本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，我國(guó)環(huán)境污染日益嚴(yán)重，成為當(dāng)前人類面臨的一個(gè)重大問(wèn)題。特別是工業(yè)及生活污水中的氨氮污染，可以引起水體富營(yíng)養(yǎng)化和水體生態(tài)系統(tǒng)紊亂等一系列問(wèn)題。生物硝化脫氮是目前水處理領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，由硝化作用和反硝化作用共同完成，其中硝化作用分為兩個(gè)階段，首先由亞硝化細(xì)菌把氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，然后由硝化細(xì)菌把亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。但是目前已運(yùn)行的生物硝化脫氮池達(dá)標(biāo)率不高，解決問(wèn)題的關(guān)鍵在于提高池內(nèi)亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的生物量及其活性，這就需要一個(gè)快速檢測(cè)亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的方法，用以指導(dǎo)生物硝化池的運(yùn)行。通常所用的亞硝化細(xì)菌鑒定方法一般為16SrDNA擴(kuò)增法，早在很久之前該方法就普遍用于細(xì)菌菌種的鑒定。該法以細(xì)菌16SrDNA區(qū)域通用引物作為擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增結(jié)束后要把PCR產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì)后才只能將菌種鑒定到屬，這樣用通用引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增結(jié)果特異性不高，而且還延長(zhǎng)了菌種鑒定的周期，達(dá)不到快速檢測(cè)的目的。因此找尋針對(duì)亞硝化細(xì)菌PCR鑒定方法的最佳PCR條件成為本領(lǐng)域技術(shù)人員難以解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供了一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法，以亞硝化細(xì)菌的專屬特征性基因-氨單加氧酶基因(amoA)為模板設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，并以亞硝化細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖水平電泳，根據(jù)電泳泳道中條帶的有無(wú)及大小，判斷該細(xì)菌菌株是否屬于亞硝化細(xì)菌或者混合菌群中是否含有亞硝化細(xì)菌。本方法是以用氨單加氧酶基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠性高，并通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件縮短了亞硝化細(xì)菌的鑒定周期，較常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)間縮短26％以上，為亞硝化細(xì)菌種群的鑒定提供了一個(gè)快速、有效的鑒定方法?，F(xiàn)有技術(shù)中PCR擴(kuò)增在PCR儀內(nèi)完成，而擴(kuò)增條件基本一致，這已成為了本領(lǐng)域的基本常規(guī)操作，但是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)針對(duì)本發(fā)明的目的，常規(guī)的PCR擴(kuò)增條件難以適應(yīng)，存在準(zhǔn)確率較低且擴(kuò)增時(shí)間較長(zhǎng)的缺陷，難以適應(yīng)本發(fā)明的要求，故此發(fā)明人針對(duì)這一缺陷對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了改進(jìn)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：⑴引物的設(shè)計(jì)與合成：以亞硝化細(xì)菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提取：采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)菌種的基因組DNA；⑶PCR擴(kuò)增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補(bǔ)足25ul⑷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系準(zhǔn)備好后，以引物的退火溫度為53℃設(shè)定PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，具體反應(yīng)條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：觀察是否含有大小為526bp目標(biāo)條帶，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有則判定為試樣中含有亞硝化細(xì)菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的最大特點(diǎn)就是針對(duì)亞硝化細(xì)菌設(shè)計(jì)了特異性引物，更為主要的就是針對(duì)本發(fā)明的目的優(yōu)化了常規(guī)的PCR擴(kuò)增條件，利用本發(fā)明提供的這種方法，較之常規(guī)的檢測(cè)方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)；與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比可知，本發(fā)明的PCR擴(kuò)增條件中的溫度較之常規(guī)擴(kuò)增溫度均有所降低，且循環(huán)數(shù)由常規(guī)的30個(gè)降低到25個(gè)，且各步驟時(shí)間都較之現(xiàn)有技術(shù)有明顯的縮減，在這種情況下，其準(zhǔn)確度依然高于采用16SrDNA法常規(guī)擴(kuò)增條件(94℃3min，94℃30s、55℃30s、72℃50s(30個(gè)循環(huán))，然后72℃10min)，可見(jiàn)這種擴(kuò)增條件對(duì)于本發(fā)明的要求是最佳的選擇方案，總體時(shí)間較之現(xiàn)有技術(shù)縮短了26％，且準(zhǔn)確度大大提高。綜上所述，本發(fā)明是以用氨單加氧酶基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠性高，并通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件縮短了亞硝化細(xì)菌的鑒定周期，較常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)間縮短26％以上，為亞硝化細(xì)菌種群的鑒定提供了一個(gè)快速、有效的鑒定方法。