專利名稱：使用經(jīng)標(biāo)記的抗生素鑒定抗生素耐受性的制作方法
使用經(jīng)標(biāo)記的抗生素鑒定抗生素耐受性本發(fā)明的主題為檢測微生物的抗生素耐受性的方法。常規(guī)診斷方法中的微生物表征包括確定其種，及其對抗生素的敏感性。為實(shí)現(xiàn)這 點(diǎn)，需將微生物自其環(huán)境中分離，并于選擇性環(huán)境富集，以便分離鑒定(ID)以及進(jìn)行抗生 素敏感性測試(AST)。當(dāng)前對微生物的AST/ID主要通過對其是否存在或缺少一系列生物化 學(xué)特性以及在抗生素存在下不能生長進(jìn)行鑒定而實(shí)現(xiàn)?；蚩勺詷悠分刑崛NA，使用基因擴(kuò) 增技術(shù)檢測經(jīng)合并的DNA中特定序列的存在/缺失情況。這可告知樣品中存在生物體。同 樣的，可對樣品中編碼抗生素耐受性的基因的存在情況進(jìn)行檢測。根據(jù)定義，直接自樣品中 提取DNA可從未知的細(xì)胞混合物中得到合并的DNA。僅當(dāng)自純集落提取DNA時(shí)，方可得到明 確的結(jié)果。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為最常見的基于醫(yī)院或社區(qū)感染的病 因，引發(fā)具有高發(fā)病率和高死亡率的疾病。由于甲氧西林(或類似物)被認(rèn)為是治療葡萄球 菌感染的首選，近些年，顯示對甲氧西林耐受型金黃色葡萄球菌(MRSA)的耐受的細(xì)菌株數(shù) 量的增長已成為一項(xiàng)嚴(yán)峻的臨床及流行病學(xué)問題。對該抗生素的耐受意味著對所有內(nèi) 酰胺抗生素耐受。由于上述的這些原因，準(zhǔn)確而迅速地檢測甲氧西林耐受性，對確保感染的 患者的正確的抗生素治療以及控制醫(yī)院環(huán)境中的MRSA單離物以避免其擴(kuò)散是關(guān)鍵的。MRSA株具有mecA基因，其編碼與甲氧西林及所有β -內(nèi)酰胺抗生素親和性低的經(jīng) 修飾ΡΒΡ2蛋白(ΡΒΡ2’或PBP2a)。甲氧西林耐受性的表型表達(dá)可根據(jù)金黃色葡萄球菌的生 長條件(如溫度或培養(yǎng)基滲透壓)而改變。而這可影響用于檢測甲氧西林耐受性的方法的 準(zhǔn)確度(1)。雜耐受性的細(xì)菌株可發(fā)展成為全耐受性株，且可在接受β -內(nèi)酰胺抗生素的患 者體內(nèi)被篩選，導(dǎo)致治療失敗。因此，從臨床的觀點(diǎn)看，應(yīng)將它考慮為全耐受的。已存在幾種檢測甲氧西林耐受性的方法(1，9)，包括測定最低抑菌濃度MIC (盤 擴(kuò)散、E試驗(yàn)、或肉湯稀釋)的經(jīng)典方法，使用含苯唑西林的固體培養(yǎng)基的篩選技術(shù)，以及檢 測mecA基因或其蛋白產(chǎn)物(PBP2’蛋白)的方法(3，4)。mecA基因的檢測可被作為測定甲 氧西林耐受性的參照方法(1)。但是世界上很多實(shí)驗(yàn)室并不具備所需資金，能力或有經(jīng)驗(yàn)的 工作人員來提供檢測MRSA單離物的分子試驗(yàn)。因此需將更實(shí)用的篩選方法并入常規(guī)臨床 實(shí)踐中。此外，抗生素耐受性的存在具有幾種水平的其關(guān)聯(lián)性，其全部具有臨床意義。1.存在提供耐受性的基因，如meCA、mef(E)，2.存在抑制上述耐受性機(jī)制的表型表達(dá)的阻遏物基因，如，MecA阻遏物，3.多重耐受性機(jī)制如通過核糖體結(jié)合位點(diǎn)的修飾的大環(huán)內(nèi)酯耐受性以及存在 外排機(jī)制4.通過作為表型可檢測的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控的上述耐受性機(jī)制的表達(dá)水平。當(dāng)前的培養(yǎng)技術(shù)需要離散集落的單離及隨后鑒定和耐受性測試，假定單集落源于 單個(gè)細(xì)胞，則其可由此被視為是純的。然而事實(shí)上，無法確保自病原體通常存活于生物膜群 落中的臨床樣品產(chǎn)生純集落。同樣，使用擴(kuò)增技術(shù)對來自多個(gè)細(xì)胞的核酸序列提取及擴(kuò)增， 且可因此呈現(xiàn)出假陽性的結(jié)果。僅當(dāng)在單個(gè)細(xì)胞執(zhí)行并讀取鑒定和耐受性的信息時(shí)，方可 對該侵入的病原體正確描繪。
眾多抗生素?cái)y帶有伯氨基。在技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的，如異硫氰酸熒光素(FITC)， 熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯的試劑均易與上述伯胺基反應(yīng)。隨著抗生素耐受性在社區(qū)及衛(wèi)生保健系統(tǒng)中傳播速度的不斷加快，分子生物學(xué)的 測定精度與速度顯得尤為重要。然而，這些實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性以及花費(fèi)限制了其在常規(guī)測試環(huán) 境中更廣泛的應(yīng)用?？紤]到在生物樣品中鑒定微生物及其潛在的抗生素耐受性的困難，希望可在無需 培養(yǎng)及擴(kuò)增的情況下，直接自樣品中快速識(shí)別病原體，還能檢測或排除對所選抗生素的耐 受性的存在。本發(fā)明意圖提供能在細(xì)胞水平上同時(shí)實(shí)現(xiàn)鑒定與耐受性檢測的解決方案。其減少 了試驗(yàn)的復(fù)雜性，并可對單獨(dú)的細(xì)胞均做出明確的表型判斷。