Pcr擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，包括如下步驟：以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，設(shè)計PCR引物；其中，正向PCR引物位于質(zhì)粒啟動子（目的基因?qū)?yīng)啟動子）上游，反向PCR引物位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄終止子（目的基因?qū)?yīng)終止子）下游；以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為PCR模板，通過所設(shè)計的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；回收PCR產(chǎn)物；選取PCR產(chǎn)物，按照Lonza公司核轉(zhuǎn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比，核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低懸浮動物細(xì)胞的死亡率；PaGene在保證核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率亦沒有顯著降低或降低很少。
【專利說明】PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞(非編碼小RNA、信使RNA、或者質(zhì)粒)被廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究、疫苗研究、轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究、干細(xì)胞研究、炎癥性疾病治療研究等方面；用于細(xì)胞系或者原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法可以分為兩類:一類是基于病毒的轉(zhuǎn)染方法；另一類是不基于病毒的轉(zhuǎn)染方法。對于不基于病毒的轉(zhuǎn)染方法，電轉(zhuǎn)(Electrophoration)是其中最重要的方法之一(特別是對于懸浮細(xì)胞)，電轉(zhuǎn)的基本原理是通過電擊造成細(xì)胞質(zhì)膜短暫的通透，以便于核酸能夠進(jìn)入細(xì)胞。作為電轉(zhuǎn)的升級版，核轉(zhuǎn)(Nucleofection)綜合了電擊以及細(xì)胞特異的溶液，能夠保證細(xì)胞較理想的轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞活力，特別是對于那些很難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0003]Kasum1-1細(xì)胞系是來自于一位患M2型急性髓系白血病(Acute myeloid leukemiaM2)的日本男孩的外周血，該細(xì)胞系在白血病發(fā)病機(jī)理的研究中被廣泛使用。然而，研究人員在Kasum1-1細(xì)胞的常規(guī)核轉(zhuǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)粒核轉(zhuǎn)總是會誘導(dǎo)更加嚴(yán)重的細(xì)胞死亡以及更低的轉(zhuǎn)染效率，質(zhì)粒核轉(zhuǎn)所導(dǎo)致的高死亡率有可能影響所轉(zhuǎn)染目的基因生物作用的客觀準(zhǔn)確解讀，現(xiàn)有技術(shù)中亟需一種可靠的核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的方法，以便進(jìn)行涉及Kasum1-1核轉(zhuǎn)的相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法保證了目的基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞后，能夠較客觀的觀察感興趣基因本身對懸浮動物細(xì)胞所造成的生物影響，排除了核轉(zhuǎn)質(zhì)粒后所造成的非特異細(xì)胞死亡對基因真實(shí)生物作用的掩蓋。
[0005]本發(fā)明涉及一種PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0006]步驟一，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，設(shè)計PCR引物；其中，正向PCR引物位于質(zhì)粒啟動子上游,反向PCR引物位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄終止子下游；
[0007]步驟二，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為PCR模板，通過所設(shè)計的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0008]步驟三，回收PCR產(chǎn)物，即PaGene，并定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度；
[0009]步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉(zhuǎn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，所用PaGene用與對應(yīng)質(zhì)粒相同摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)，進(jìn)而完成PaGene核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞。
[0010]優(yōu)選地，所 述目的基因可為任何編碼蛋白的基因。
[0011]優(yōu)選地，所述重組目的基因的表達(dá)質(zhì)?？蔀榉钦T導(dǎo)型表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。
[0012]優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟:[0013]懸浮動物細(xì)胞在含有適當(dāng)比例胎牛血清的懸浮動物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(E.coli)工具菌株被用于質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增；用相應(yīng)試劑盒抽提質(zhì)粒；所抽提質(zhì)粒被用于目的蛋白編碼基因的擴(kuò)增；所擴(kuò)增基因被命名為PaGene ；
[0014]所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其對應(yīng)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；正向引物位于基因啟動子上游，反向引物位于基因轉(zhuǎn)錄終止子下游；正反向引物的位置保證目的蛋白編碼基因在細(xì)胞內(nèi)能夠成功轉(zhuǎn)錄和翻譯；PaGene用相應(yīng)試劑盒純化,進(jìn)而用于核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞；
[0015]DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相應(yīng)分光光度計測定，以反應(yīng)對應(yīng)核酸的完整性和純度；PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控；
