本發(fā)明涉及一種kars基因點(diǎn)突變小鼠模型的構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及kars基因點(diǎn)突變小鼠模型的應(yīng)用，屬于動(dòng)物模型領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

認(rèn)知是機(jī)體認(rèn)識(shí)和獲取知識(shí)的智能加工過(guò)程，涉及學(xué)習(xí)、記憶、語(yǔ)言、思維、精神、情感等一系列隨意、心理和社會(huì)行為。認(rèn)知障礙指與上述學(xué)習(xí)記憶以及思維判斷有關(guān)的大腦高級(jí)智能加工過(guò)程出現(xiàn)異常，從而引起嚴(yán)重學(xué)習(xí)、記憶障礙，同時(shí)伴有失語(yǔ)或失用或失認(rèn)或失行等改變的病理過(guò)程。

目前，認(rèn)知障礙的小鼠模型主要采用血管性癡呆和阿爾茲海默病兩種類(lèi)型。血管性癡呆由于急慢性腦缺血缺氧，引起腦組織損傷，可導(dǎo)致腦功能減退，認(rèn)知功能下降。其中，針對(duì)大動(dòng)脈的主要模型構(gòu)建方法有血管阻斷法和血管栓塞法，微小血管損傷的模型有易卒中自發(fā)性高血壓大鼠(shrsp)，伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病cadasil動(dòng)物模型(notch3轉(zhuǎn)基因鼠)等。阿爾茲海默病的模型常見(jiàn)的有：①通過(guò)局部毀損動(dòng)物大腦膽堿能系統(tǒng)導(dǎo)致其記憶和認(rèn)知功能障礙；②腦內(nèi)注射β淀粉樣蛋白局部模擬ad；③轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型如app轉(zhuǎn)基因模型、ps轉(zhuǎn)基因模型、tau轉(zhuǎn)基因模型等。然而，上述的動(dòng)物模型并不十分成熟，用手術(shù)方式構(gòu)建模型對(duì)動(dòng)物打擊較大，術(shù)中死亡率較高，術(shù)后也難以長(zhǎng)期存活，不利于觀察研究。ad的轉(zhuǎn)基因模型僅能代表某些病理、生理，也很難充分再現(xiàn)阿爾茲海默病的復(fù)雜特性。如何找到一種更貼近自然發(fā)生方式的動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，是當(dāng)前對(duì)認(rèn)知障礙進(jìn)行研究亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

我們的研究發(fā)現(xiàn)，kars基因的異常突變與認(rèn)知障礙有關(guān)。構(gòu)建kars基因突變小鼠模型，可以幫助研究者深入了解kars的其他生物學(xué)功能，為探索kars功能與認(rèn)知障礙的相關(guān)性提供有效的研究途徑和方法，并由此提供其應(yīng)用。通過(guò)crispr/cas9方法構(gòu)建一種新型的、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的kars基因突變小鼠模型，有望深入研究疾病的損傷機(jī)制，從而找到延緩認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展的新方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種kars基因點(diǎn)突變小鼠模型的構(gòu)建方法以及kars基因點(diǎn)突變小鼠模型的應(yīng)用。

本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：靶點(diǎn)構(gòu)建

1)尋找kars基因的cds區(qū)，明確外顯子部分，點(diǎn)位：r504h；

2)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)；

步驟二：獲取受精卵，并進(jìn)行顯微注射；

1)guide-rna，cas9rna轉(zhuǎn)錄；

2)純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；

3)將guide-rna/cas9mrna顯微注射到受精卵細(xì)胞質(zhì)中；

步驟三：將受注射過(guò)guide-rna/cas9mrna的受精卵進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行胚胎移植；

步驟四：founder小鼠鑒定：

提取出生的胚胎移植小鼠的dna，進(jìn)行pcr鑒定；

步驟五：f1代小鼠鑒定，將founder小鼠與野生型小鼠交配，生出的小鼠為f1代，若f1代中有陽(yáng)性小鼠出生，表明相關(guān)品系小鼠模型構(gòu)建成功。

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，還可以具有這樣的特征，還包括：步驟六：p532s位點(diǎn)突變的小鼠的構(gòu)建。

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，還包括：步驟七：karsr504h/p532s雙位點(diǎn)復(fù)合雜合突變，將r504h純合子突變小鼠與p532s雜交，得到雜合突變小鼠。

