本發(fā)明涉及微生物體外培養(yǎng)的具體領域，具體涉及一種幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori，HP)是一種定植在胃粘膜上皮與粘液之間的革蘭氏陰性螺旋狀桿菌，大量研究表明，其與慢性胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關，在病原學上具有重要的意義。自1983年首次被分離以來，檢測幽門螺桿菌的技術有了很大的進展，主要分為兩大類，一類是侵入式檢測技術，包括活組織切片染色法、快速尿素酶法、細菌培養(yǎng)法以及PCR的方法，另一類是非侵入式檢測技術，包括13C或14C-尿素酶呼氣試驗、血清免疫學檢驗以及糞便抗原(HPSA)檢測等。其中細菌培養(yǎng)法是最準確可靠的檢測技術，被認為是診斷的“金標準”，同時它也是后續(xù)研究的先決條件，可以開展像致病性、藥敏實驗、不同株的毒力等級分型以及其他研究，進而篩選出有效的抗幽門螺桿菌治療方案。因此，對幽門螺桿菌分離培養(yǎng)技術進行研究，并且提高從臨床標本中分離的幽門螺桿菌的陽性檢出率就顯得尤為重要。
但是幽門螺桿菌是一種挑剔的微需氧菌，在體外培養(yǎng)時除了對氣體環(huán)境有嚴苛的要求外，對于培養(yǎng)基的要求也相當嚴格，培養(yǎng)基不僅要滿足幽門螺桿菌的營養(yǎng)需求，還要提供局部的微需氧條件以及合適的pH耐受范圍。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)基并不能適應幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)要求，常用的培養(yǎng)基如哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基和改良Skirrow瓊脂培養(yǎng)基等在培養(yǎng)幽門螺桿菌上均沒有優(yōu)勢，且陽性檢出率極低。
另外，在實際工作中，培養(yǎng)基的質量優(yōu)劣對檢測結果的可靠程度有著直接 的影響，因此需要嚴格控制干燥培養(yǎng)基的質量。
技術實現要素：
本發(fā)明的主要目的是提供一種適合于幽門螺桿菌的分離和傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本發(fā)明所要解決的技術問題是要研制出幽門螺桿菌分離培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基，盡量創(chuàng)造出接近幽門螺桿菌體內生長繁殖的環(huán)境和營養(yǎng)條件，模擬胃粘膜組織環(huán)境，以提高臨床胃粘膜標本中幽門螺桿菌檢出率。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現：在干燥培養(yǎng)基中加入幽門螺桿菌快速生長添加劑，蒸餾水，新鮮羊血。
所述幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基，每1000ml培養(yǎng)基含有以下成分：58.55g干燥培養(yǎng)基，100ml幽門螺桿菌快速生長添加劑，蒸餾水加入定容至950ml，最后加入50ml新鮮羊血。
進一步的，每58.55g干燥培養(yǎng)基含有：蛋白胨20.0g、多胨3.50g、牛肉浸膏粉5.00g、酵母浸膏粉1.00g、氯化鈉7.00g、碳酸氫鈉0.80g、葡萄糖5.00g、不溶性玉米淀粉2.00g、尿素2.00g、重亞硫酸鈉0.25g、瓊脂12.0g。
進一步的，所述培養(yǎng)基pH為7.4～7.6。
前述幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
(1)將氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、重亞硫酸鈉、瓊脂分別用不繡鋼裝，置于干燥箱內，烘烤至恒重；不溶性玉米淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細顆粒，再用100目細篩過篩后置于干燥箱內，烘烤至恒重；
(2)稱取蛋白胨3240g、多胨567g、牛肉浸膏粉810g、酵母浸膏粉162g、氯化鈉1134g、碳酸氫鈉129.6g、葡萄糖810g、不溶性玉米淀粉324g、尿素324g、重亞硫酸鈉40.5g、瓊脂1944g；
(3)將步驟(2)稱量的材料裝入球磨桶內，球磨6小時，轉速控制在每分鐘100 轉；
(4)將干燥培養(yǎng)基裝在干燥、清潔的塑料瓶內密封，干粉呈淡黃色粉未，無潮解結塊；
(5)依據質量標準對干燥培養(yǎng)基進行質量鑒定，按分值法定量檢定培養(yǎng)基的質量；