[0016]取懸浮動物細(xì)胞被用于核轉(zhuǎn)；
[0017]核轉(zhuǎn)所用溶液及程序采用Lonza公司就對應(yīng)細(xì)胞系的說明書進(jìn)行或者采用常規(guī)核轉(zhuǎn)條件；核轉(zhuǎn)后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的懸浮動物細(xì)胞完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0018]進(jìn)而完成PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞；與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比，核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低懸浮動物細(xì)胞的死亡率；PaGene在保證核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率沒有顯著降低或降低很少。
[0019]優(yōu)選地，所述懸浮動物細(xì)胞為Kasum1-1細(xì)胞、NB4細(xì)胞或THP-1細(xì)胞。
[0020]優(yōu)選地，所述PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的方法包括如下步驟:
[0021]步驟一，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，設(shè)計PCR引物；其中，正向PCR引物位于質(zhì)粒啟動 子上游,反向PCR引物位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄終止子下游；
[0022]步驟二，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為PCR模板，通過所設(shè)計的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；
[0023]步驟三，回收PCR產(chǎn)物，即PaGene，并定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度；
[0024]步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉(zhuǎn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，核轉(zhuǎn)程序?yàn)镻-19,核轉(zhuǎn)所用溶液為solution V,即kit V,所用PaGene用與對應(yīng)質(zhì)粒相同摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)，進(jìn)而完成PaGene核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞。
[0025]優(yōu)選地，步驟一中，所述目的基因?yàn)镋GFP基因或螢火蟲熒光素酶基因。
[0026]優(yōu)選地，步驟一中，所述重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為BD Biosciences的質(zhì)粒pEGFP-N2 或 Promega 的質(zhì)粒 pGL3_Control。
[0027]優(yōu)選地,步驟二中，所述DNA聚合酶為Toyobo公司的KOD Plus ；
[0028]所述引物具體為=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQID N0.4 所示。
[0029]優(yōu)選地，其特征在于，步驟四中，所用PaGene劑量以2 μ g對應(yīng)質(zhì)粒所對應(yīng)等摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)。
[0030]優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟:
[0031]Kasum1-1細(xì)胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用于質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增；用NucleoBond Xtra Midi試劑盒抽提質(zhì)粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒準(zhǔn)備空E.coli TOPlO的洗脫液；所抽提質(zhì)粒被用于EGFP和Iuciferase的擴(kuò)增；所擴(kuò)增基因分別被命名為PaEGFP和PaLuc ；
[0032]所述兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其對應(yīng)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；正向引物位于基因啟動子上游，EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Paw IE ；luciferase在pGL3-Control的啟動子為SV40啟動子；反向引物位于轉(zhuǎn)錄終止子下游，EGFP在pEGFP_N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號；正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄和翻譯；所述引物具體為:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示；
[0033]PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒純化,進(jìn)而用于核轉(zhuǎn)Kasum1-Ι細(xì)胞；
[0034]DNA 濃度以及 A260/A280 和 A260/A230，比值皆≥ 1.8，用 Nano Drop NDlOOO 分光光度計測定，以反應(yīng)對應(yīng)核酸的完整性和純度；質(zhì)粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控；
[0035]Kasum1-1細(xì)胞與10 μ M等體積的eFluor670混合，并在37°C避光孵育IOmin ;之后加入4-5倍體積預(yù)冷的RPMI1640完全培養(yǎng)基，所述RPMI1640完全培養(yǎng)基為RPMI1640+15%胎牛血清，并且冰浴5min以終止標(biāo)記，之后用RPMI1640完全培養(yǎng)基洗滌3遍，所標(biāo)記細(xì)胞被用于后續(xù)核轉(zhuǎn)；
[0036]2X IO6Kasum1-1細(xì)胞被用于核轉(zhuǎn)，所述細(xì)胞預(yù)先標(biāo)記或沒有標(biāo)記細(xì)胞增殖染料eFluor670 ；
[0037]核轉(zhuǎn)所用溶液為solution V，即kit V，程序?yàn)镻-19 ;核轉(zhuǎn)后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0038]對于PaEGFP和pEGFP_N2，每次核轉(zhuǎn)的劑量分別為680ng PaEGFP和2000ngPEGFP-N2，具有相同摩爾數(shù)；SE.coli洗脫液亦被用于核轉(zhuǎn)，以便檢測樣品中殘留的內(nèi)毒素是否對細(xì)胞有潛在的致死效果；對于PaLuc和pGL3-Control，核轉(zhuǎn)劑量分別為830ngPaLuc和2000ng pGL3_Control,相同摩爾數(shù)；與PaGene相同質(zhì)量的對應(yīng)質(zhì)粒亦被用于核轉(zhuǎn)，具體為 PEGFP-N2 680ng, pGL3_Control830ng ；
