專利名稱：4個聾病易感基因聯(lián)合檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時檢測4個聾病易感基因熒光檢測試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界范圍內(nèi)對聽力語言殘疾者進(jìn)行的致病因素研究表明，約60-80%患者的病因與遺傳因素有關(guān)，其中發(fā)達(dá)國家的臨床研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾在耳聾患者中約占80%。 因此近十幾年來，遺傳性耳聾的發(fā)病機制及其分子流行病學(xué)的研究成為了聾病研究最重要的內(nèi)容之一。隨著人類基因組計劃完成，聾病基因的定位和克隆取得了巨大的進(jìn)步，聾病的分子遺傳學(xué)研究和分子流行病學(xué)的數(shù)據(jù)使研究者們逐步認(rèn)識到聾病易感基因突變在維護聽力健康和發(fā)現(xiàn)聽力異常中的重要性。
在目前已經(jīng)定位和克隆的耳聾相關(guān)基因中，GJB2是最常見的易感基因，在先天性重度耳聾患者中約占30-50%。目前，在該基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種突變類型，然而，不同種族GJB2基因常見的突變形式不同。在中國常見的突變形式為235delC，其在所有致病性突變中約占74. 14%，約22. 2%的中國耳聾患者與該突變有關(guān)。
藥物的耳毒性是導(dǎo)致語前聽力損失的一個重要因素，部分與線粒體12S rRNA基因1555A> G突變有關(guān)，該突變可以增加耳蝸對氨基糖甙類藥物的敏感性。在美國，耳毒性藥物相關(guān)的聽力損失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A > G突變，美國語前聽力損失患者中，1555A > G突變患者的發(fā)病率約為1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因 1555A > G突變與15-20%的家族性非綜合征型聽力損失有關(guān)，許多年老的家族成員即使沒有使用氨基糖甙類藥物也可發(fā)生因此突變導(dǎo)致的聽力下降。而在中國，藥物性耳聾的發(fā)病率超出了原有的想象，在一系列的文章報道中，發(fā)現(xiàn)在門診散發(fā)的耳聾患者中，約5%的患者是由于12S rRNA基因1555A > G突變導(dǎo)致的，而在聾啞學(xué)校這樣一個特殊群體，則高達(dá) 12%的患者是由于12SrRNA基因1555A > G突變接觸氨基糖甙類藥物而致聾。同時在中國群體中還發(fā)現(xiàn)了 12S rRNA基因1494C > T突變與藥物性耳聾的關(guān)系，目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三個大的家系是由于1494C > T突變導(dǎo)致的。1555A > G突變和1494C > T突變者在出生時往往聽力正常，很難通過聽力篩查而被提前發(fā)現(xiàn)和預(yù)測，卻存在因耳毒性藥物的使用而發(fā)生聽力損失的隱患。
SLC26A4基因與弧立的大前庭水管綜合征及Pendred綜合征(前庭水管擴大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫)的關(guān)系密切，臨床上表現(xiàn)為先天性或后天性耳聾，耳聾發(fā)生或加重與外傷、感冒有關(guān)。通過顳骨CT掃描可以得出結(jié)論，但目前由于設(shè)備和專業(yè)人員的限制，中國大部分地區(qū)的醫(yī)院不能進(jìn)行高分辨率的顳骨CT掃描，導(dǎo)致許多地區(qū)無法診斷大前庭水管綜合征。通過對SLC26A4基因的檢測，則可以在全國范圍內(nèi)實現(xiàn)對80 %以上大前庭水管綜合征的準(zhǔn)確診斷，并先于CT檢查發(fā)現(xiàn)和確診大前庭水管綜合征，這一方法可以避免放射線檢查的輻射問題，更易為患者家屬接受，并且由于基因診斷操作能夠批量進(jìn)行， 可以在大標(biāo)本范圍內(nèi)進(jìn)行篩查。大量研究表明，存在于中國人群突變熱點區(qū)域為SL(^6A4基因外顯子8的側(cè)翼序列的IVS7-2A > G0
目前常用的基因檢測方法有直接測序(direct sequencing，DS)、連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、變個生高效液才目色 i普分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。這些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁瑣、結(jié)果不易判讀、重復(fù)性差、假陰性假陽性多等問題。
采用熒光標(biāo)記技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、多重PCR復(fù)合擴增，通過帶不同熒光標(biāo)記物的多對引物同時對 GJB22!35delC、12S rRNA 1555A > G 突變、1494C > T 突變、IVS7-2A > G 特異性的擴增，并在這些引物中摻入核酸類似物以提高引物的Tm值，進(jìn)一步增強引物的特異性，而后經(jīng)毛細(xì)管電泳后分析PCR產(chǎn)物出峰情況，即可實現(xiàn)對這4個耳聾基因位點的同時檢測。該方法靈敏度高、判讀清晰準(zhǔn)確、采樣方便，并能實現(xiàn)一次性獲得4個關(guān)鍵位點診斷結(jié)果的高通量篩查流程，大大節(jié)約了人力物力和時間、防止多步操作而產(chǎn)生污染。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種同時檢測4個聾病易感基因GJB2235delC、12S rRNA 1555A > G突變、1494C > T突變、IVS7-2A > G及Amelogenin基因座熒光檢測試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案一種同時檢測4個聾病易感基因熒光檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增試劑和擴增后的基因分型用試劑；