附圖說(shuō)明圖1為樣品1PCR結(jié)果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品1擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為樣品2PCR結(jié)果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品2擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為樣品3PCR結(jié)果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品3擴(kuò)增產(chǎn)物；圖4為比較例中16srDNA常規(guī)鑒定法的鑒定結(jié)果水平電泳圖，左泳道為Maker2000，條帶從上至下大小分別為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；右泳道為樣品3擴(kuò)增產(chǎn)物；可見(jiàn)其擴(kuò)增產(chǎn)物為一條大小為1424bp的目標(biāo)條帶，因此只能定性檢測(cè)細(xì)菌的存在，無(wú)法確定所檢測(cè)細(xì)菌的種類。具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍，除特殊說(shuō)明外，下述實(shí)施例中均采用常規(guī)現(xiàn)有技術(shù)完成。實(shí)施例1一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法樣品來(lái)源：石化常減壓裝置污水，經(jīng)去酚脫硫處理后進(jìn)入生化處理池，選用此處理池廢水為樣品1。樣品檢測(cè)：⑴引物的設(shè)計(jì)與合成：以亞硝化細(xì)菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提?。翰捎锰旄?xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取上述樣品1廢水中的基因組DNA；⑶PCR擴(kuò)增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補(bǔ)足25ul⑷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系準(zhǔn)備好后，以引物的退火溫度為53℃設(shè)定PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，具體反應(yīng)條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：觀察是否含有大小為526bp目標(biāo)條帶，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有則判定為試樣中含有亞硝化細(xì)菌，結(jié)果如圖1所示，可見(jiàn)樣品1中含有亞硝化細(xì)菌。實(shí)施例2一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法樣品來(lái)源：硫脲化工裝置廢水，經(jīng)去殘留硫脲處理后進(jìn)入生化處理池，選用此處理池廢水為樣品2。樣品檢測(cè)：⑴引物的設(shè)計(jì)與合成：以亞硝化細(xì)菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提?。翰捎锰旄?xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品2廢水中的基因組DNA⑶PCR擴(kuò)增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補(bǔ)足25ul⑷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系準(zhǔn)備好后，以引物的退火溫度為53℃設(shè)定PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，具體反應(yīng)條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：觀察是否含有大小為526bp目標(biāo)條帶，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有則判定為試樣中含有亞硝化細(xì)菌；結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)樣品2中含有亞硝化細(xì)菌。實(shí)施例3一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法樣品來(lái)源：農(nóng)化醚酯裝置廢水，經(jīng)去硫化物及大分子有機(jī)烴后進(jìn)入生化處理池，選用此處理池廢水為樣品3。樣品檢測(cè)：⑴引物的設(shè)計(jì)與合成：以亞硝化細(xì)菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，引物具體序列如下：上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:1所示；下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如SeqIDNo:2示；⑵菌種基因組DNA的提?。翰捎锰旄?xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品3廢水中的基因組DNA⑶PCR擴(kuò)增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴(kuò)增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補(bǔ)足25ul⑷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系準(zhǔn)備好后，以引物的退火溫度為53℃設(shè)定PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，具體反應(yīng)條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：觀察是否含有大小為526bp目標(biāo)條帶，其核苷酸序列如SeqIDNo:3所示；若有則判定為試樣中含有亞硝化細(xì)菌。結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)樣品3中含有亞硝化細(xì)菌。比較例以樣品3為例，比較本專利發(fā)明的快速PCR鑒定法與16srDNA常規(guī)鑒定法的鑒定效率16srDNA常規(guī)鑒定法樣品檢測(cè)：⑴引物：在16srDNA法細(xì)菌鑒定的發(fā)展與使用過(guò)程中，專家學(xué)者在16srDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)了多對(duì)引物并被證明可行，這些引物被用于細(xì)菌16s法鑒定的通用引物，本實(shí)驗(yàn)選擇27F和1492R(本領(lǐng)域常規(guī)引物)作為擴(kuò)增引物，序列如下：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTT。⑵菌種基因組DNA的提?。翰捎锰旄?xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取樣品3廢水中的基因組DNA⑶PCR擴(kuò)增體系：分別以步驟(1)中的通用引物為PCR擴(kuò)增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(25ul)如下：試劑名稱加樣量ul10×PCRbuffer2.5MgCl22.0上游引物(F)1.0下游引物(R)1.0基因組DNA1.0dNTPs2.0Taq聚合酶0.2ddH2O補(bǔ)足25ul⑷PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增體系準(zhǔn)備好后，以引物的退火溫度為53℃設(shè)定PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件，具體反應(yīng)條件如下：⑸瓊脂糖水平電泳：通過(guò)PCR擴(kuò)增并進(jìn)行水平電泳得到一條大小為1424bp的目標(biāo)條帶，電泳結(jié)果如圖4所示。