該試驗(yàn)被設(shè)計(jì)為旨在減少允 許篩選程序(就例如MRSA而對新來的患者進(jìn)行篩選)的操作以及周轉(zhuǎn)時(shí)間。本發(fā)明的第一方面為用于檢測生物樣品中預(yù)定微生物的抗生素耐受性的方法。包 括下列步驟(a)提供經(jīng)記的抗生素，(b)使所述經(jīng)標(biāo)記的抗生素與含所述微生物的生物樣品在允許所述經(jīng)標(biāo)記的抗生 素與所述微生物中的其結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的條件下接觸，(c)檢測所述微生物中的所述經(jīng)標(biāo)記的抗生素，及(d)鑒定所述可檢測的標(biāo)記物的量隨著所述非耐受形式的預(yù)定微生物中的所述可 檢測標(biāo)記物的量而改變的微生物。其中步驟(d)中鑒定的微生物是對所述抗生素耐受的微生物。本方法的基本原理為如果生物體對抗生素敏感或耐受，其將顯著不同于與其耐 受性或敏感性對應(yīng)生物體。抗生素可與在細(xì)胞腔、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁或如β-內(nèi)酰胺酶的分泌 出的蛋白中任意處的其相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。依靠其耐受性機(jī)制，耐受型生物通常因與例 如核糖體或青霉素結(jié)合蛋白親和力下降，表現(xiàn)出對抗生素的親和力下降或無親和力。相反 的，如果耐受性機(jī)制為將抗生素吸收/吸附到胞外膜，耐受型生物將顯示出高度增強(qiáng)的熒 光。所述生物樣品可以是生物學(xué)來源的任何疑似含有抗生素耐受型微生物的樣品，如 臨床或食物樣品。該微生物可選自細(xì)菌、酵母及霉菌，特別是選自革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性菌。所述預(yù)定微生物優(yōu)選選自葡萄球菌(Staphylococcus)、腸球菌(Enterococcus) 以及鏈球菌(Streptococcus)。所述預(yù)定微生物更優(yōu)選選自甲氧西林耐受型葡萄球菌、萬古霉素耐受型葡萄球 菌、萬古霉素耐受型腸球菌、以及高水平氨基糖苷耐受型腸球菌。微生物可再更優(yōu)選選自金黃色葡萄球菌、甲氧西林耐受型金黃色葡萄球菌 (MRSA)、萬古霉素耐受型金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬古霉素耐受型葡萄球菌(VRS)、萬古霉 素耐受型腸球菌(VRE)、肺炎鏈球菌、藥物耐受型肺炎鏈球菌(DRSP)和氨基糖苷耐受型腸 球菌(HLAR)。步驟(a)中提供的抗生素可以為任何抗生素。所述抗生素優(yōu)選選自氨基糖苷類、 碳頭孢烯類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、單菌胺類、內(nèi)酰胺抗生素類、喹諾酮類、桿菌肽、磺胺類、四環(huán)素類、鏈陽菌素類、氯霉素、克林霉素以及林肯胺。所述抗生素更優(yōu)選選自β -內(nèi)酰胺抗生素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林肯胺以及鏈陽菌素 類。所述抗生素再更優(yōu)選選自阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、鏈 霉素、妥布霉素、氯碳頭孢、厄他培南、亞胺培南、西司他丁、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑 啉、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭 孢妥侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢磺 啶、頭孢吡肟、替考拉寧、萬古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹 桃霉素、氨曲南、阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、二氯唑西林、氟氯西 林、美洛西林、萘夫西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、桿菌肽、粘菌素、多粘菌素B、環(huán)丙沙 星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、 磺胺米隆、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶、 甲氧芐啶磺胺、磺胺甲噁唑、磺胺甲基異噁唑、地美環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán) 素、氯霉素、克林霉素、乙胺丁醇、磷霉素、呋喃唑酮、異煙胼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹羅星、 呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁 /達(dá)福普汀、利福平、大觀霉素、兩性霉素B、氟康 唑、氟嘧啶、慶大霉素、和克拉維酸。所述抗生素最優(yōu)選選自萬古霉素、甲氧西林、克林霉素、甲氧芐啶磺胺、慶大霉 素、和克拉維酸。出人意料的是，用標(biāo)記基團(tuán)修飾抗生素不阻礙抗生素與微生物中的其結(jié)合位點(diǎn)的
