本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著臨床上大量使用抗菌藥物，特別是第三代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，出現(xiàn)了對(duì)臨床使用的三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥的細(xì)菌即多重耐藥菌(Multidrug-Resistant Organism，MDRO)，細(xì)菌耐藥性問題給臨床感染性疾病的治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。嗜麥芽寡養(yǎng)(窄食)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是一種非發(fā)酵需氧革蘭陰性桿菌，該菌在自然界分布極為廣泛，同時(shí)也是人和動(dòng)物體內(nèi)常見的定植菌。作為條件致病菌的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌獲得了大量繁殖的機(jī)遇，成為了一種醫(yī)院感染重要的新興多重耐藥病原菌，幾乎對(duì)復(fù)方新諾明以外的全部抗菌藥耐藥，呈現(xiàn)泛耐藥性，給臨床帶來了嚴(yán)重的感染問題，患病率及死亡率呈上升趨勢(shì)。由此，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌耐藥機(jī)制、耐藥基因的傳播與轉(zhuǎn)移成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

一種外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法，包括以下步驟：

(1)對(duì)收集到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌重新鑒定和藥敏檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)菌株；

(2)將標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于僅含不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、同時(shí)含碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙(CCCP)和不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、以及僅含CCCP的瓊脂平板上，進(jìn)行外排表型鑒定，篩選出外排泵基因陽性菌株；

(3)選用外排泵基因陽性菌株提取并純化細(xì)菌基因組DNA作為擴(kuò)增模版，銅綠假單胞ATCC25783作為陰性菌株，采用RT-PCR進(jìn)行嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF檢測(cè)；

(4)采用RT-PCR和菌落雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF陽性菌株的Ⅰ類整合酶基因；

(5)利用質(zhì)粒圖譜、核酸內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行外排泵編碼基因SMeDEF、Ⅰ類整合酶基因比對(duì)分析，確定外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)耐藥基因；

(6)將質(zhì)粒DNA和酶切的染色體DNA與經(jīng)過地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因及外排泵編碼基因SMeDEF進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)，完成嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位。

在上述技術(shù)方案中，步驟(1)具體為：采用法國(guó)梅里埃公司VITEK-2-COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)和藥敏測(cè)試系統(tǒng)對(duì)收集到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進(jìn)行重新鑒定和藥敏檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)菌株。

在上述技術(shù)方案中，步驟(3)中：各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為：P1、P2引物各0.5μL，KCl 10mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 8mmol/L，MgCl₂ 2mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl 10mmol/L，BSA質(zhì)量體積比為0.02％，Taq DNA聚合酶1U；總反應(yīng)體積20μL，其中模板液5μL；熱循環(huán)參數(shù)：93℃2min，然后93℃30s、55℃30s、72℃60s，循環(huán)35周期，最后72℃延伸5min；產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，最后凝膠成像儀觀察結(jié)果并攝像保存；陽性PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析。

在上述技術(shù)方案中，步驟(4)具體步驟為：

1)RT-PCR檢測(cè)

DNA模板的制備：用加熱裂解法，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌置于60L pH 8.0的10mmol/LTris·Cl和1mmol EDTA的TE緩沖液中，配成一定濃度的菌懸液，并振蕩混勻，將菌懸液放入97℃水浴中10min，-20℃放置1min，12000r/min離心5min后取上清，于-20℃放置備用；

基因擴(kuò)增：采用PCR法設(shè)計(jì)int1、int2、int3基因引物，反應(yīng)體系：反應(yīng)體積為5μL，PremixTaq PCR反應(yīng)液25μL，基因模板2μL，基因引物各1μL，滅菌蒸餾水2μL；整合子基因擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，再延伸72℃2min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL與緩沖液混勻，點(diǎn)樣于2％瓊脂糖凝膠中，以100V電壓電泳30min，紫外檢測(cè)儀中觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析，int N1引物序列P1:ACGAGCGCAAGGT T TCGGT 565；P2:GAAAGGTCT GGTCAT ACATG；

2)菌落雜交檢測(cè)

在用RT-PCR方法鑒定Ⅰ類整合子的同時(shí)，采用菌落雜交的方法檢測(cè)73株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌攜帶整合子的情況，將73株實(shí)驗(yàn)菌株過夜培養(yǎng)后，中間間隔一定距離，并按一定次序接種到一張尼龍膜上，培養(yǎng)過夜后將所有菌株的DNA釋放出來，并固定在尼龍膜上；以地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因intI1為探針，與73株待測(cè)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌釋放出來的總DNA進(jìn)行雜交，出現(xiàn)陽性信號(hào)的為Ⅰ類整合酶陽性菌株。