[0039]進(jìn)而完成PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞；與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比,核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低Kasum1-1細(xì)胞的死亡率,核轉(zhuǎn)PaGene的Kasum1-1細(xì)胞能夠較好增殖,PaGene在保證核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率沒有顯著降低或降低很少。
[0040]本發(fā)明具有如下的有益效果:(I)與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比，核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低懸浮動物細(xì)胞的死亡率；(2) PaGene在保證核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率亦沒有顯著降低或降低很少；本發(fā)明的方法保證了目的基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞后，能夠較客觀的觀察感興趣基因本身對懸浮動物細(xì)胞所造成的生物影響，排除了核轉(zhuǎn)質(zhì)粒后所造成的非特異細(xì)胞死亡對基因真實(shí)生物作用的掩蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯:
[0042]圖1為以質(zhì)粒為模板進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計示意圖；[0043]圖2為PaGene及其對應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
[0044]圖3為核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的細(xì)胞活力和GFP+比例結(jié)果；
[0045]圖4為核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的顯微鏡觀察結(jié)果；
[0046]圖5為通過其它方法對核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞增殖能力的檢測結(jié)果；
[0047]圖6為核轉(zhuǎn)后Kasum1-1細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的定量結(jié)果；
[0048]圖7為核轉(zhuǎn)后NB4和THP-1細(xì)胞的細(xì)胞活力和GFP+比例結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如薩姆布魯克等分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊第三版(科學(xué)出版社，2002)中所述的條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0050]實(shí)施例1、PCR擴(kuò)增基因(PaGene)核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞
[0051] 申請人:發(fā)現(xiàn)表達(dá)質(zhì)粒核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞后，導(dǎo)致Kasum1-1細(xì)胞大量死亡； 申請人:經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，意外地發(fā)現(xiàn)，采用如下方法處理后能夠顯著減少核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的死亡率、以及保持較理 想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和較高的細(xì)胞增殖，以便為后續(xù)涉及Kasum1-1細(xì)胞核轉(zhuǎn)的相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)提供可行的核轉(zhuǎn)方法；所述方法以表達(dá)質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增目的基因(PaGene);所擴(kuò)增PaGene包含基因啟動子、蛋白編碼區(qū)、以及轉(zhuǎn)錄終止子；保證PaGene能夠在細(xì)胞內(nèi)成功的轉(zhuǎn)錄和翻譯,之后用PaGene核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞。
[0052]本實(shí)施例涉及一種PaGene核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的方法,主要以增強(qiáng)型綠色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)為工具報告基因，在 Kasum1-1 細(xì)胞中進(jìn)行的核轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，具體內(nèi)容如下，以下實(shí)施例中涉及到的相關(guān)試劑及材料均可以通過公開的市售渠道獲得。
[0053]細(xì)胞系和大腸桿菌菌株
[0054]Kasum1-1細(xì)胞(能夠通過市售的公開渠道獲得)在含有15%胎牛血清(Gibco)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C、5%C02。大腸桿菌(Escherochia coli,
E.coli)菌株 T0P10 (Invitrogen-Life Technologies)被用于質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增。
[0055]質(zhì)粒和PCR 擴(kuò)增基因(PCR amplified gene, PaGene)的準(zhǔn)備
[0056]用NucleoBond Xtra Midi 試劑盒(Macherey-Nagel)抽提質(zhì)粒 pEGFP_N2 (BDBiosciences)和 pGL3_Control (Promega)0
[0057]用AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒(Axygen)準(zhǔn)備空 Ε.coli T0P10 的洗脫液(按照標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒抽提步驟。該空E.coli洗脫液中可能含有內(nèi)毒素，用以鑒定殘存的內(nèi)毒素是否在Kasum1-1細(xì)胞核轉(zhuǎn)過程中對細(xì)胞有致死作用)。所抽提質(zhì)粒被用于EGFP和螢火蟲熒光素酶基因(Firefly luciferase)的擴(kuò)增。所擴(kuò)增基因分別被命名為PaEGFP (PCR ampIiedEGFP)和 PaLuc (PCR amplified luciferase)。
