本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因安全生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測T-NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，目前，在我國已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因作物品系進(jìn)入安全評價(jià)階段，申請商業(yè)化種植。與此同時(shí)，因轉(zhuǎn)基因作物擴(kuò)散引起的安全性問題受到了公眾的廣泛關(guān)注。為保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，落實(shí)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度、防止轉(zhuǎn)基因作物未經(jīng)安全批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)，迫切需要建立快速簡便的核酸檢測方法，用于市場監(jiān)管和例行監(jiān)測。而在轉(zhuǎn)基因檢測中，目前，常規(guī)PCR檢測方法存在操作繁瑣、成本高、單一性等問題，不能適應(yīng)現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和頻繁的貿(mào)易往來。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，與普通PCR不同，其模仿體內(nèi)復(fù)制機(jī)理，反應(yīng)不需要退火過程，整個(gè)反應(yīng)簡單快速，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。利用該方法建立的檢測技術(shù)體系，適合于大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因植物的檢測，可以極大的提高現(xiàn)場檢測效率，并為我國在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的現(xiàn)場速測方面躋身世界前列奠定良好的基礎(chǔ)。RPA方法的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。PCR引物多半是不適用的，這是因?yàn)?，RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基，引物過短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度。因此，RPA的引物設(shè)計(jì)難度較大。探針法的缺點(diǎn)則是探針設(shè)計(jì)上有難度。另外，探針法在擴(kuò)增反應(yīng)完畢后需要用熒光讀取儀器才可以完成最后的結(jié)果顯示。并且，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測顯示結(jié)果采用電泳法時(shí)，需要用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠，不僅危害操作人的健康，而且無法排除假陽性的問題，也不能進(jìn)行田間的現(xiàn)場速測，這嚴(yán)重限制了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測效率，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全管理是最大的制約。目前，國際上已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中，如水稻、玉米、油菜、大豆等種子產(chǎn)品及以此為基礎(chǔ)的深加工食品、制品，很多品系均是采用NOS作為終止子，即T-NOS，常規(guī)的檢測手段需要將被檢樣品送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測T-NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測方法，無需探針，利用生物素、地高辛和FITC分別標(biāo)記RPA正反向引物的5’端，能快速檢測被檢制品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，具有高度專一性，靈敏度高，檢測速度快，直觀性強(qiáng)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一組NOS終止子的RPA引物，包括：RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。檢測T-NOS終止子的RPA標(biāo)記引物組，其由正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地組成；其中，所述正向引物為經(jīng)生物素或地高辛對RPA引物RPA-nos-F的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：RPA-nos-F-地：5'-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-F-生：5'-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；所述反向引物為用FITC或地高辛對RPA引物RPA-nos-R的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：RPA-nos-R-FITC：5'-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'；RPA-nos-R-地：5'-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。一種檢測T-NOS終止子的RPA檢測試劑盒，其含有所述的RPA引物或所述的RPA標(biāo)記引物組。一種檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，包括以下步驟：1)提取待測樣品的DNA；2)RPA擴(kuò)增以待測樣品的DNA作為模板，將所述的RPA標(biāo)記引物組加入到RPA擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，得到雙標(biāo)記的核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測將吸附著生物素抗體及異硫氰酸熒光素(FITC)抗體的核酸檢測試紙條插入步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物中，側(cè)向?qū)游?～10分鐘，根據(jù)顯色條帶進(jìn)行判定：試紙條在檢測線和對照線處都有紫色條帶，則表示待測樣品中含有T-NOS終止子；若僅在對照線處有紫色條帶，則表示待測樣品中不含有T-NOS終止子，若對照線處均無紫色條帶，則表示無擴(kuò)增或試紙條無效。進(jìn)一步，所述的RPA反應(yīng)體系中，DNA模板的終濃度為0.5～2ng/μl，正、反向標(biāo)記引物的終濃度各為0.3～0.6μmol/L。