專利名稱：以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，特別是一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前乳酸菌表達載體應(yīng)用較多的是質(zhì)粒pMG36e，為組成型表達載體，由強啟動子 P32及其下游的部分開放閱讀框、多克隆位點和來自乳酸乳菌乳脂亞種蛋白酶基因(prtP) 的轉(zhuǎn)錄終止子、以及pWVOl復(fù)制子和來自于質(zhì)粒pE194的紅毒素抗性基因Emr構(gòu)成,質(zhì)粒大小為3.6kb。該質(zhì)粒便于宿主攜帶，可組成型表達外源目的基因。目前已在乳球菌屬 (Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等中成功表達多種外源基因。但由于該質(zhì)粒以紅霉素抗性基因作為篩選標志，在人體中不能以抗生素作為選擇壓力。在沒有了選擇壓力的情況下，質(zhì)粒載體易丟失，從而不能實現(xiàn)外源抗原基因的長期穩(wěn)定表達，限制了它在食品及醫(yī)藥工業(yè)方面的實際應(yīng)用。因此，研發(fā)以食品級選擇標記取代抗生素抗性標記載體，構(gòu)建對人體和環(huán)境安全的食品級活載體成為疫苗、食品、藥品應(yīng)用研究方面的熱點。乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種低聚肽，能夠抑制大多數(shù)革蘭氏陽性和陰性細菌的生長。目前已對Nisin的安全性問題進行了系統(tǒng)的研究。人類大腸中存在產(chǎn)Nisin的益生菌乳酸鏈球菌菌株，天然牛奶及乳酪和酸奶中也存在Nisin的乳酸鏈球菌菌株。Nisin廣泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中，它隨著食品被人們攝入，不改變腸道正常菌群，沒發(fā)現(xiàn)毒性問題，是一種安全的天然產(chǎn)物。FA0/WH0食品添加劑聯(lián)合專家委員會、美國FDA、我國衛(wèi)生部等50多個國家及地區(qū)已批準Nisin應(yīng)用于食品。因此利用Nisin 為誘導(dǎo)物的表達調(diào)控系統(tǒng)，構(gòu)建以Nisin為選擇標記的乳酸菌食品級質(zhì)粒載體，依靠人類大腸中天然存在產(chǎn)Nisin的益生菌乳酸鏈球菌產(chǎn)生的Nisin作為選擇壓力，可以實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達目的抗原蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，是用來自乳酸菌載體PNZ9530的Nisin元件替換乳酸菌質(zhì)粒pMG36e紅霉素抗性基因作為選擇標記，通過PCR擴增、基因克隆、合成多克隆位點 MCS、加入嗜酸乳桿菌信號肽Ins、消除抗性基因Emr來實現(xiàn)Nisin食品級表達/分泌型載體 PMN-5的構(gòu)建。本發(fā)明的一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟
(1)以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI；
(2)將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；(3)PCR擴增啟動子元件Pins，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins片段中插入Hpa I酶切位點；
(4)將步驟(3)獲得的Pinsl片段插入骨架載體PMN-I中，得到載體PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；
(6)合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟(5)獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS 后，得到載體PMN-4 ；
(7)利用步驟(3)添加的HpaI酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建。所述Nisin元件來自于人類大腸中天然存在產(chǎn)Nisin的益生菌乳酸鏈球菌。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是
(1)本發(fā)明的以食品級選擇標記取代了抗生素抗性標記載體，所構(gòu)建出來的食品級表達/分泌載體PMN-5為食品級活載體，對人體和環(huán)境安全系數(shù)高，可廣泛應(yīng)用于疫苗、食品、 藥品的應(yīng)用研究；
(2)本發(fā)明是依靠人類大腸中天然存在產(chǎn)Nisin的益生菌乳酸鏈球菌所產(chǎn)生的Nisin 作為選擇壓力，質(zhì)粒載體不易丟失，可實現(xiàn)外源抗原基因的長期穩(wěn)定表達，實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達目的抗原蛋白；
(3)本發(fā)明的構(gòu)建方法相較于過去繁瑣耗時的構(gòu)建方法，簡化了乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，且該方法的可操作性強。


圖I為本發(fā)明所述以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建技術(shù)路線圖。圖2為實施例2中基于Nisin系統(tǒng)的食品級重組幽門螺桿菌二價嗜酸乳桿菌活疫苗的研制路線圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實施例I 采用本發(fā)明方法，按下列步驟構(gòu)建一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒
(1)以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI；
(2)將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；
(3)PCR擴增啟動子元件Pinsl，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins片段中插入 Hpa I酶切位點；
(4)將步驟(3)獲得的Pinsl片段插入骨架載體PMN-I中，得到載體PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；