所述擴增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，5對引物混合物以及超純水；
所述擴增后試劑包括內(nèi)標(biāo)R0X-300和用于基因分型的各基因突變位點對應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物；
使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴增反應(yīng)的條件PCR擴增體系的pH值為 8. 0-9. 0，鎂離子濃度為1.5-3. 5mM，4種dNTP的終濃度各為200-300μΜ，Taq酶的用量為 0. 1-0. 4U/ μ L，5對引物混合物中的單對引物終濃度為0. 2-0. 4 μ M0
使用所述試劑盒進(jìn)行PCR擴增時，擴增階段反應(yīng)在一個復(fù)合擴增反應(yīng)體系中同時擴增 GJB2235delC、12S rRNA 1555A > G 突變、1494C > T 突變、IVS7-2A > G 及 Amelogenin 基因座。
用于GJB22;35delC檢測的引物為
SEQ NO. 1 :5，-CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3，
SEQ N0. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，
用于12S rRNA 1555A > G突變檢測的引物為
SEQ N0. 3 5' -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3，
SEQ NO. 4 5，-G T ACGCATTTATATAGAGTAGC-3，
用于12S rRNA 1494C > T突變檢測的引物為
SEQ N0. 5 5' -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3，
SEQ N0. 6 :5，-G A CACACCGCCCGTCTCT-3，
用于IVS7-2A > G檢測的引物為
SEQ N0. 7 5' -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3，
SEQ NO. 8 5' -QT TTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3，
其中LNA核苷以黑體字表示。
用于Amelogenin基因座檢測的引物為
SEQ NO. 9 :5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，
SEQ NO. 10 :5，-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
所述的5對引物，其中每對引物中有一條引物的5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記，所用的熒光染料為不同的熒光素。
所述復(fù)合擴增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
其中所檢測的人基因組DNA為使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法對來源樣本進(jìn)行處理得到的DNA ；所述的來源樣本為來源于人類的濾紙片血斑/ 口腔拭子樣本、FTA卡血斑/ 口腔拭子樣本、口腔拭子樣本、血液/痕、組織、羊水。
使用所述的試劑盒進(jìn)行PCR擴增時，擴增階段反應(yīng)在任何型號的PCR儀上進(jìn)行， 擴增程序:94-980C l-5min J6-32 個循環(huán)的 94_98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。
使用的帶熒光標(biāo)記并經(jīng)LNA核苷單體摻入修飾的引物，提高了引物的Tm值，縮短了引物長度，從而增加了引物的靈敏度和特異性，防止假陽性和假陰性的出現(xiàn)。
對于Amelogenin的檢出，一方面是內(nèi)參的作用指示模板DNA是否有效或濃度范圍；另一方面能有效指示是否存在PCR產(chǎn)物污染，防止因污染產(chǎn)生的假陽性。


圖1是本發(fā)明的試劑盒對12S rRNA 1494C >T突變個體血斑來源 DNA (2. 0ng/25uL體系)擴增后的分型結(jié)果；
圖2是本發(fā)明的試劑盒對GJB2235delC突變個體血斑來源DNA(0. 2ng/25uL體系) 擴增后的分型結(jié)果；
圖3是本發(fā)明的試劑盒對12S rRNA 1555A > G突變的個體血斑來源 DNA(1. 0ng/25uL體系)擴增后的分型結(jié)果；
圖4是本發(fā)明的試劑盒對IVS7-2A > G突變個體血斑來源DNA (0. 5ng/25uL體系) 擴增后的分型結(jié)果；
圖5是本發(fā)明的試劑盒對正常個體血斑來源DNA (5. 0ng/25uL體系)擴增后的分型結(jié)果；