優(yōu)選地，所述RPA反應(yīng)體系總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/L的正、反向標(biāo)記引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反應(yīng)緩沖液29.5μl，ddH2O補(bǔ)足至50μl。進(jìn)一步，步驟2)中，所述RPA擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣?6-38℃，16～20分鐘。優(yōu)選地，所述步驟2)中，RPA擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋汉銣胤磻?yīng)37℃4分鐘，取出，混合均勻，再擴(kuò)增16分鐘。本發(fā)明利用重組酶聚合酶介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)快速檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中T-NOS終止子，根據(jù)外源基因插入調(diào)控元件的DNA序列，設(shè)計(jì)了大量的RPA特異性引物，從中篩選出一組RPA引物，再利用生物素、地高辛和異硫氰酸熒光素FITC分別標(biāo)記正、反向引物的5’端后進(jìn)行RPA擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)中，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物結(jié)合在橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)具有生物素抗體的檢測線上；未雜交的異硫氰酸熒光素標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗異硫氰酸熒光素的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物；通過檢測線，結(jié)合在控制線上，可以快速有效檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及制品中是否含有T-NOS終止子。本發(fā)明僅需將試紙條插入擴(kuò)增后的反應(yīng)液中，即可肉眼判讀結(jié)果，簡潔明了，所用的側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測技術(shù)，是將正向和反向引物的5’端分別標(biāo)記上異硫氰酸熒光素(FITC)引物、生物素或地高辛，經(jīng)過RPA反應(yīng)得到雙標(biāo)記的核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，將吸附著生物素抗體及異硫氰酸熒光素抗體的核酸檢測試紙條插入到該擴(kuò)增產(chǎn)物中，其會(huì)與膠體金標(biāo)記的其特異性抗體相結(jié)合，在檢測線處顯示，反之，未雜交的引物會(huì)與其膠體金標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，并在對照線處顯示，肉眼可以觀察到顯示結(jié)果，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，在準(zhǔn)確性及快速檢測方面得到了顯著的提高，此檢測方法可以省去電泳的步驟，無需引入探針，也無需用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠。與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的RPA引物，具有高度專一性，用生物素、地高辛和FITC分別進(jìn)行標(biāo)記后，在RPA擴(kuò)增反應(yīng)中，無需引入探針，就能快速檢測被檢制品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，靈敏度高，檢測速度快，直觀性強(qiáng)。利用本發(fā)明的檢測方法，無需引入探針，利用雙標(biāo)記核酸產(chǎn)物檢測試紙條，僅需5～10分鐘，就可以觀察檢測結(jié)果，省去了電泳的步驟，也無需用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠，大大縮短了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，在準(zhǔn)確性及快速檢測方面得到了顯著的提高，可以對含有T-NOS終止子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行田間篩查，快速檢測T-NOS終止子的有無，大大節(jié)約了檢測成本。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中RPA標(biāo)記引物為RPA-nos-F-地和RPA-nos-R-FITC的擴(kuò)增電泳圖譜；其中，M：DL2000Marker；1：NTC；2：RRS：轉(zhuǎn)基因大豆；3：Bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；4：KF：轉(zhuǎn)基因水稻；5：KMD：轉(zhuǎn)基因水稻；6：MON531：轉(zhuǎn)基因棉花；7：MS1：轉(zhuǎn)基因油菜；8：RF1：轉(zhuǎn)基因油菜。圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中RPA標(biāo)記引物為RPA-nos-F-生和RPA-nos-R-地的擴(kuò)增電泳圖譜；其中，M：DL2000Marker；1：NTC；2：RRS：轉(zhuǎn)基因大豆；3：Bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；4：KF：轉(zhuǎn)基因水稻；5：KMD：轉(zhuǎn)基因水稻；6：MON531：轉(zhuǎn)基因棉花；7：MS1：轉(zhuǎn)基因油菜；8：RF1：轉(zhuǎn)基因油菜。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中RPA標(biāo)記引物為RPA-nos-F-生和RPA-nos-R-地的靈敏度擴(kuò)增電泳圖譜；其中，M：DL2000Marker；DNA采用RRS(轉(zhuǎn)基因大豆)不同梯度稀釋為：1：0copies；2：20copies；3：50copies；4：100copies；5：200copies；6：500copies；7：1000copies；2：2000copies。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中克隆測序結(jié)果比對結(jié)果；其中，RPA-T-NOS-F：正向引物；MS1：轉(zhuǎn)基因油菜；Bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；KF：轉(zhuǎn)基因水稻；RRS：轉(zhuǎn)基因大豆；MON531：轉(zhuǎn)基因棉花；KMD：轉(zhuǎn)基因水稻；T-NOS-V00087：T-NOS全序列；RF1：轉(zhuǎn)基因油菜；RPA-T-NOS-F：反向引物。