(6)合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟(5)獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS 后，得到載體PMN-4 ；
(7)利用步驟(3)添加的HpaI酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建。實施例2 結(jié)合本發(fā)明方法，按照下列步驟實現(xiàn)基于Nisin系統(tǒng)的食品級重組幽門螺桿菌二價嗜酸乳桿菌活疫苗的研制。I、食品級表達/分泌型載體PMN-5中的構(gòu)建
(1)以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI；
(2)將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；
(3)PCR擴增啟動子元件Pinsl，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins片段中插入 Hpa I酶切位點；
(4)將步驟(3)獲得的Pinsl片段插入骨架載體PMN-I中，得到載體PMN-2；
(5)合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；
(6)合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟(5)獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS 后，得到載體PMN-4 ；
(7)利用步驟(3)添加的HpaI酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建。2、基于Nisin系統(tǒng)的食品級重組幽門螺桿菌二價嗜酸乳桿菌活疫苗的研制
(1)通過PCR擴增分別獲得幽門螺桿菌(Hp)黏附素hp0410和尿素酶UrbB基因(抗原表位區(qū)域)，T_A克隆,測序，中間添加柔性肽Gly* Gly* Gly* Gly*Ser*Ser*Ser*Ser*Ser片段鏈接，完成Hp黏附素hp0410和尿素酶UrbB基因的融合，加入信號肽，獲得融合基因。將融合基因克隆入食品級表達/分泌型載體PMN-5中(如圖2所示)，通過Nisin天然抗性篩選，進行表達量的分析與密碼子偏好性的優(yōu)化；
(2)將篩選出的PMN5-ureB-hp0410電轉(zhuǎn)化至嗜酸乳桿菌ATCC4356，構(gòu)建高效表達黏附素Hp0410和UreB的二價天然抗性食品級重組嗜酸乳桿菌ATCC4356 (PMN5_ureB_ hp0410)活載體疫苗；
(3 )采用橋聯(lián)法ELISA測定食品級二價重組嗜酸乳桿菌ATCC4356 (PMN5_ureB_ hp0410)培養(yǎng)上清液和裂解上清液中UreB和黏附素hp0410的抗原性，參照Meacock敘述的方法及重組菌的生長曲線的測定來確定重組菌株的穩(wěn)定性，通過C57BL/6小鼠口服測定半致死量來確定重組菌的安全性；
(4)建立Hp感染SPF級雌性C57BL/6小鼠模型，在該模型中評價重組二價Hp嗜酸乳桿菌預(yù)防Hp感染的效果，運用細菌培養(yǎng)法和病理組織法觀察小鼠胃黏膜的完全保護率及定植量的改變，流式細胞術(shù)分析小鼠脾細胞亞型變化情況，IL2和IL4細胞依賴株的細胞測活法檢測細胞因子，ELISA法檢測小鼠血清及腸液中抗UreB和hp0410的抗體產(chǎn)生情況，探討重組嗜酸乳桿菌ATCC4356 (PMN5-ureB- hp0410)可能的免疫防治機制。
權(quán)利要求
1.一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于是用來自乳酸菌載體PNZ9530的Nisin元件替換乳酸菌質(zhì)粒pMG36e紅霉素抗性基因作為選擇標記，通過PCR擴增、基因克隆、合成多克隆位點MCS、加入嗜酸乳桿菌信號肽Ins、消除抗性基因Emr來實現(xiàn)Nisin食品級表達/分泌型載體PMN-5的構(gòu)建。
2.一種如權(quán)利要求I所述的以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于其構(gòu)建方法包括以下步驟Cl)以pNZ9530為模板PCR擴增Nisin元件，在其2端插入酶切位點SphI與SacI ；(2)將上述步驟擴增得到的Nisin元件插入骨架載體pMG36e；(3)PCR擴增啟動子元件Pins，于其2端加入酶切位點EaRI，并于Pins片段中插入Hpa I酶切位點；(4)將步驟(3)獲得的Pinsl片段插入骨架載體PMN-I中，得到載體PMN-2；(5)合成小片段多克隆位點MCS，并插入載體PMN-2中，得到載體PMN-3；(6)合成嗜酸乳桿菌信號肽Ins，并將其插入步驟(5)獲得載體PMN-3至多克隆位點MCS 后，得到載體PMN-4 ；(7)利用步驟(3)添加的HpaI酶切位點消除載體PMN-4的抗性基因Emr，獲得食品級表達/分泌載體PMN-5，完成以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建。
3.如權(quán)利要求I或2所述的以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于所述Nisin元件來自于人類大腸中天然存在產(chǎn)Nisin的益生菌乳酸鏈球菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以Nisin作為天然抗性篩選標記的乳酸菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的構(gòu)建方法是用來自乳酸菌載體pNZ9530的Nisin元件替換乳酸菌質(zhì)粒pMG36e紅霉素抗性基因作為選擇標記，通過PCR擴增、基因克隆、合成多克隆位點、加入嗜酸乳桿菌信號肽、消除抗性基因來實現(xiàn)Nisin食品級表達/分泌型載體的構(gòu)建。本發(fā)明是以食品級選擇標記取代了抗生素抗性標記載體，所構(gòu)建的食品級表達/分泌載體為食品級活載體，對人體和環(huán)境安全系數(shù)高，可廣泛應(yīng)用于疫苗、食品、藥品的應(yīng)用研究，本發(fā)明構(gòu)建方法可實現(xiàn)外源抗原基因的長期穩(wěn)定表達，獲得長期穩(wěn)定表達目的抗原蛋白，且方法簡單、可操作性強。
文檔編號C12N15/64GK102586314SQ20121003351
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者白楊, 范宏英, 龍北國 申請人:白楊, 范宏英, 龍北國