1.一種外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)對(duì)收集到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌重新鑒定和藥敏檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)菌株；
(2)將標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于僅含不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、同時(shí)含碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙(CCCP)和不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平板、以及僅含CCCP的瓊脂平板上，進(jìn)行外排表型鑒定，篩選出外排泵基因陽性菌株；
(3)選用外排泵基因陽性菌株提取并純化細(xì)菌基因組DNA作為擴(kuò)增模版，銅綠假單胞ATCC25783作為陰性菌株，采用RT-PCR進(jìn)行嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF檢測(cè)；
(4)采用RT-PCR和菌落雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的外排泵編碼基因SMeDEF陽性菌株的Ⅰ類整合酶基因；
(5)利用質(zhì)粒圖譜、核酸內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行外排泵編碼基因SMeDEF、Ⅰ類整合酶基因比對(duì)分析，確定外排泵SMeDEF與Ⅰ類整合酶基因聯(lián)合介導(dǎo)耐藥基因；
(6)將質(zhì)粒DNA和酶切的染色體DNA與經(jīng)過地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因及外排泵編碼基因SMeDEF進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)，完成嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌多重耐藥基因定位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)具體為：采用法國(guó)梅里埃公司VITEK-2-COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)和藥敏測(cè)試系統(tǒng)對(duì)收集到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進(jìn)行重新鑒定和藥敏檢測(cè)，確立標(biāo)準(zhǔn)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中：各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為：P1、P2引物各0.5μL，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl 10mmol/L，BSA質(zhì)量體積比為0.02％，Taq DNA聚合酶1U；總反應(yīng)體積20μL，其中模板液5μL；熱循環(huán)參數(shù)：93℃2min，然后93℃30s、55℃30s、72℃60s，循環(huán)35周期，最后72℃延伸5min；產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，最后凝膠成像儀觀察結(jié)果并攝像保存；陽性PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)具體步驟為：
1)RT-PCR檢測(cè)
DNA模板的制備：用加熱裂解法，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌置于60L pH 8.0的10mmol/LTris·Cl和1mmol EDTA的TE緩沖液中，配成一定濃度的菌懸液，并振蕩混勻，將菌懸液放入97℃水浴中10min，-20℃放置1min，12000r/min離心5min后取上清，于-20℃放置備用；
基因擴(kuò)增：采用PCR法設(shè)計(jì)int1、int2、int3基因引物，反應(yīng)體系：反應(yīng)體積為5μL，PremixTaq PCR反應(yīng)液25μL，基因模板2μL，基因引物各1μL，滅菌蒸餾水2μL；整合子基因擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃60s，再延伸72℃2min，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL與緩沖液混勻，點(diǎn)樣于2％瓊脂糖凝膠中，以100V電壓電泳30min，紫外檢測(cè)儀中觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并保存所測(cè)序列與GenBank登錄的AMEs基因進(jìn)行序列比較及同源性分析，int N1引物序列P1:ACGAGCGCAAGGT T TCGGT565；P2:GAAAGGTCT GGTCAT ACATG；
2)菌落雜交檢測(cè)
在用RT-PCR方法鑒定Ⅰ類整合子的同時(shí)，采用菌落雜交的方法檢測(cè)73株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌攜帶整合子的情況，將73株實(shí)驗(yàn)菌株過夜培養(yǎng)后，中間間隔一定距離，并按一定次序接種到一張尼龍膜上，培養(yǎng)過夜后將所有菌株的DNA釋放出來，并固定在尼龍膜上；以地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因intI1為探針，與73株待測(cè)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌釋放出來的總DNA進(jìn)行雜交，出現(xiàn)陽性信號(hào)的為Ⅰ類整合酶陽性菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)具體步驟為：
先將細(xì)菌用EDTA處理，破壞細(xì)胞膜，然后用十二烷基硫酸鈉(SDS)和NaOH溶液裂解細(xì)胞；輕混溶液以免染色體DNA切成小片段，進(jìn)而在抽提過程中混于質(zhì)粒DNA中，然后加入乙酸中和pH值，使變性的單鏈DNA復(fù)性；用酚/氯仿混合分離后，復(fù)性的DNA仍留在溶液中，而變性的染色體DNA、RNA和蛋白質(zhì)則形成大塊凝集沉淀，最后用乙醇將質(zhì)粒DNA沉淀下來；在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加入氯霉素，培養(yǎng)過夜，將細(xì)菌培養(yǎng)物在4℃貯存1-2天，再抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒中是否含有Ⅰ類整合子及整合子的拷貝數(shù)，通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移和Southern雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)具體步驟為：
1)用堿裂解法提取陽性菌株攜帶質(zhì)粒，確定其質(zhì)粒圖譜；
2)Ⅰ整合子陽性菌株作為供體菌，EcoliNK5409F-△為受體菌，在含有鏈霉素和利福平兩種抗生素的培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；
3)用CTAB法分別提?、耦愓献雍屯馀疟藐栃跃?，提取的染色體DNA用EcorI和EcorV進(jìn)行限制性酶切，酶切后的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別凝膠電泳，然后分別將DNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上；用地高辛標(biāo)記的Ⅰ類整合酶基因和外排泵編碼基因SMeDEF作為探針進(jìn)行雜交。