圖5-6為本發(fā)明實(shí)施例中試紙條插入后結(jié)果顯示結(jié)果；其中，NTC：空白對照；RRS：轉(zhuǎn)基因大豆；Bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；KF：轉(zhuǎn)基因水稻；KMD：轉(zhuǎn)基因水稻；MON531：轉(zhuǎn)基因棉花；MS1：轉(zhuǎn)基因油菜；RF1：轉(zhuǎn)基因油菜。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1一種檢測T-NOS終止子的RPA引物的獲得通過查閱文獻(xiàn)和用BLAST軟件分析，以10ng/μL的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系作為模板進(jìn)行優(yōu)化篩選，篩選出T-NOS終止子的基因核酸序列，并進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選。在RPA引物設(shè)計(jì)時(shí)考慮到以下幾個(gè)要點(diǎn)：(1)引物長度的選擇RPA引物的長度一般為30至35個(gè)核苷酸；(2)引物GC含量在40％～60％之間，堿基隨機(jī)分布，5'端的3-5個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥嘌呤；(3)引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免容易形成二級結(jié)構(gòu)、引物-引物互作、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列，減少引物二聚體的形成；(4)設(shè)計(jì)引物時(shí)盡量選擇在終止子的構(gòu)建特異性內(nèi)部，以增加篩選元件的通用性。篩選后得到一對RPA引物，具體序列如下：RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。實(shí)施例2一種檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法驗(yàn)證以常見的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大豆、玉米、棉花、水稻、油菜等作為對象，進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)，并利用試紙條進(jìn)行了檢測，以電泳法為對比進(jìn)行驗(yàn)證。1)分別提取待測樣品DNA(RRS：轉(zhuǎn)基因大豆；Bt11：轉(zhuǎn)基因玉米；4：KF：轉(zhuǎn)基因水稻；5：KMD：轉(zhuǎn)基因水稻；6：MON531：轉(zhuǎn)基因棉花；7：MS1：轉(zhuǎn)基因油菜；8：RF1：轉(zhuǎn)基因油菜)；2)標(biāo)記RPA引物對實(shí)施例1中獲得的RPA引物，分別在5’端進(jìn)行生物素、地高辛和FITC標(biāo)記，具體如表1。表1引物名稱引物序列RPA-nos-F-地5’-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3’RPA-nos-R-FITC5’-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3’RPA-nos-F-生5’-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3’RPA-nos-R-地5’-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3’3)恒溫?cái)U(kuò)增將表1中引物利用TwistDx公司開發(fā)的RPA試劑盒進(jìn)行重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μl，濃度為10μmol/L的正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC(或正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC、或正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地)各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反應(yīng)緩沖液29.5μl，ddH2O加入11.2μl補(bǔ)足至總體積50μl。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間分兩部分：放入PCR儀器或恒溫?cái)U(kuò)增儀中反應(yīng)4分鐘，拿出上下顛倒10次，再擴(kuò)增16分鐘。4)產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測通過兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證：(1)電泳法：將步驟3)的等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物按照TwistDx公司試劑盒說明進(jìn)行酚氯仿純化后電泳分析，電泳圖譜如圖1-2所示，圖1-2中，有擴(kuò)增條帶則為含有T-NOS終止子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，反之，無條帶則表示該產(chǎn)品為不含有T-NOS終止子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。對引物進(jìn)行靈敏度擴(kuò)增驗(yàn)證，將含有目的條帶的片段克隆至質(zhì)粒上，以質(zhì)粒為模板，在2×103拷貝—20拷貝之間設(shè)7個(gè)梯度進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證，結(jié)果參見圖3，由圖3可知，50拷貝以上可以擴(kuò)增出條帶，20拷貝則無擴(kuò)增。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序后，比對結(jié)果如圖4所示，由圖4可以表明，擴(kuò)增產(chǎn)物均為T-NOS終止子。(2)試紙條法：將固定有生物素抗體和異硫氰酸熒光素抗體的雙標(biāo)記核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試紙條插入到步驟3)的擴(kuò)增反應(yīng)體系中，5-10分鐘內(nèi)，顯示結(jié)果。檢測試紙條同時(shí)在檢測線和對照線處都有條帶，則表示該產(chǎn)品為含有T-NOS終止子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，反之，僅在對照線處有條帶，則表示該產(chǎn)品為不含有T-NOS終止子的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，若檢測線和對照線處均無條帶，則表示無擴(kuò)增或試紙條無效，具體如圖5-6。由圖5-6可以看出，利用本發(fā)明的RPA方法，準(zhǔn)確度高，與電泳法結(jié)果相吻合，彌補(bǔ)了電泳法的不足，應(yīng)用性更加廣泛。當(dāng)前第1頁1 2 3