葡萄糖鹽酸鹽分離純化后處理工藝1、n-乙酰-d-氨基葡萄糖精制(1)滅活：發(fā)酵液80℃，30min。(2)固液分離：4000-8000rpm離心，棄菌渣與蛋白，取發(fā)酵液。也可以用陶瓷膜過濾。(3)脫色：產(chǎn)品：水：活性炭＝1：(1.5-3)：(0.01-0.1)，攪拌0.5-5h。(4)除鹽：電滲析除鹽。濃室罐裝入發(fā)酵液初始鹽濃度：0.01-0.05mol/l。淡室發(fā)酵液流速：40-80l/h，濃室發(fā)酵液流速：40-80l/h，單膜對(duì)的電壓0.5-1.4v。也可以采用陰、陽離子交換樹脂除鹽。(5)濃縮：將除鹽后發(fā)酵液真空條件下(0.095mpa)加熱50-80℃，濃縮8-15h，至過飽和，約4-6倍。(6)結(jié)晶：濃縮后的發(fā)酵液先25℃水降溫至25-35℃，再用0℃水降溫1-3h，至0-10℃。加無水乙醇(用量為產(chǎn)品重量5-20倍)，700-1500rpm攪拌15min-1h。(7)洗滌：加無水乙醇(與產(chǎn)品等量)攪拌10-100rpm，0.5-2h。(8)烘干：50-100℃，3-10h。純度：99.92％?？偖a(chǎn)率為91.1％。2、d-氨基葡萄糖鹽酸鹽精制(1)滅活：發(fā)酵液80℃，30min。(2)固液分離：4000-8000rpm離心，棄菌渣與蛋白，取發(fā)酵液。也可以用陶瓷膜過濾。(3)脫色：產(chǎn)品：水：活性炭＝1：(1.5-3)：(0.01-0.1)，攪拌0.5-5h。(4)除鹽：電滲析除鹽。濃室罐裝入發(fā)酵液初始鹽濃度：0.01-0.05mol/l。淡室發(fā)酵液流速：40-80l/h，濃室發(fā)酵液流速：40-80l/h，單膜對(duì)的電壓0.5-1.4v。也可以采用陰、陽離子交換樹脂除鹽。(5)濃縮：將除鹽后發(fā)酵液真空條件下(0.095mpa)加熱50-80℃，濃縮8-15h，至過飽和，約4-6倍。(6)水解：濃縮后的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入搪瓷或玻璃容器中，加入濃鹽酸(37％)至終濃度為12-16％，攪勻，70℃保溫90min。鹽酸可循環(huán)套用。(7)結(jié)晶：先25℃水降溫至25-35℃，再用0℃水降溫1-3h，至4℃。(8)洗滌：加無水乙醇(與產(chǎn)品等量)攪拌10-100rpm，0.5-2h。離心700-1500rpm，15-60min，得氨基葡萄糖鹽酸鹽，轉(zhuǎn)化率為89.6％。(9)溶解：洗滌后的產(chǎn)品溶于水中，水用量約為原發(fā)酵液體積。(10)脫色：加入活性炭(用量為1％)?；旌?0分鐘后。離心700-1500rpm，15-60min?；蜻^濾，得到無色濾液。(11)重結(jié)晶：在50℃與55cmhg真空中對(duì)濾液進(jìn)行真空蒸發(fā)至過飽和。加無水乙醇(用量為產(chǎn)品重量5-20倍)，700-1500rpm攪拌15min-1h。(12)洗滌：加無水乙醇(與產(chǎn)品等量)攪拌10-100rpm，0.5-2h。離心700-1500rpm，15-60min。(13)烘干：50-100℃，3-10h。純度：99.94％?？偖a(chǎn)率為84.2％。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>孫鑭<120>微生物發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖鹽的方法<150>cn201610208203.9<160>41<210>1<211>70<212>dna<213>人工序列<400>1gtaaaacgacggccagtggaagttcctatactttctagagaataggaacttcctcgtgaa60gaaggtgttg70<210>2<211>80<212>dna<213>人工序列<400>2ggaaacagctatgaccatgcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaactt60ctgttacattgcacaagata80<210>3<211>1283<212>dna<213>人工序列<400>3gtaaaacgacggccagtggaagttcctatactttctagagaataggaacttcctcgtgaa60gaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagg120gagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgc180tttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagca240aaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagt300gttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgca360atttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaag420gagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattc480cgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaa540gtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcattt600ctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaa660ccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaa720aaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaa780caatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccgggga840tcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaa900gaggcataaa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