纟口口。優(yōu)選使用發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)對抗生素進(jìn)行標(biāo)記。許多適于本發(fā)明中的標(biāo)記基團(tuán)的熒光 團(tuán)可使用?？蛇x擇標(biāo)記基團(tuán)以適用于市場中已有濾器?？股乜墒褂萌魏慰稍谖⑸镏袡z 測到的適宜標(biāo)記基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記基團(tuán)優(yōu)選為熒光標(biāo)記基團(tuán)。標(biāo)記基團(tuán)更優(yōu)選選自熒光 素以及 Atto-495-NSI。標(biāo)記基團(tuán)可被偶聯(lián)到抗生素功能基團(tuán)。眾多抗生素帶有伯氨基。例如熒光化合 物(如異硫氰酸熒光素(FITC)、熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)可與抗生素的氨基反應(yīng)，得 到經(jīng)熒光素標(biāo)記的抗生素。其它抗生素(如克林霉素)攜帶有可與標(biāo)記基團(tuán)相偶聯(lián)的硫代 甲基。在一定條件下，克林霉素的甲基被間隔分子溫和取代而形成二硫鍵。標(biāo)記基團(tuán)可通過間隔物與抗生素連接。在技術(shù)領(lǐng)域已有很多熟知的間隔物，并且 均可使用。通過本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)，連接間隔物，緊接著連接熒光團(tuán)的許多方法 是可行的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇伯氨基基團(tuán)易于被熒光團(tuán)標(biāo)記的半胱氨酸。在 技術(shù)領(lǐng)域中熟知的具有更長碳骨架及其它反應(yīng)基團(tuán)的分子也可被選擇作為熒光團(tuán)與抗生 素物質(zhì)之間的連接物/間隔物。一系列經(jīng)連接或未連接間隔物的熒光團(tuán)修飾的抗生素列于表1。抗生素(特別是 表1中的)優(yōu)選使用熒光素或Atto-495-NSI標(biāo)記。為組合鑒定及耐受性狀態(tài)，允許經(jīng)標(biāo)記抗生素與其在步驟(b)中微生物內(nèi)結(jié)合位 點(diǎn)結(jié)合的條件，可能涉及到不被原位雜交過程抑制的結(jié)合試驗(yàn)，使單個(gè)細(xì)胞及細(xì)胞群體中 的鑒定及耐受性狀態(tài)二者的同時(shí)或陸續(xù)測定。葡萄球菌中優(yōu)選的結(jié)合位點(diǎn)為由mecA基因編碼的PBP2蛋白(青霉素結(jié)合蛋白)。在葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺抗生素的耐受性中，mecA基因編碼與甲氧西林以及所有β-內(nèi)酰 胺抗生素具有低親和力的經(jīng)修飾的ΡΒΡ2蛋白(ΡΒΡ2’或PBP2a)。因此，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí) 施方式中，微生物是MRSA株，其帶有編碼對甲氧西林及所有β -內(nèi)酰胺抗生素具有低親和 力的經(jīng)修飾ΡΒΡ2蛋白(ΡΒΡ2’或PBP2a)的mecA基因，且抗生素為β-內(nèi)酰胺抗生素。一個(gè)更優(yōu)選的應(yīng)用為確定由23s核糖體RNA中的點(diǎn)突變所致的耐受性。不同位置 的點(diǎn)突變會(huì)誘發(fā)對一系列抗生素的耐受性，所述抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類，酮內(nèi)酯類，四環(huán)素， 噻唑抗生素類，林肯胺，氯霉素，鏈陽菌素，Amecitin，茴香霉素，稀疏霉素和嘌呤霉素。各點(diǎn) 突變的詳細(xì)的效果列于表3。在23S rRNA不同位置的點(diǎn)突變可產(chǎn)生異表型。其需要一系列 寡核苷酸探針來覆蓋所有的可能性。本發(fā)明提供了經(jīng)濟(jì)而高效率的無需考慮突變位置而檢 測抗生素耐受性的方法。另一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用為對萬古霉素與金黃色葡萄球菌的固定于細(xì)胞壁肽聚糖的表 面蛋白結(jié)合情況的檢測。萬古霉素耐受型葡萄球菌以使得萬古霉素失效的程度與抗生素結(jié) 合。經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素因此將更優(yōu)選與耐受生物體相結(jié)合。在本發(fā)明中，微生物內(nèi)可檢測標(biāo)記物的量對應(yīng)于抗生素標(biāo)記基團(tuán)的信號?？蓹z測 標(biāo)記物的量可與獲自標(biāo)記基團(tuán)的信號成正比。本發(fā)明的方法包括如下步驟去除已經(jīng)從抗生素切割下的標(biāo)記基團(tuán)，或/及去除 未與微生物結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的抗生素。該步驟可提升信噪比。在本發(fā)明方法的步驟(C)中，標(biāo)記物可通過本領(lǐng)域已知的任何適宜方法檢測。對 該實(shí)驗(yàn)的讀取需要細(xì)至單個(gè)細(xì)胞的分辨率。標(biāo)記物優(yōu)選通過表面熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、 激光掃描裝置、時(shí)間分辨熒光光度法、發(fā)光檢測、同位素檢測、高頻譜成像掃描儀、表面等離 子體共振及/或其它基于evanscesence的讀取技術(shù)來檢測。