圖6是未經(jīng)修飾的引物對同一濃度(5. 0ng/25uL體系)的正常個體血斑來源DNA 樣本的分型結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。
實施例1
本發(fā)明的試劑盒檢測突變及正常個體的DNA樣本。用于聾病易感基因SLC26A4突變熱點IVS7-2A > G檢測的引物采用藍(lán)色熒光染料標(biāo)記，GJB2235delC檢測的引物采用綠色熒光染料標(biāo)記，用于Amelogenin基因座、12S rRNA 1494C > Τ、1555A > G突變檢測的引物采用黃色熒光染料標(biāo)記，內(nèi)標(biāo)采用紅色熒光染料標(biāo)記。
1、待測樣本1000份，都已經(jīng)使用“DNA提取-PCR擴增-測序”的技術(shù)方法對各位點進(jìn)行過測序檢測。其中，IVS7-2A > G突變樣本10份，GJB2235delC突變樣本10份， 12SrRNA 1555A > G突變樣本10份，1494C > T、突變樣本1份。
2、檢材的基因組DNA提取
Chelex提取法剪下1 3mm血斑置于1. 5mL離心管中，加入SdH2O lmL，振蕩離心，棄上清液，重復(fù)步驟兩次，棄上清液，將5 % Chelex-IOO震蕩懸浮后快速用剪掉的槍頭吸取200 μ L加入離心管中，振蕩數(shù)秒，。于56°C水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒。95°C沸水浴 IOmin,輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min，上清中為提取的DNA。
3、擴增和擴增產(chǎn)物的檢測分析
3. IPCR 擴增體系
組分體積(μ )組分說明Reaction Mix10含 pH 為 8.3 的 2.5xPCR 緩沖液、7.5 mM 的 MgCl2,750 μΜ dNTP MixTaq 酶(5 U^L)0.5Primers5本發(fā)明的5組引物對C0.2uM；)模板0.2-5.OngSdH2O補足至 25.0|iL
3. 2PCR 擴增程序初始變性熱循環(huán)終延伸95 "C 5min30個循環(huán) 98"C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s60 °C 60min
4、擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上熒光檢測
由去離子甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)組成上樣混合物〔(0. 2 μ L分子量內(nèi)標(biāo))X (進(jìn)樣數(shù))+ (9. 8 μ L去離子甲酰胺)X (進(jìn)樣數(shù))〕。將10 μ L上樣混合物與1 μ L擴增產(chǎn)物或等位基因分析標(biāo)準(zhǔn)物混合，避免產(chǎn)生氣泡。95°c變性5min，冰浴5min，并盡快電泳。用遺傳分析儀檢測分析。
5、結(jié)論
使用本發(fā)明測試1000份樣本的結(jié)果和使用測序方法的結(jié)果完全一致。本發(fā)明圖例為結(jié)果舉例
圖1 :12S rRNA 1494C > T確診病例，女。1494C > T位點判讀位置(170bp)出現(xiàn)峰值3700H的檢測峰；性別判讀位置出X單峰(105bp)，峰值4000H ；G2位置(238bp)出現(xiàn)峰值8000的檢測峰。
圖2 :GJB2235delC確診病例，女。235delC位點判讀位置Q37bp)出現(xiàn)峰值400H 的檢測峰，G2位置Q38bp)出現(xiàn)峰值400H的檢測峰，性別出X單峰，峰值1400H。
圖3 :12S rRNA 1555A > G確診病例，男。1555A > G判讀位置Q25bp)出現(xiàn)峰值 1900H的檢測峰；G2位置(238bp)出現(xiàn)峰值1800H的檢測；性別出X、Y雙峰:105bp,峰值 1600H 和 lllbp，峰值 1600H。
圖4 JVS7-2A > G確診病例，女。IVS7-2A > G判讀位置(88bp)出現(xiàn)峰值1800H 的檢測峰，G2位置(238bp)出現(xiàn)峰值MOOH的檢測峰，性別判讀位置出X單峰(105bp)，峰值 2300H。
圖5 正常個體，男。各位點判讀位置不出峰，G2位置Q38bp)出現(xiàn)峰值8000H的檢測；性別出X、Y雙峰l(^bp，峰值2400H和lllbp，峰值2450H。
與測序方法相比較對同一來源的樣本的相同基因座分型結(jié)果是一致的。
實施例2
未經(jīng)修飾的引物對同一濃度(5. 0ng/25uL體系)的正常個體血斑來源DNA樣本進(jìn)行檢測。標(biāo)記引物同實施例1。用于聾病易感基因位點檢測的非標(biāo)記引物分別為實施例1 中各引物對應(yīng)的未經(jīng)LNA修飾的普通引物。
1、待測樣本同實施例1中的正常個體血斑。
2、檢材的基因組DNA提取
采用Chelex法進(jìn)行基因組DNA的提取。
3、擴增和擴增產(chǎn)物的檢測分析
3. IPCR 擴增體系
權(quán)利要求