[0058]具體來講，這兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus(Toyobo)和其對應(yīng)PCR引物(表1，引物合成于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物位于基因啟動子上游(EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Pcmv ie ;luciferase在pGL3_Control的啟動子為SV40啟動子)；反向引物位于轉(zhuǎn)錄終止子下游(EGFP在pEGFP-N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號)(圖1)。
[0059]圖1，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計示意圖。IH向引物位于基因啟動子上游；反向引物位于基因終止子下游。用具有校IH功能的DNA聚合酶擴(kuò)增目的基因。PaGene進(jìn)一步被純化，并被用于Kasum1-1細(xì)胞核轉(zhuǎn)(同時亦包括其對應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒的核轉(zhuǎn)比較)。表達(dá)質(zhì)粒的核轉(zhuǎn)劑暈為兩個:一個劑暈與PaGene等質(zhì)暈；另一個劑暈與PaGene等摩爾數(shù)。
[0060]正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄和翻譯。PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒(Axygen)純化,進(jìn)而用于核轉(zhuǎn)Kasum1-Ι細(xì)胞。
[0061]DNA 濃度以及 A260/A280 和 A260/A230 (比值皆大于 1.8)用 Nano Drop NDlOOO 分光光度計(Thermo Scientific)測定，以反應(yīng)對應(yīng)核酸的完整性和純度。
[0062]質(zhì)粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控(圖2)。圖2, PaGenes及其對應(yīng)表汰質(zhì)粒的掠脂糖凝膠電泳。(A),dEGFP-N2和PaEGFP的凝膠電泳。(B),DGL3_Control和PaLuc的凝膠電泳。DNA分子量參照DL2000和DL15, 000購自于Takara,對應(yīng)備帶分子量大小(堿基對，basepair,簡稱bp)標(biāo)記于電$永圖左偵!I。
[0063]表1 PaEGFP和PaLuc PCR擴(kuò)增所用的引物序列
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，設(shè)計PCR引物；其中，正向PCR引物位于質(zhì)粒啟動子上游，反向PCR引物位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄終止子下游； 步驟二，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為PCR模板，通過所設(shè)計的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶； 步驟三，回收PCR產(chǎn)物，即PaGene，并定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度； 步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉(zhuǎn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行懸浮動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染，所用PaGene用與對應(yīng)質(zhì)粒相同摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)，進(jìn)而完成PaGene核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述目的基因可為任何編碼蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述重組目的基因的表達(dá)質(zhì)?？蔀榉钦T導(dǎo)型表達(dá)蛋白的質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 懸浮動物細(xì)胞在含有適當(dāng)比例胎牛血清的懸浮動物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(E.coli)工具菌株被用于質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增；用相應(yīng)試劑盒抽提質(zhì)粒；所抽提質(zhì)粒被用于目的 蛋白編碼基因的擴(kuò)增；所擴(kuò)增基因被命名為PaGene ； 所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其對應(yīng)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；正向引物位于基因啟動子上游，反向引物位于基因轉(zhuǎn)錄終止子下游；正反向引物的位置保證目的蛋白編碼基因在細(xì)胞內(nèi)能夠成功轉(zhuǎn)錄和翻譯；PaGene用相應(yīng)試劑盒純化,進(jìn)而用于核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞； DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相應(yīng)分光光度計測定，以反應(yīng)對應(yīng)核酸的完整性和純度；PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控； 取懸浮動物細(xì)胞被用于核轉(zhuǎn)； 核轉(zhuǎn)所用溶液及程序采用Lonza公司就對應(yīng)細(xì)胞系的說明書進(jìn)行或者采用常規(guī)核轉(zhuǎn)條件；核轉(zhuǎn)后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的懸浮動物細(xì)胞完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)； 進(jìn)而完成PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞；與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比，核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低懸浮動物細(xì)胞的死亡率；PaGene在保證核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率沒有顯著降低或降低很少。