在本發(fā)明方法的步驟(d)中，可檢測標(biāo)記物量的改變可以是可檢測標(biāo)記物的增加 或可檢測標(biāo)記物的減少。在本發(fā)明的方法中，待檢測的抗生素耐受性通過在步驟(a)中提 供經(jīng)標(biāo)記的抗生素來預(yù)定。表4顯示了臨床有關(guān)微生物中常見抗生素耐受性機(jī)制。從特定 的預(yù)定微生物的耐受性機(jī)制中(如表4中所示)，可以推出何種微生物/抗生素耐受性的 組合預(yù)期在抗生素耐受性細(xì)胞中顯示出升高量的可檢測標(biāo)記物，及何種組合則會(huì)顯示出降 低量的可檢測標(biāo)記物。例如，在耐受β-內(nèi)酰胺抗生素或大環(huán)內(nèi)酯類的微生物(如MSRA、 ORSA等)中預(yù)期可檢測標(biāo)記物量的減少。在VRSA中預(yù)期可檢測標(biāo)記物量的升高。由于不 同于在VRSA中的耐受性機(jī)制，在萬古霉素耐受型腸球菌中預(yù)期可檢測標(biāo)記物量的減少。更 多的細(xì)節(jié)見表4。在本發(fā)明中，非耐受形式的預(yù)定微生物可作為測定可檢測標(biāo)記物的量是否改變 (減少或增加)的參照?？蓪⒎悄褪苄问降念A(yù)定微生物加入到樣品中或以分離的制劑提供。 非耐受形式的預(yù)定微生物可攜帶至少一種其它標(biāo)記物。只要適于分辨抗生素標(biāo)記物或/及 其它存在于本發(fā)明的試驗(yàn)中的微生物，可使用本文所述的任何標(biāo)記物。非耐受形式的預(yù)定 微生物中可檢測標(biāo)記物量也可以微生物、抗生素、標(biāo)記基團(tuán)的一種或多種組合的可檢測標(biāo) 記物的量的比值或范圍的形式(例如以數(shù)據(jù)表中的形式)提供。特別是，本發(fā)明的試劑盒 可含上述非耐受形式的預(yù)定微生物或/及上述數(shù)據(jù)表。本發(fā)明的方法還使用耐受形式的預(yù)定微生物作為另一對照，或是微生物、抗生素 和標(biāo)記基團(tuán)的一種或多種組合的耐受形式的預(yù)定微生物中可檢測標(biāo)記物的量的比值或范圍的形式(例如以數(shù)據(jù)表中的形式)。耐受形式的預(yù)定微生物可攜帶至少一種其他標(biāo)記物。 只要適于分辨抗生素標(biāo)記物或/及其它存在于本發(fā)明試驗(yàn)中的微生物，可使用本文所述的 任何標(biāo)記物。特別是，本發(fā)明的試劑盒可含上述耐受形式的預(yù)定微生物或/及上述數(shù)據(jù)表。可檢測標(biāo)記物量的減少可以是非耐受形式的預(yù)定微生物中可檢測標(biāo)記物量的至 少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、或至少90%。特別是，待鑒定的微生物可為基本上未攜帶所述標(biāo)記物的微生物。可檢測標(biāo)記物量的增加可以是非耐受形式的預(yù)定微生物中可檢測標(biāo)記物量的至 少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%、至少100%、至少150%、或至少200%。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括鑒定生物樣品中的微生物。本發(fā)明中 的“鑒定”指鑒定單個(gè)微生物細(xì)胞為屬于特定的分類范疇，如種、屬、科、鋼或/及目等。鑒 定可基于形態(tài)學(xué)或/和生物化學(xué)分類進(jìn)行?？刹捎锰结榿韺ξ⑸镞M(jìn)行鑒定。優(yōu)選使用能在原位條件下與微生物中的核酸特 異性雜交的經(jīng)標(biāo)記核酸(特別是經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸)來鑒定預(yù)定微生物。所述經(jīng)標(biāo)記的寡 核苷酸長度可達(dá)50個(gè)核苷酸。更優(yōu)選使用熒光原位雜交(FISH)來對所述微生物進(jìn)行鑒定。 這些優(yōu)選以及更優(yōu)選的實(shí)施方式允許在分子水平上檢測抗生素表型，同時(shí)保持原位雜交條 件，以允許在同一細(xì)胞甚至是混合群中，通過原位雜交同時(shí)和明確鑒定，及抗生素耐受性表 型的鑒定?？扇鐚＠暾圗P 06 021 267. 7中所述應(yīng)用原位雜交規(guī)程，所述文獻(xiàn)通過引文并 入本文。與經(jīng)標(biāo)記的抗生素的溫育可在低于雜交探針的Tm的溫度下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方式中，所述溫度在約25°C和約65°C之間，在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，溫度在約35°C和 約59°C之間。在更進(jìn)一步的優(yōu)選中，溫度為約52°C。溫育時(shí)間優(yōu)選在約1分鐘和約30分 鐘之間。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行溫育約15分鐘。在溫育后，玻片可浸泡于50%乙醇 中，之后浸沒于純乙醇中。兩步驟均可進(jìn)行約1分鐘和約10分鐘之間。優(yōu)選的溫育時(shí)間在 約2分鐘和約6分鐘之間。更優(yōu)選溫育約4分鐘。玻片隨后可風(fēng)干(如置于熱板上)，而可 將細(xì)胞包埋于平衡鹽包埋培養(yǎng)基中?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適宜方法對微生物進(jìn)行檢測。