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，其中，與kars基因的點(diǎn)位r504h相對(duì)應(yīng)的sgrna的dna序列是：

ccccaggcaccgctccaaagagg，

gatcactaatacgactcactataggccaggcaccgctccaaaggttttagagctagaaat。

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，其中，對(duì)founder小鼠進(jìn)行鑒定所用的鑒定引物是：

kars-pcr-s:caggcatcccaaaagaacaa

kars-pcr-a:gcttaggtaaaacaccaagaaa。

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，其特征在于，其中，p532s的sgrna的dna序列如下：

進(jìn)一步，本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，其特征在于：對(duì)p532s位點(diǎn)突變的小鼠進(jìn)行鑒定的鑒定引物是：

kars-pcr-s:caggcatcccaaaagaacaa，

kars-pcr-a:gcttaggtaaaacaccaagaaa。

本發(fā)明還提供上述任意一項(xiàng)所述的kars基因點(diǎn)突變的小鼠在研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，上述的應(yīng)用，還可以具有這樣的特征，神經(jīng)系統(tǒng)疾病為認(rèn)知障礙。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的構(gòu)建具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的小鼠模型的方法，由于采用kars基因的定點(diǎn)突變來(lái)進(jìn)行，使小鼠產(chǎn)生了基因組水平上的改變，小鼠出生后其疾病在自然規(guī)律下發(fā)生發(fā)展。使得模型小鼠的疾病研究能夠在與真實(shí)疾病的發(fā)生和發(fā)展更加接近的條件下進(jìn)行，其研究的結(jié)果更具參考價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是kars基因r504h位點(diǎn)突變的founder小鼠基因測(cè)序圖；

圖2是r504h位點(diǎn)突變的f1代小鼠基因測(cè)序圖；

圖3是p532s位點(diǎn)突變的founder小鼠基因測(cè)序圖；

圖4是p532s位點(diǎn)突變的f1代小鼠基因測(cè)序圖；

圖5是各小鼠模型進(jìn)行定位航行試驗(yàn)的結(jié)果圖；

圖6是各小鼠模型進(jìn)行空間探索試驗(yàn)的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

1、靶點(diǎn)構(gòu)建：

利用crispr/cas9genetargeting技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)目的基因的grna，體外轉(zhuǎn)錄為mrna，指導(dǎo)cas9蛋白在特定位點(diǎn)剪切dna雙鏈。

(1)基因信息

genebankgeneid:85305

(2)設(shè)計(jì)構(gòu)思

根據(jù)提供的物種、基因名稱(chēng)或者基因id在ncbi或ensemble中進(jìn)行查找。找到該基因cds區(qū)，即編碼區(qū)，分析相應(yīng)的基因組結(jié)構(gòu)，明確cds的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)，選擇候選的待敲除位點(diǎn)，確定待敲除位點(diǎn)。確定敲除位點(diǎn)后，選擇23至250bp的外顯子序列進(jìn)行sgrna序列的設(shè)計(jì)，最終選擇off-target較少的作為點(diǎn)突變的靶點(diǎn)。

(3)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

kars-r504h-sgrna-s:ccccaggcaccgctccaaagagg

gatcactaatacgactcactataggccaggcaccgctccaaaggttttagagctagaaat

kars-r504h-120bp-oligo:cgc--cac

ggtattgcattatgagagctctgaatattcatcctctgtggtctcgcgtccccaggcaccactccaaagagggtctcacggagcgctttgagctgtttgtcatgaagaaggagatatgca

鑒定引物：

kars-pcr-s:caggcatcccaaaagaacaa

kars-pcr-a:gcttaggtaaaacaccaagaaa

鑒定引物是對(duì)所有小鼠的該位點(diǎn)都可以使用來(lái)進(jìn)行鑒定的，以需要突變的目的dna為中心，在上下游各200bp-300bp的區(qū)間分別設(shè)計(jì)鑒定引物。

2、胚胎供體小鼠(c57bl/6)超排卵

pmsg(孕馬血清促性腺激素)處理供體雌性小鼠，46小時(shí)后注射hcg(人絨毛膜促性腺激素)，與雄性小鼠合籠交配，次日取受精卵進(jìn)行顯微注射。

3、顯微注射及胚胎移植

guide-rna和cas9mrna體外轉(zhuǎn)錄：利用noti位點(diǎn)將cas9質(zhì)粒線性化，使用mmessagesp6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(lifetechnologies公司)；guide-rna模板使用invitro轉(zhuǎn)錄t7試劑盒(takara公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都使用megaclear^tmkit純化。相關(guān)操作步驟詳見(jiàn)相關(guān)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