(6)稱取步驟(4)分裝的干燥培養(yǎng)基58.55g，置于1000ml三角燒瓶中，加入幽門螺桿菌快速生長添加劑100ml，蒸餾水定容至950ml；
(7)將步驟(6)中的三角燒瓶置于壓力蒸汽滅菌鍋內，121℃滅菌20分鐘；
(8)將步驟(7)中的滅菌物冷卻至45～50℃，加入新鮮羊血50ml，充分混勻，傾注入已滅菌的平皿，凝固后，即為幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基。在此過程中，本發(fā)明注重對應用于幽門螺桿菌的培養(yǎng)基進行品質檢定。
進一步的，所得幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基置于干燥的室溫環(huán)境內貯存。
本發(fā)明研制的幽門螺桿菌專用分離培養(yǎng)基，其組成配方發(fā)揮著各自的作用，能達到培養(yǎng)幽門螺桿菌的最佳環(huán)境。其中蛋白胨、多胨、牛肉浸膏粉、酵母浸膏粉、葡萄糖等物質提供給幽門螺桿菌生長繁殖必要的營養(yǎng)物質；氯化鈉的量為0.7％，為幽門螺桿菌最佳滲透壓濃度；碳酸氫鈉的用量為使培養(yǎng)基的酸堿度達到7.4～7.6；不溶性玉米淀粉是經過100目細篩過篩后的顆粒物質，其作用是吸收幽門螺桿菌在生長繁殖過程中有害的代謝產物；尿素能分解成胺，中和酸性物質，使培養(yǎng)基的局部保持微堿性環(huán)境；重亞硫酸鈉的水溶液呈酸性，還原性較強，使幽門螺桿菌生長繁殖的局部環(huán)境為微需氧；幽門螺桿菌快速生長添加劑能縮短細菌在體外生長繁殖時的遲緩期時間和世代時間，使細菌生長的數量增加，表現為菌落形成時間提前，菌落直徑增大；新鮮羊血能提供細菌生長繁殖的必要的生物營養(yǎng)物質和形成類似組織內的環(huán)境。
對近35萬份胃粘膜組織中分離幽門螺桿菌，使用本發(fā)明的分離培養(yǎng)基，幽門螺桿菌的陽性率能從3～5％上升到46％左右。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
本發(fā)明的實施例1：
一、幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基的制備
(1)將氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、重亞硫酸鈉、瓊脂分別用不繡鋼裝，置于干燥箱內，烘烤至恒重；不溶性玉米淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細顆粒，再用100目細篩過篩后置于干燥箱內，烘烤至恒重；
(2)稱取蛋白胨3240g、多胨567g、牛肉浸膏粉810g、酵母浸膏粉162g、氯化鈉1134g、碳酸氫鈉129.6g、葡萄糖810g、不溶性玉米淀粉324g、尿素324g、重亞硫酸鈉40.5g、瓊脂1944g；
(3)將步驟(2)稱量的材料裝入球磨桶內，球磨6小時，轉速控制在每分鐘100轉；
(4)將干燥培養(yǎng)基裝在干燥、清潔的塑料瓶內密封；
(5)依據質量標準對干燥培養(yǎng)基進行質量鑒定。a.質量標準：培養(yǎng)基干粉呈淡黃色粉未，無潮解結塊；培養(yǎng)基pH為7.4～7.6；培養(yǎng)基溶解制備的平板呈淡黃色透明，無顆粒雜質；基礎培養(yǎng)基的質量總分值≥41.11分；幽門螺桿菌在血瓊脂平板上的菌落直徑≥0.5mm；b.按照分值法定量檢定培養(yǎng)基的質量，檢定方法和判定標準見”定量鑒定幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基的方法”；
(6)稱取步驟(4)分裝的干燥培養(yǎng)基58.55g，置于1000ml三角燒瓶中，加入幽門螺桿菌快速生長添加劑100ml，蒸餾水定容至950ml；
(7)將步驟(6)中的三角燒瓶置于壓力蒸汽滅菌鍋內，121℃滅菌20分鐘；
(8)將步驟(7)中的滅菌物冷卻至45～50℃，加入新鮮羊血50ml，充分混勻，傾注入已滅菌的平皿，凝固后，即為幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基。所得幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)基置于干燥的室溫環(huán)境內貯存。
二、幽門螺桿菌分離培養(yǎng)培養(yǎng)基的質量檢定
(一)物理性能鑒定：
1、感觀性狀：培養(yǎng)基干粉呈淡黃色粉未，無潮解結塊；
2、pH：應符合7.4～7.6；
3、水份：應控制在7％以下；
4、澄清：制備的培養(yǎng)基平板呈淡黃色，透明，無顆粒沉定和絮狀物雜質；
5、軟硬度：制備的培養(yǎng)基平板用接種環(huán)劃線時，手感適宜，以不劃破培養(yǎng)基為宜。必要時可采用測定凝膠強度(g/cm2)表示。