對試驗(yàn)的讀取需細(xì)至單個(gè) 細(xì)胞的分別率。特別是，微生物通過表面熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、激光掃描裝置、時(shí)間分辨 熒光光度法、發(fā)光檢測、同位素檢測、高頻譜成像掃描儀、表面等離子體共振或/及其它基 于evanscesence的讀取技術(shù)進(jìn)行檢測。優(yōu)選組合原位雜交與抗生素耐受性的檢測。更優(yōu)選組合FISH與抗生素耐受性的 檢測。還優(yōu)選在本發(fā)明方法的步驟(C)中鑒定預(yù)定微生物。優(yōu)選相繼進(jìn)行對微生物的鑒定以及對微生物中經(jīng)標(biāo)記抗生素的檢測。在一個(gè)替代性優(yōu)選實(shí)施方式中，對微生物的鑒定以及對微生物中經(jīng)標(biāo)記抗生素的 檢測同時(shí)進(jìn)行。在本實(shí)施方式中，經(jīng)標(biāo)記的抗生素被加入到雜交緩沖液中。經(jīng)過溫育，如本 文所述進(jìn)行其它處理以對微生物進(jìn)行檢測。原位雜交和FISH最優(yōu)選分別與抗生素耐受性 檢測同時(shí)進(jìn)行?？蓛?yōu)選將相同的檢測方法(如表面熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀，激光掃描裝置或其它本文所述的方法)應(yīng)用于鑒定微生物以及檢測微生物中的經(jīng)標(biāo)記的抗生素。原位雜交以及酶或受體試驗(yàn)通常要求本領(lǐng)域現(xiàn)狀的各自試驗(yàn)的特殊環(huán)境。因此， 令人驚奇的可能實(shí)現(xiàn)下列各項(xiàng)1.制備具有足以允許長達(dá)50聚體的寡核苷酸穿過的尺寸的孔的原位雜交用細(xì)胞2.使膜蛋白可接近經(jīng)標(biāo)記的抗生素3.保持上述蛋白和核糖體二者的完整性，以使經(jīng)熒光團(tuán)標(biāo)記的抗生素特異性結(jié)合4.找到充足的結(jié)合位點(diǎn)以產(chǎn)生在表面熒光顯微鏡中可見的信號，特別是在同一的 條件下。優(yōu)選在本發(fā)明的方法中使用具有在預(yù)定波長范圍發(fā)射的熒光團(tuán)的寡核苷酸，及 使用另一種在波長范圍發(fā)射的熒光團(tuán)標(biāo)記的抗生素，兩種熒光團(tuán)可通過發(fā)光檢測分辨。例 如，熒光團(tuán)之一(例如熒光素)可發(fā)射綠色信號，而另一種熒光團(tuán)可發(fā)射紅色信號。經(jīng)熒光 團(tuán)修飾的抗生素的列表列于表I。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，分發(fā)明的方法包括使用原位雜交鑒定甲氧西林耐受型金 黃色葡萄球菌(MRSA)，并同時(shí)通過與經(jīng)標(biāo)記的內(nèi)酰胺抗生素結(jié)合檢測青霉素結(jié)合蛋白 2的表達(dá)。在MRSA的一個(gè)例子中，甚至可通過分析其對克林霉素或甲氧芐啶磺胺的敏感性 來區(qū)分在醫(yī)院以及在社區(qū)獲得的MRSA。獲自社區(qū)的甲氧西林耐受型金黃色葡萄球菌株保持 了其對克林霉素或?qū)籽跗S啶磺胺的敏感性。然后通過各自結(jié)合能力特征進(jìn)行區(qū)分。在另 一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法因此包括通過原位雜交對甲氧西林耐受型金黃 色葡萄球菌(MRSA)進(jìn)行鑒定，同時(shí)通過對其與經(jīng)標(biāo)記的克林霉素或甲氧芐啶磺胺結(jié)合的 各自能力，對醫(yī)院以及社區(qū)獲得的MRSA進(jìn)行區(qū)分。在另一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過原位雜交對萬古霉素耐受 型金黃色葡萄球菌(VRSA)進(jìn)行鑒定，同時(shí)檢驗(yàn)其與經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素結(jié)合的能力。在另一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過原位雜交鑒定萬古霉素耐 受型葡萄球菌(VRS)，同時(shí)檢測與經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素結(jié)合的能力。在另一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過原位雜交鑒定萬古霉素耐 受型腸球菌(VRE)，同時(shí)檢測與經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素結(jié)合的能力。在另一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括對由于分泌內(nèi)酰胺酶 (ESBL)獲得的內(nèi)酰胺抗生素耐受的檢測，其通過與經(jīng)標(biāo)記的克拉維酸結(jié)合來顯示所述 酶的存在情況；以及對革蘭氏陰性微生物的鑒定?？死S酸為內(nèi)酰胺酶抑制劑，有時(shí)與青霉素類抗生素組合，以克服某些類型 的抗生素耐受性。特別是，其用于克服分泌可使大部分青霉素失效的內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌 的耐受性。最常見將鉀鹽克拉維酸鉀與阿莫西林相組合?？