5.如權(quán)利要求1所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述懸浮動物細(xì)胞為Kasum1-1細(xì)胞、NB4細(xì)胞或THP-1細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞的方法包括如下步驟: 步驟一，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，設(shè)計PCR引物；其中，正向PCR引物位于質(zhì)粒啟動子上游，反向PCR引物位于質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄終止子下游； 步驟二，以重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為PCR模板，通過所設(shè)計的PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用的DNA聚合酶為具有校正功能的高保真DNA聚合酶；步驟三，回收PCR產(chǎn)物，即PaGene，并定量及測定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需> 1.8，以保證PaGene具有較高的完整性和純度； 步驟四，選取PaGene，按照Lonza公司核轉(zhuǎn)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，核轉(zhuǎn)程序?yàn)镻-19，核轉(zhuǎn)所用溶液為solution V，即kit V，所用PaGene用與對應(yīng)質(zhì)粒相同摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)，進(jìn)而完成PaGene核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟一中，所述目的基因?yàn)镋GFP基因或螢火蟲熒光素酶基因。
8.如權(quán)利要求6所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟一中，所述重組目的基因的表達(dá)質(zhì)粒為BD Biosciences的質(zhì)粒pEGFP_N2或Promega的質(zhì)粒pGL3-Control。
9.如權(quán)利要求6所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟二中，所述DNA聚合酶為Toyobo公司的KOD Plus ； 所述引物具體為=PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQID N0.2所示;PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示。
10.如權(quán)利要求6所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟四中，所用PaGene劑量以2 μ g對應(yīng)質(zhì)粒所對應(yīng)等摩爾數(shù)的劑量進(jìn)行核轉(zhuǎn)。
11.如權(quán)利要求6所述的PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)懸浮動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: Kasum1-1細(xì)胞在含有15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C、5%C02 ;大腸桿菌(Ε.coli)菌株TOPlO被用于質(zhì)粒的保存和擴(kuò)增；用NucleoBond Xtra Midi試劑盒抽提質(zhì)粒 pEGFP_N2 和 pGL3_Control ;用 AxyPrep? Plasmid Miniprep 試劑盒準(zhǔn)備空E.coli TOPlO的洗脫液；所抽提質(zhì)粒被用于EGFP和Iuciferase的擴(kuò)增；所擴(kuò)增基因分別被命名為PaEGFP和PaLuc ； 所述兩個基因用具有校正功能的DNA聚合酶KOD Plus和其對應(yīng)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；正向引物位于基因啟動子上游，EGFP在pEGFP-N2的啟動子為Paw IE ;Iuciferase在pGL3-Control的啟動子為SV40啟動子；反向引物位于轉(zhuǎn)錄終止子下游，EGFP在pEGFP_N2的終止子為早期poly (A)信號；luciferase在pGL3_Control的終止子為SV40晚期poly (A)信號；正反向引物的位置保證PaEGFP和PaLuc能夠在細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄和翻譯；所述引物具體為:PaEGFP-正向的序列如SEQ ID N0.1所示，PaEGFP-反向的序列如SEQ ID N0.2所示；PaLuc-正向的序列如SEQ ID N0.3所示，PaLuc-反向的序列如SEQ ID N0.4所示； PaGene用AxyPrep? PCR Clean-up試劑盒純化,進(jìn)而用于核轉(zhuǎn)Kasum1-Ι細(xì)胞； DNA濃度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用Nano Drop NDlOOO分光光度計測定，以反應(yīng)對應(yīng)核酸的完整性和純度；質(zhì)粒和PaGene亦通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)控； Kasum1-1細(xì)胞與10 μ M等體積的eFluor670混合，并在37°C避光孵育IOmin ;之后加入4-5倍體積預(yù)冷的RPMI1640完全培養(yǎng)基，所述RPMI1640完全培養(yǎng)基為RPMI1640+15%胎牛血清，并且冰浴5min以終止標(biāo)記，之后用RPMI1640完全培養(yǎng)基洗滌3遍，所標(biāo)記細(xì)胞被用于后續(xù)核轉(zhuǎn)； 2X 1O 6Ka sum 1-1細(xì)胞被用于核轉(zhuǎn)，所述細(xì)胞預(yù)先標(biāo)記或沒有標(biāo)記細(xì)胞增殖染料eFluor670 ； 核轉(zhuǎn)所用溶液為solution V，即kit V，程序?yàn)镻-19 ;核轉(zhuǎn)后，細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至37°C預(yù)熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
對于PaEGFP和pEGFP-N2，每次核轉(zhuǎn)的劑量分別為680ng PaEGFP和2000ng pEGFP_N2，具有相同摩爾數(shù)；空E.coli洗脫液亦被用于核轉(zhuǎn)，以便檢測樣品中殘留的內(nèi)毒素是否對細(xì)胞有潛在的致死效果；對于PaLuc和pGL3-Control，核轉(zhuǎn)劑量分別為830ng PaLuc和2000ng pGL3-Control,相同摩爾數(shù)；與PaGene相同質(zhì)量的對應(yīng)質(zhì)粒亦被用于核轉(zhuǎn),具體為pEGFP_N2 680ng, pGL3-Control830ng ； 進(jìn)而完成PCR擴(kuò)增基因核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞；與核轉(zhuǎn)質(zhì)粒相比,核轉(zhuǎn)PaGene能夠顯著降低Kasum1-1細(xì)胞的死亡率,核轉(zhuǎn)PaGene的Kasum1-1細(xì)胞能夠較好增殖,PaGene在保證核轉(zhuǎn)Kasum1-1細(xì)胞較低死亡率的情況下，轉(zhuǎn)染效率沒有顯著降低或降低很少。
【文檔編號】C12N15/87GK103740760SQ201410010269
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】吳康, 范小勇, 黃家穎, 趙旭杰 申請人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心