專利名稱：大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大腸埃希菌(Escherichia coli,EC0)中耐消毒劑mdfA基因攜帶情況的檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)可分5類ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族(ATP-binding cassette family, ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily, MFS)、藥物與代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體超家方矣(the much larger drug/metabolite transporter superfamily, DMT)及與之相關(guān)的小多藥外排家族(the small multi drug resistance family, SMR)、多藥物與毒物外排家族(the multi drug and toxic compound extrusion family, MATE)、 耐受-生節(jié)-分裂家族(the resistance-nodulation-division family, RND)。ABC 為能量泵，其余為質(zhì)子泵。質(zhì)子泵為細(xì)菌通過質(zhì)子稱聯(lián)交換產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動力(proton motive force, PMF)介導(dǎo)的次級藥物(化合物)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。細(xì)菌通過此類基因表達(dá)對多種化合物 (含消毒劑、滅菌劑)的耐藥。mdfA編碼超廣譜外排泵基因，能外排溴化乙錠、結(jié)晶紫、普魯黃和羅丹明等多種抗菌染料。目前檢測mdfA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性；測序是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但測序技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長、容易污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供大腸埃希菌中耐消毒劑mdfA基因攜帶情況的PCR檢測引物及使用該引物的檢測方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，其特征在于，包括(A) · mdfA 基因正向引物5' -ttccctctctgtctggtgct-31 ；(B) · mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。本發(fā)明還提供了一種大腸埃希菌中mdfA基因的檢測方法，其特征在于，采用上述大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶mdfA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列，構(gòu)建攜帶mdfA基因的重組質(zhì)粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的mdfA基因檢測探針溶液；mdfA基因正向引物的序列為5 ' -tccctctctgtctggtgct-3 ' , mdfA基因反向引物的序列為5' -ccagcagccattgtaaaaa-3 ' , mdfA基因檢測探針的序列為 FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ ；
第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的mdfA基因正向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因反向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因檢測探針溶液O. Ι-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品O. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ;在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在 80-100。。保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 O. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶mdfA基因。本發(fā)明是對大腸埃希菌中是否還有耐消毒劑mdfA基因的檢測，細(xì)菌一旦獲得此基因即可對現(xiàn)用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細(xì)菌中mdfA基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監(jiān)控，防止菌株繼續(xù)流行，同時(shí)從科研角度對其耐藥機(jī)理的進(jìn)一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發(fā)。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測率高、可重復(fù)性強(qiáng)，檢測速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品， 使結(jié)果判讀更直觀。


圖I為攜帶mdfA基因的陽性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖2為Realdme PCR陰性對照品的Realtime PCR曲線圖；圖3為攜帶mdfA基因檢測樣品的Realtime PCR曲線圖；圖4為mdfA基因檢測樣品的瓊脂糖凝I父電泳圖；圖5為mdfA基因檢測樣品的測序圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I、采用固相亞磷酰胺三酯法制備一組用于檢測大腸埃希菌中mdfA基因攜帶情況的引物，包括mdfA 基因正向引物5' -tccctctctgtctggtgct-31 ；mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。2、一種大腸埃希菌中mdfA基因攜帶情況的檢測方法，具體步驟為(I)取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，用高品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至30ul(濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌株(保藏單位中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號ATCC:+ Kumber: 25922),高溫滅活，用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至 30ul (濃度10ng/ul)，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列(由上海生工合成)，構(gòu)建攜帶 mdfA基因的重組質(zhì)粒,稀釋至30ul (濃度10ng/ul),為陽性對照品。(2)根據(jù)mdfA基因的保守區(qū)域，采用ABI Primer Express 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成引物及Taqman探針，探針序列一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無菌水配制濃度為lOumol/L的mdfA基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的mdfA基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的mdfA基因檢測探針溶液，其中，引物和檢測探針序列如下mdfA 基因正向引物5' -tccctctctgtctggtgct-31 ；mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'；mdfA 基因檢測探針FAM_tggcgggcgggatg-MGBNFQ。⑶在每一個(gè)PCR 反應(yīng)孔中加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生產(chǎn)的 Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10 XPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，mdfA基因正向引物溶液0. 5ul，mdfA基因反向引物溶液0. 5ul，mdfA基因檢測探針溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入步驟(I)得到的檢測樣品、陰性對照品或陽性對照品0. 5ul，最后用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul。在ABI7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，再運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在95°C保溫15秒，再在60°C保溫I分鐘；(4)用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，如圖I所示，為陽性對照品的Realtime PCR曲線，呈S形。如圖2所示,為陰性對照品的Realtime PCR曲線，為非S形。如圖3所示,為檢測樣品的Realtime PCR曲線，呈S形。得出判斷，該樣品為攜帶mdfA基因菌株。攜帶mdfA基因菌株可使多種消毒劑如溴化乙錠、結(jié)晶紫、普魯黃和羅丹明等的 MIC值幾倍或幾十倍的升高，對消毒劑表現(xiàn)為耐受。利用本發(fā)明對超過100例大腸埃希菌樣本的檢測結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進(jìn)行的 mdfA基因攜帶情況檢出率可達(dá)99%以上，可重復(fù)性達(dá)到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率約70%，如圖4所示，為mdfA基因檢測樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；本發(fā)明與直接測序法相比，結(jié)果一致性可達(dá)到99. 5%以上，如圖5所示，為mdfA基因檢測樣品的測序圖。
權(quán)利要求
1.大腸埃希菌中HidfA基因的檢測引物，其特征在于，包括(A)· mdfA 基因正向引物5' -ttccctctctgtctggtgct-31 ；(B)· mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。
2.一種大腸埃希菌中mdfA基因的檢測方法，其特征在于，采用權(quán)利要求I所述的大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶mdfA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列，構(gòu)建攜帶mdfA基因的重組質(zhì)粒為陽性對照品；第二步用無菌水配制濃度為5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，濃度為5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及濃度為5-15umol/L的mdfA基因檢測探針溶液；mdfA基因正向引物的序列為5 ' -ttccctctctgtctggtgct-3 ' , mdfA基因反向引物的序列為5 ' -cccagcagccattgtaaaaa-3 1 , mdfA基因檢測探針的序列為 FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 mdfA基因正向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因反向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因檢測探針溶液O. Ι-lul，然后在不同的PCR反應(yīng)孔中分別加入第一步得到的檢測樣品、陰性對照品及陽性對照品O. Ι-lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ;在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40-60°C保溫1-3分鐘，80-10(TC保溫1_3分鐘，再運(yùn)行30-50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在 80-100。。保溫 10-20 秒，再在 50-70°C保溫 O. 5-1. 5 分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶mdfA基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物及使用該引物的檢測方法。所述的大腸埃希菌中mdfA基因的檢測引物其特征在于，包括mdfA基因正向引物；5′-ttccctctctgtctggtgct-3′；mdfA基因反向引物5′-ccagcagccattgtaaaaa-3′。檢測方法為取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為大腸埃希菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶mdfA基因的大腸埃希菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成mdfA序列，構(gòu)建攜帶mdfA基因的重組質(zhì)粒為陽性對照品；分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明檢測率高、可重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號C12R1/19GK102605053SQ20121003313
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者傅詠南, 張奕, 王校 申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司