死S酸是內(nèi)酰胺抗生素的 競爭性抑制劑，當(dāng)使用熒光團(tuán)對其進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，其可檢測內(nèi)酰胺酶的存在情況。在另一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括對由于分泌金屬內(nèi)酰胺酶 (MBL)所致的內(nèi)酰胺抗生素耐受性的檢測，其通過與經(jīng)標(biāo)記的亞胺培南結(jié)合來顯示所 述酶的存在情況；以及對革蘭氏陰性微生物的鑒定。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過經(jīng)標(biāo)記的紅霉素或/及 克林霉素的結(jié)合情況對大環(huán)內(nèi)酯類、林肯胺以及鏈陽菌素(MLS)的耐受性進(jìn)行檢測；以及對鏈球菌進(jìn)行鑒定。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括使用FISH對藥物耐受型肺炎 鏈球菌(DRSP)進(jìn)行鑒定；以及分別對內(nèi)酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類的耐受性進(jìn)行鑒定。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括通過FISH對高水平氨基糖苷 耐受型腸球菌(HLAR)進(jìn)行檢測；以及對經(jīng)標(biāo)記的慶大霉素進(jìn)行檢測。生物樣品包括預(yù)定微生物，并可經(jīng)預(yù)處理，以促進(jìn)經(jīng)標(biāo)記的抗生素的結(jié)合，及任選 的微生物鑒定。生物樣品可根據(jù)其指定的探針(用與檢測微生物的經(jīng)標(biāo)記的抗生素以及任選的 探針)熱固定在玻片上，例如，在約45°C 約65°C，優(yōu)選在50°C 約55°C，更優(yōu)選為52°C。如果微生物為革蘭氏陽性菌，其可被適宜的緩沖液穿孔。革蘭氏陽性細(xì)胞可使用 細(xì)菌素或/及洗滌劑穿孔。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗生素與生物學(xué)洗滌劑相組合，而在 一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，乳鏈球菌素與皂苷相結(jié)合。此外，還可使用例如溶菌酶和溶葡 萄球菌酶的裂解酶?？蓪⒘呀饷钙胶膺M(jìn)等式中。如果樣品經(jīng)乙醇處理，活性成分的濃度可 被乙醇中的后續(xù)處理平衡。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，溶菌酶、溶葡萄球菌酶、乳鏈球菌素和 皂苷被平衡以覆蓋除分枝桿菌(Mycobacteria)外的所有革蘭氏陽性生物。最優(yōu)選的革蘭氏陽性菌穿孔緩沖液的例子見表2。認(rèn)為各種量和濃度，以及應(yīng)用溫 度及溫育時(shí)間在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。如果微生物為酵母或霉菌，其可被適宜的緩沖液穿孔。令人意外的發(fā)現(xiàn)，在依照本 領(lǐng)域熟知的方法處理時(shí)，酵母及霉菌的細(xì)胞壁未形成可重現(xiàn)的微孔。這些方法頻繁地呈現(xiàn) 出假陽性及假陰性結(jié)果兩者。可靠的溶液為含有肽抗生素、洗滌劑，絡(luò)合劑和還原劑的組 合的優(yōu)選緩沖液。更優(yōu)選的緩沖液包括可產(chǎn)生特定滲透壓的一價(jià)鹽，細(xì)菌素的組合，生物 和人工洗滌劑、二價(jià)陽離子絡(luò)合劑，和能減少二硫鍵的試劑的組合。通過加入特異于原核生 物的蛋白水解酶，可得到了更令人意外的改進(jìn)。在再更優(yōu)選的緩沖液中，將皂苷、SDS、乳鏈 球菌素、EDTA、DTT與溶菌酶及鹽以例如約150mM 約250mM的濃度，更優(yōu)選為約200mM 230mM，最優(yōu)選為約215mM的濃度相組合。最優(yōu)選的酵母穿孔緩沖液的例子列于表2。認(rèn)為各種量和濃度，以及應(yīng)用溫度及溫 育在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法為診斷方法。本發(fā)明的另一方面為適用于檢測預(yù)定微生物的抗生素耐受性的試劑盒。其含(a)經(jīng)標(biāo)記的抗生素，及(b)任選的探針，其適于所述生物樣品中所述微生物的鑒定。本發(fā)明的試劑盒適用于本發(fā)明的方法。經(jīng)標(biāo)記的抗生素為本發(fā)明的方法中本文所 述的經(jīng)標(biāo)記的抗生素。探針可以是任何適用于鑒定微生物的探針。探針優(yōu)選為經(jīng)標(biāo)記的核酸，特別是經(jīng) 標(biāo)記的寡核苷酸，其能在原位條件下與微生物中的核酸進(jìn)行特異性雜交。該寡核苷酸長度 可達(dá)50個(gè)核苷酸。如以上所表述的，該試劑盒還可包含其它成分，如提供有關(guān)微生物、抗生素及標(biāo)記 物的至少一種組合中可檢測標(biāo)記物量的信息的數(shù)據(jù)表；或非耐受或/和耐受形式的預(yù)定微 生物樣品，如用作對照。