在上述技術(shù)方案中，步驟(5)具體步驟為：

先將細(xì)菌用EDTA處理，破壞細(xì)胞膜，然后用十二烷基硫酸鈉(SDS)和NaOH溶液裂解細(xì)胞；輕混溶液以免染色體DNA切成小片段，進(jìn)而在抽提過程中混于質(zhì)粒DNA中，然后加入乙酸中和pH值，使變性的單鏈DNA復(fù)性；用酚/氯仿混合分離后，復(fù)性的DNA仍留在溶液中，而變性的染色體DNA、RNA和蛋白質(zhì)則形成大塊凝集沉淀，最后用乙醇將質(zhì)粒DNA沉淀下來；在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入氯霉素，培養(yǎng)過夜，將細(xì)菌培養(yǎng)物在4℃貯存1-2天，再抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒中是否含有Ⅰ類整合子及整合子的拷貝數(shù)，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移和Southern雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

在上述技術(shù)方案中，步驟(6)具體步驟為：

1)用堿裂解法提取陽性菌株攜帶質(zhì)粒，確定其質(zhì)粒圖譜；

2)Ⅰ整合子陽性菌株作為供體菌，EcoliNK5409F^-△為受體菌，在含有鏈霉素和利福平兩種抗生素的培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；

3)用CTAB法分別提?、耦愓献雍屯馀疟藐栃跃?，提取的染色體DNA用EcorI和EcorV進(jìn)行限制性酶切，酶切后的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別凝膠電泳，然后分別將DNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上；用地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因和外排泵編碼基因SMeDEF作為探針進(jìn)行雜交。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明提供的外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法，對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多藥耐藥菌株進(jìn)行整合子及外排泵篩選及其特性分析；

(2)采用實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)、間隔重復(fù)序列(ERIC)、Southern方法對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的整合子和外排泵陽性菌株進(jìn)行基因指紋圖譜分析，確定其Ⅰ類整合子和外排泵特性與基因型的關(guān)系，確定基因定位，實(shí)現(xiàn)了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位，將對(duì)開發(fā)能夠控制細(xì)菌耐藥基因盒地捕獲和表達(dá)的抗生素佐劑，尋找有效耐藥逆轉(zhuǎn)策，提供有力證據(jù)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為SMeDEF外排泵與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因確定流程圖。

圖2為SMeDEF外排泵與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位與拷貝數(shù)分析流程圖。

圖3為Ⅰ類整合酶陽性菌株的質(zhì)粒表達(dá)圖譜。

圖4為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌整合酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做以詳細(xì)說明。

實(shí)施例

結(jié)合圖1-2具體說明本發(fā)明提供的SMeDEF外排泵與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法的具體步驟：

(1)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株的篩選：采用法國(guó)梅里埃公司VITEK-2-COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)和藥敏測(cè)試系統(tǒng)對(duì)收集到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進(jìn)行重新鑒定和藥敏檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)菌株。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于僅含不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、同時(shí)含碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙(CCCP)和不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、以及僅含CCCP的瓊脂平板上，進(jìn)行外排表型鑒定，篩選出外排泵基因陽性菌株；

(3)選用外排泵基因陽性菌株提取并純化細(xì)菌基因組DNA作為擴(kuò)增模版，銅綠假單胞ATCC25783作為陰性菌株，采用RT-PCR進(jìn)行嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF檢測(cè)；

根據(jù)GenBank中已發(fā)布的各型基因序列由博亞生物技術(shù)有限公司合成引物。各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為：P1、P2引物各0.5μL，KCl 10mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 8mmol/L，MgCl₂2mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L，BSA0.02％(w/v)，Taq DNA聚合酶1U?？偡磻?yīng)體積20μL(其中模板液5μL)。熱循環(huán)參數(shù)：93℃2min，然后93℃30s、55℃30s、72℃60s，循環(huán)35周期，最后72℃延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，最后凝膠成像儀觀察結(jié)果并攝像保存。陽性PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析。

(4)采用RT-PCR和菌落雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF陽性菌株的Ⅰ類整合酶基因；

1)RT-PCR

DNA模板的制備：用加熱裂解法，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌置于60L pH 8.0的TE緩沖液(10mmol/LTris·Cl和1mmol EDTA)中，配成一定濃度的菌懸液，并振蕩混勻，將菌懸液放入97℃水浴中10min，-20℃放置1min，12000r/min離心5min后取上清，于-20℃放置備用。