1.4個聾病易感基因聯(lián)合檢測試劑盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其緩沖溶液、擴增各易感基因及Amelogenin基因座的引物、及內(nèi)標(biāo)和各基因突變位點對應(yīng)的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，所述鴦病易感基因位點為 GJB22!35delC，12S rRNA 1555A > G、1494C > Τ,和 IVS7-2A > G0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于 用于GJB2235delC檢測的引物為SEQ NO. 1 :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’SEQ NO. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，；用于12S rRNA 1555A > G突變檢測的引物為SEQ NO. 3 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’SEQ NO. 4 :5’ -G T ACGCATTTATATAGAGTAGC-3‘；用于12S rRNA 1494C > T突變檢測的引物為SEQ NO. 5 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3，SEQ N0.6 :5’ -G Λ CACACCGCCCGTCTCT-3‘；用于IVS7-2A > G檢測的引物為SEQ NO. 7 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’SEQ N0.8 :5， -G TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘；其中LNA核苷以斜體字表示。用于Amelogenin基因座檢測的引物為SEQ NO. 9 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，SEQ NO. 10 5' -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述GJB2235delC，12SrRNA1555A > GU494C > Τ, IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的檢測引物，每對引物中有一條引物的 5’端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述GJB2235delC、12SrRNA1555A > G、1494C> T，IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的檢測引物與內(nèi)標(biāo)采用不同的熒光染料標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述GJB2235delC，12SrRNA1555A > G、1494C > Τ, IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的復(fù)合擴增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實現(xiàn)， 采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
6.權(quán)利要求1所述試劑盒應(yīng)用于聾病易感基因GJB2235delC，12SrRNA 1555A > G突變、1494C > T，IVS7-2A > G及Amelogenin基因座檢測的方法，其特征在于通過熒光引物 PCR及毛細(xì)管電泳特異性檢測聾病易感基因及Amelogenin基因座；用于GJB2235delC檢測的引物如SEQ NO. USEQ NO. 2所示；用于12S rRNA 1555A>G突變檢測的引物為=SEQ NO. 3 和SEQ NO. 4所示；用于12S rRNA 1494C > T突變檢測的引物如SEQ NO. 5,SEQ NO. 6所示； 用于SLC26A4基因IVS7-2A > G位點突變檢測的引物為=SEQ NO. 7和SEQ NO. 8所示；用于 Amelogenin基因座檢測的引物如SEQ NO. 9.SEQN0. 10所示；所述各基因座的復(fù)合擴增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來實現(xiàn)，采用多道或單道毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時檢測4個聾病易感基因熒光檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增前試劑和擴增后試劑；所述擴增前試劑包括PCR緩沖液、MgCl2和dNTPs的反應(yīng)混合物，Taq酶，超純水，高特異性擴增GJB2235delC，12S rRNA 1555A＞G突變、1494C＞T突變、IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述擴增后試劑包括基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明首次復(fù)合采用了熒光標(biāo)記技術(shù)、LNA核苷單體摻入-引物修飾技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)實現(xiàn)對耳聾基因位點GJB2235delC、12S rRNA 1555A＞G突變、1494C＞T突變、IVS7-2A＞G的高靈敏度特異性同時檢測，大大節(jié)約了人力物力和時間、防止多步操作而產(chǎn)生污染。
文檔編號C12Q1/68GK102534030SQ201210033159
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者萬戈江, 夏子芳, 步訊, 魏宏泉 申請人:北京科聆金儀生物技術(shù)有限公司