本發(fā)明的另一方面為經(jīng)標(biāo)記的抗生素用于檢測生物樣品中預(yù)定微生物的抗生素 耐受性的用途。本發(fā)明通過如下的實(shí)施例及表格進(jìn)行進(jìn)一步的描述。表1 描述了適用于本發(fā)明的方法的抗生素以及標(biāo)記的例子。表2 描述了本發(fā)明中使用的穿孔緩沖液的組成。表3 由于23S rRNA上的突變引起的抗生素耐受性。表4 微生物中的抗生素耐受性機(jī)制以及在耐受性微生物中經(jīng)標(biāo)記的抗生素量的 改變。實(shí)施方式實(shí)施方式1表1中的抗生素使用FITC進(jìn)行標(biāo)記，并按照本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行純化。通過S-S 鍵使用半胱氨酸取代與X' -S連接的甲基來修飾克林霉素。連接的半胱氨酸隨后經(jīng)N-羥 基_琥珀酰亞胺酯或FITC使用熒光胺進(jìn)行標(biāo)記，并使用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行純化。實(shí)施方式2抗生素的耐受性，如青霉素耐受性可通過以下規(guī)程進(jìn)行檢測，包括如下步驟1.將生物樣品涂布于玻片，如10 μ 12.干燥，如在 52 °C3.加入穿孔緩沖液，如10 μ 14.干燥5.加入復(fù)原的探針混合物(如9 μ 1)6.加入抗生素(如，F(xiàn)ITC-青霉素)7.溫育，如在52°C，15分鐘8. EtOH/Stop混合物(如，5O % 5O % )如，于室溫5分鐘9.乙醇，如99%乙醇5分鐘10.干燥11.平衡鹽包埋培養(yǎng)基(如，一小滴)12.讀取實(shí)施方式3表4顯示了耐受形式的臨床相關(guān)的微生物的相對于其非耐受形式的可檢測的經(jīng) 標(biāo)記的抗生素量的改變。所述量以攜帶有熒光標(biāo)記物的抗生素?zé)晒獾模ジ淖?分別減少及 增加)表示。表權(quán)利要求
用于檢測生物樣品中預(yù)定微生物的抗生素耐受性的方法，包括下列步驟(a)提供經(jīng)標(biāo)記的抗生素，(b)使所述經(jīng)標(biāo)記的抗生素與含所述微生物的生物樣品在允許所述經(jīng)標(biāo)記的抗生素與所述微生物中的其結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的條件下接觸，(c)檢測所述微生物中的所述經(jīng)標(biāo)記的抗生素，及(d)鑒定所述可檢測的標(biāo)記物的量隨著所述非耐受形式的預(yù)定微生物中的所述可檢測標(biāo)記物的量而改變的微生物，其中步驟(d)中鑒定的微生物是對所述抗生素耐受的微生物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗生素選自氨基糖苷類、碳頭孢烯類、碳青霉烯類、頭 孢菌素類、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、單菌胺類、β “內(nèi)酰胺抗生素類、喹諾酮類、桿菌肽、磺胺類、 四環(huán)素類、鏈陽菌素類、氯霉素、克林霉素、和林肯胺。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗生素經(jīng)發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)，尤其經(jīng)熒光標(biāo)記基團(tuán)標(biāo)記。
4.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)合位點(diǎn)位于細(xì)胞腔內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞壁 中，或/和分泌的蛋白中。
5.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗生素是內(nèi)酰胺抗生素。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述β-內(nèi)酰胺抗生素與ΡΒΡ2結(jié)合蛋白結(jié)合。
7.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(c)中的所述標(biāo)記物通過表面熒光顯微鏡 檢、流式細(xì)胞術(shù)、激光掃描裝置、時(shí)間分辨熒光測定、發(fā)光檢測、同位素檢測、高頻譜成像掃 描儀、表面等離子體共振或其他基于evanscesence的讀取技術(shù)檢測。
8.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)定微生物在所述生物樣品中鑒定。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述預(yù)定微生物通過能夠與所述微生物中的核酸在原位條 件下特異性雜交的經(jīng)標(biāo)記的核酸鑒定。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述預(yù)定微生物通過FISH鑒定。
11.權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)的方法，其中所述預(yù)定微生物在步驟(c)中鑒定。
12.權(quán)利要求8 11中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物的鑒定和所述微生物中所述經(jīng) 標(biāo)記的抗生素的檢測同時(shí)進(jìn)行。
13.權(quán)利要求8 12中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物通過表面熒光顯微鏡檢、流式細(xì) 胞術(shù)、激光掃描裝置、時(shí)間分辨熒光測定、發(fā)光檢測、同位素檢測、高頻譜成像掃描儀、表面 等離子體共振或其他基于evanscesence的讀取技術(shù)檢測。