基因擴(kuò)增：采用PCR法設(shè)計(jì)int1、int2、int3基因引物，反應(yīng)體系：反應(yīng)體積為5μL，PremixTaq PCR反應(yīng)液25μL，基因模板2μL，引物各1μL，滅菌蒸餾水2μL整合子基因擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，再延伸72℃2min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL與緩沖液混勻，點(diǎn)樣于2％瓊脂糖凝膠中，以100V電壓電泳30min，紫外檢測(cè)儀中觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析。int N1引物序列P1:ACGAGCGCAAGGT T TCGGT 565；P2:GAAAGGTCT GGTCAT ACATG。

2)菌落雜交

在用PCR方法鑒定Ⅰ類整合子的同時(shí)，采用菌落雜交的方法檢測(cè)73株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌攜帶整合子的情況。將73株實(shí)驗(yàn)菌株過夜培養(yǎng)后，中間間隔一定距離，并按一定次序接種到一張尼龍膜上，培養(yǎng)過夜后將所有菌株的DNA釋放出來，并固定在尼龍膜上。以地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因intI1為探針，與73株待測(cè)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌釋放出來的總DNA進(jìn)行雜交，出現(xiàn)陽性信號(hào)的為Ⅰ類整合酶陽性菌株，與PCR反應(yīng)檢測(cè)到的結(jié)果相符合，證實(shí)PCR方法檢測(cè)到Ⅰ類整合酶陽性菌株的結(jié)果。

(5)利用質(zhì)粒圖譜、核酸內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行外排泵編碼基因SMeDEF、Ⅰ類整合酶基因比對(duì)分析，確定外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)耐藥基因；

對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒DNA提取，最常用的是堿裂解法。先將細(xì)菌用EDTA(螯合二價(jià)陽離子)處理，破壞細(xì)胞膜，然后用十二烷基硫酸鈉(SDS)和NaOH溶液裂解細(xì)胞。輕混溶液以免染色體DNA切成小片段，進(jìn)而在抽提過程中混于質(zhì)粒DNA中，然后加入乙酸中和PH值，使變性的單鏈DNA復(fù)性。用酚/氯仿混合分離后，復(fù)性的DNA仍留在溶液中，而變性的染色體DNA、RNA和蛋白質(zhì)則形成大塊凝集沉淀，最后用乙醇將質(zhì)粒DNA沉淀下來。為了增進(jìn)質(zhì)粒DNA相對(duì)于染色體DNA的產(chǎn)量，在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入氯霉素，培養(yǎng)過夜，將細(xì)菌培養(yǎng)物在4℃貯存1-2天，再抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒中是否含有Ⅰ類整合子及整合子的拷貝數(shù)，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移和Southern雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

(6)基因定位分析：分別采用質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒DNA與染色體Southern雜交試驗(yàn)進(jìn)行，即將質(zhì)粒DNA和酶切的染色體DNA與經(jīng)過地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因及外排泵編碼基因SMeDEF進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)，完成嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位。

1)用堿裂解法提取陽性菌株攜帶質(zhì)粒，確定其質(zhì)粒圖譜。

2)在質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，Ⅰ類整合子陽性菌株作為供體菌，EcoliNK5409F^-△為受體菌，在含有鏈霉素和利福平兩種抗生素的培養(yǎng)基中，經(jīng)過3次重復(fù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均陰性，推測(cè)Ⅰ類整合子不在質(zhì)粒DNA上。

3)用CTAB法分別提取整合子和外排泵陽性菌株，提取的染色體DNA用EcorI和EcorV進(jìn)行限制性酶切，酶切后的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別凝膠電泳，然后分別將DNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上。用地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶和SMeDEF基因做為探針進(jìn)行雜交。

圖3為Ⅰ類整合酶陽性菌株的質(zhì)粒表達(dá)圖譜，M.整合酶ⅠDNA標(biāo)志物，相對(duì)分子量由下至上分別為：50、100、150、200、300、500、600、800、900、1000、1100、1200、1500Bp；1～5.Ⅰ類整合酶陽性菌株。

圖4為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌整合酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果圖，在Ⅰ類整合酶基因intI1均無酶切點(diǎn)，Ⅲ:整合酶Ⅲ；Ⅱ：整合酶Ⅱ；Ⅰ：整合酶Ⅰ；M:整合酶ⅠDNA Marker,500Bp；1-10:整合酶Ⅰ臨床陽性菌株。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。