然后對(duì)該條帶進(jìn)行測(cè)序，其核苷酸序列SeqIDNo:4，并輸入NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果判斷該試樣中是否含有亞硝化細(xì)菌。兩種方法擴(kuò)增效率比較：擴(kuò)增時(shí)間比較：本專利發(fā)明的快速PCR鑒定法擴(kuò)增時(shí)間為72min14s；16srDNA常規(guī)鑒定法的擴(kuò)增時(shí)間為98min48s。在擴(kuò)增時(shí)間上本專利發(fā)明的快速PCR鑒定法較常規(guī)鑒定法節(jié)省時(shí)間26％以上；PCR產(chǎn)物測(cè)序：利用本專利發(fā)明的快速PCR鑒定法擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列如SeqIDNo:3所示；將其輸入NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為Nitrosomonas：亞硝化細(xì)菌；將利用16srDNA常規(guī)PCR鑒定法擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列輸入NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，無(wú)結(jié)果。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，本專利發(fā)明的快速PCR鑒定法成功鑒定出亞硝化細(xì)菌，而16srDNA常規(guī)PCR鑒定法的鑒定結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)出所測(cè)細(xì)菌的種類，分析原因?yàn)闃悠分芯N不純，再加上16srDNA通用引物特異性較差無(wú)法特異性檢測(cè)亞硝化細(xì)菌導(dǎo)致，同時(shí)通過(guò)圖1-3可見(jiàn)，本發(fā)明所提供的特異性引物針對(duì)性極強(qiáng)，在擴(kuò)增時(shí)不會(huì)出現(xiàn)其他雜質(zhì)條帶，準(zhǔn)確率較之現(xiàn)有技術(shù)明顯提高，可見(jiàn)本發(fā)明所提供的鑒定方法特異性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠性高，并通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件縮短了亞硝化細(xì)菌的鑒定周期，較常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)間縮短26％以上，為亞硝化細(xì)菌種群的鑒定提供了一個(gè)快速、有效的鑒定方法。<110>黃河三角洲京博化工研究院有限公司<120>一種亞硝化細(xì)菌的PCR鑒定方法<160>4<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ggggtttctactcctggt18<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cccctcgggaaagccttcttc21<210>3<211>526<212>DNA<213>人工序列<400>3tcccctctgctgcactctagtcttgtagtttcaaacgcaattcccaggttaagcccgggg60atttcacatctgacttgcaaaaccgcctgcgcaccctttacgcccagtaattccgattaa120cgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgctttttctgt180cggtaccgtcataaatcatgattatttgtcatgattttttctttccgactaaaagagctt240tacaacccgaaggccttcttcactcacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgt300ccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtgg360ttggtcgtcctctcagaccaactactgatcgttgccttggtgagcctttacctccccaac420tagctaatcagacatcggccgctcctttggcgcaaggtctttcgatcccctgctttcctc480cttagagatatgcggtattagcacatctttcgctgcgttattccca526<210>4<211>1424<212>DNA<213>人工序列<400>4atacatgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtg60agtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaata120ccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttac180agatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgc240gtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctac300gggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgt360gagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttca420aatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcag480ccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcag540gcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaact600ggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtaga660gatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagc720gaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagt780gctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcc840tggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggt900ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctg960acaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtc1020gtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatctta1080gttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtg1140gggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggac1200agaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcg1260gatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcat1320gccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgt1380aacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccga1424當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3