(二)生物學性能鑒定(分值法計算)：
1、材料：
(1)指示菌：
金黃色葡萄球菌ATCC 25922；
奈瑟氏淋球菌ATCC 29106；
(2)培養(yǎng)基：
①被檢定培養(yǎng)基：幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基；
②對照培養(yǎng)基：對照培養(yǎng)基2號；
(3)器材：
15×150中試管(滅菌)、凍溶管(滅菌)、1mL移液管(滅菌)、5mL移液管(直徑為9cm，滅菌)、L棒、燒杯、平皿(滅菌)、95％乙醇、混勻 器、游標卡尺、接種環(huán)、酒精燈、250mL三角燒杯、250mL鹽水瓶；
2、操作方法：
(1)培養(yǎng)基配制：
①被檢定培養(yǎng)基：
稱取干燥培養(yǎng)基23.42g，置于三角燒瓶中，加入幽門螺桿菌快速生長添加劑40ml，加蒸餾水定容至380mL，經121℃20分鐘滅菌后冷卻至45-50℃，添加脫纖維綿羊血20mL，充分混勻，傾注平皿，每只平皿20mL，備用。
②對照培養(yǎng)基：
稱取對照2號培養(yǎng)基17.9g，置于三角燒瓶中，加蒸餾水至400mL，加溫溶解，經121℃20分鐘滅菌后冷卻至45-50℃，傾注平皿，每只平皿20mL(直徑為9cm)，備用。
③菌株：
取已復蘇的金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌，分離接種在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時。
④方法：
a.取滅菌中試管1支，加入已滅菌的稀釋液1mL。用接種環(huán)挑取單個菌落(直徑約2mm菌落)，置于1mL稀釋液中，研磨均勻，菌液濃度約為106CFU/mL。
b.取滅菌中試管6支，用5mL移液管各加入稀釋液4.5mL。取上述菌懸液0.5mL，置于第1管中，丟棄移夜管，另取一支1mL移液管，置于第1管中吹打均勻(或用混勻器振蕩均勻)，稀釋度為10-1，并吸取0.5mL菌懸液置于第2管中，丟棄移液管。重復上述操作，第6管菌懸液為10-6。
c.取被檢定培養(yǎng)基平板和對照培養(yǎng)基平板各三只，每只平皿中各加入10-4的 稀釋度的菌懸液0.1mL，用L棒涂布均勻(將菌懸液推干)。
d、分別用10-5、10-6的稀釋度的菌懸液重復③的操作。
e、將平板置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24小時。
⑤結果：
a.計數菌落；計數每只平板上的菌落數。
b.測量菌落直徑：用游標卡尺測量單個菌落的直徑。
⑥計算：
(1)被檢定培養(yǎng)基平板上菌落平均數：
(2)對照2號培養(yǎng)基上的菌落平均數：
(3)幽門螺桿菌分離培養(yǎng)專用培養(yǎng)基血平板上的檢出率(P)：
(4)被檢定培養(yǎng)基平板上的菌落平均直徑
(5)對照2號培養(yǎng)基上的菌落平均直徑
⑦分值計算：
按下列公式計算各種菌株的分值：
實驗結果如表1所示：
表1生長率、菌落直徑結果
⑧質控數據和判定標準：
金黃色葡萄球菌在幽門螺桿菌分離培養(yǎng)專用培養(yǎng)基血平板上的質控參數為：μ＝1.943 σ＝0.378 π＝98.39 δρ＝5.68。
奈瑟氏淋球菌在幽門螺桿菌分離培養(yǎng)專用培養(yǎng)基血平板上的質控參數為：μ＝2.03 σ＝0.149 π＝99.99 δρ＝2.514。
質控數據及其判定標準見表2所示：
表2判定標準
應用定量檢測的方法來檢定培養(yǎng)基或培養(yǎng)基添加劑，是以計算每毫升溶液中含有細菌集落數，在合適的溫度條件和規(guī)定的培養(yǎng)時間測定菌落直徑，作為評價品質的依據。由于幽門螺桿菌在最適宜的相對應的培養(yǎng)基上不能形成單個菌落，也就無法用定量數據來判斷培養(yǎng)基的質量。必須用培養(yǎng)時營養(yǎng)要求高，在37℃溫度環(huán)境中，培養(yǎng)24小時的條件下可形成菌落特點明顯的菌株作為檢定培養(yǎng)基的指示菌，金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌等能達到這個要求。所以，我們采用金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌等作為指示菌，檢定獲得的數據，作為評價培養(yǎng)基添加劑品質的參考依據。
上述的具體實施方式只是示例性的，是為了更好的使本領域技術人員能夠理解本發(fā)明，不能理解為是對本發(fā)明保護范圍的限制；只要是根據本發(fā)明所揭示精神所作出的任何等同變更或修飾，均落入本發(fā)明保護的范圍。