14.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中微生物選自細(xì)菌，酵母和霉菌，尤其選自革 蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。
15.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是通過表2中的所述制劑革蘭氏 陽性穿孔緩沖液穿孔的革蘭氏陽性細(xì)菌。
16.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述微生物是通過表2中的所述制劑酵母穿 孔緩沖液穿孔的酵母或霉菌。
17.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)的方法，其中隨通過結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的β-內(nèi)酰胺抗生素來 檢測所述青霉素結(jié)合蛋白2的表達(dá)，同時(shí)通過原位雜交鑒定甲氧西林耐受型金黃色葡萄球 菌(MRSA)。
18.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)的方法，其中隨通過結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的克林霉素或甲氧芐啶 磺胺的各自能力區(qū)分醫(yī)院和社區(qū)獲得的MRSA，同時(shí)通過原位雜交鑒定甲氧西林耐受型金黃 色葡萄球菌(MRSA)。
19.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)的方法，其中隨結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素的能力，同時(shí)通過 原位雜交鑒定萬古霉素耐受型金黃色葡萄球菌(VRSA)。
20.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)的方法，其中隨結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素的能力，同時(shí)通過 原位雜交鑒定萬古霉素耐受型葡萄球菌(VRS)。
21.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)的方法，其中隨結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的萬古霉素的能力，同時(shí)通過 原位雜交鑒定萬古霉素耐受型腸球菌(VRE)。
22.權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)的方法，其中所述β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)分泌所致的針對 β-內(nèi)酰胺抗生素的耐受性通過以下檢測通過結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的克拉維酸揭示所述酶的存在，及 革蘭氏陰性微生物的鑒定。
23.權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)的方法，其中金屬-β -內(nèi)酰胺酶(MBL)分泌所致的針對 β-內(nèi)酰胺抗生素的耐受性通過以下檢測通過結(jié)合經(jīng)標(biāo)記的亞胺培南揭示所述酶的存在，及 革蘭氏陰性微生物的鑒定。
24.權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)的方法，其中針對大環(huán)內(nèi)酯類、林肯胺和鏈陽菌素(MLS) 的耐受性通過以下檢測經(jīng)標(biāo)記的紅霉素或/和克林霉素的結(jié)合，及 鏈球菌的鑒定。
25.權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)的方法，其中藥物耐受型肺炎鏈球菌(DRSP)通過以下鑒定FISH，及針對β -內(nèi)酰胺和大環(huán)內(nèi)酯類的各自耐受性。
26.權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)的方法，其中高水平的氨基糖苷耐受型腸球菌(HLAR)通 過FISH和經(jīng)標(biāo)記的慶大霉素檢測。
27.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其是診斷方法。
28.適于檢測預(yù)定微生物的抗生素耐受性的試劑盒，其含(a)經(jīng)標(biāo)記的抗生素、和(b)任選的探針，其適于所述生物樣品中所述微生物的鑒定。
29.經(jīng)標(biāo)記的抗生素用于檢測生物樣品中預(yù)定微生物的抗生素耐受性的用途。
全文摘要
本發(fā)明的主題為檢測微生物的抗生素耐受性的方法，其包括下列步驟使疑似微生物與經(jīng)(熒光)標(biāo)記的抗生素接觸，及觀察其和同種無耐受性的微生物之間的差異。
文檔編號G01N33/58GK101965407SQ200980107249
公開日2011年2月2日 申請日期2009年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日
發(fā)明者I·斯普敦, W·斯坦因 申請人:米阿科姆診斷有限公司