guide-rna/cas9mrna受精卵注射：注射樣品配制成50：l體系。樣品注射到受精卵胞質(zhì)中，供體受精卵取自c57bl/6j小鼠品系。

4、founder小鼠鑒定

胚胎移植的小鼠將在手術(shù)后19天左右出生，待小鼠出生約7天后剪尾(或腳趾)提取dna并進(jìn)行pcr鑒定。

點(diǎn)突變：

cgcgtccccaggcaccactccaaagagggtctcacggagcgctttg

mutant

測(cè)序圖如圖1所示。

5、f1小鼠鑒定

待雄性founder小鼠到7周齡，雌性小鼠到4周齡，可分別與野生型異性小鼠交配，小鼠出生20天后pcr鑒定。若有陽(yáng)性小鼠出生，則表示轉(zhuǎn)基因已經(jīng)整合到生殖細(xì)胞，標(biāo)志品系構(gòu)建成功。

點(diǎn)突變：

cgcgtccccaggcaccactccaaagagggtctcacggagcgctttg

mutant

測(cè)序圖如圖2所示。

三、karsp532s點(diǎn)突變方案

1、靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

kars-p532s-sgrna-s和kars-p532s-sgrna-2s可以分開(kāi)使用，也可以一起使用，一起使用的切割效率更高一些。

kars-p532s-120bp-oligo:ccc---tcc

cgctttgagctgtttgtcatgaagaaggagatatgcaatgcctatactgagctgaatgactccgtgcggcagaggcagctgtttgaggagcaggccaaggtgagtgagtgagtgagacta

以上序列中，下滑線顯示的是與目的dna結(jié)合的特異性序列，方框標(biāo)注的是grna的pam，為cas9蛋白的切割識(shí)別位點(diǎn)。

鑒定引物：

kars-pcr-s:caggcatcccaaaagaacaa

kars-pcr-a:gcttaggtaaaacaccaagaaa

2、founder鑒定結(jié)果

gagatatgcaatgcctatactgagctgaatgactccgtgcggcagaggcagctgtttgaggagcaggccamutant

突變位點(diǎn)測(cè)序圖如圖3所示。

3、f1代鑒定結(jié)果

(1)點(diǎn)突變：

gagatatgcaatgcctatactgagctgaatgactccgtgcggcagaggcagctgtttgaggagcaggccamutant

測(cè)序圖如圖4所示。

四、karsr504h/p532s雙位點(diǎn)復(fù)合雜合突變

f1代小鼠鑒定后，選擇相同基因型的雌雄小鼠合籠，傳至f2代，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，子代小鼠中有25％為純合子小鼠。之后，將攜帶r504h點(diǎn)突變的純合雌(或雄)鼠與攜帶p532s點(diǎn)突變的純合雄(或雌)鼠交配，傳至f2代，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，子代小鼠中100％為復(fù)合雜合突變小鼠。

對(duì)上述實(shí)施方式中得到的三種小鼠模型，利用水迷宮檢測(cè)法進(jìn)行認(rèn)知能力的評(píng)價(jià)：

本實(shí)施方式所用的水迷宮檢測(cè)法包括定位航行和空間探索兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5和圖6以及表1和表2所示。由圖5和圖6以及表1和表2可以看出，與野生型小鼠相比較，kars基因的r504h點(diǎn)突變、p532s點(diǎn)突變以及r504h/p532s雜合突變小鼠的認(rèn)知能力均顯著地降低。

表1：定位航行結(jié)果表

表2：空間探索結(jié)果表

本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)在于kars基因突變與認(rèn)知障礙的關(guān)系，本發(fā)明為研究者探索kars基因在認(rèn)知障礙中的相關(guān)作用機(jī)制提供有效途徑，也為認(rèn)知障礙相關(guān)疾病的研究提供新型、穩(wěn)定的模型。

本發(fā)明的kars基因突變的小鼠模型，可以應(yīng)用于對(duì)認(rèn)識(shí)障礙這種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，更具體的，可以應(yīng)用于對(duì)認(rèn)知障礙與kars基因之間的關(guān)系的研究。更進(jìn)一步的，本發(fā)明的kars基因突變的小鼠模型的應(yīng)用，可以進(jìn)一步擴(kuò)展到對(duì)kars基因與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系的研究。

sequencelisting

<110>上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院

<120>kars基因點(diǎn)突變小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

<160>17

<170>patentinversion3.3

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ccccaggcaccgctccaaagagg23

<210>2

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<212>dna

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gatcactaatacgactcactataggccaggcaccgctccaaaggttttagagctagaaat60

<210>3

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actccaaagagggtctcacggagcgctttgagctgtttgtcatgaagaaggagatatgca120

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<213>人工序列

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<210>5

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<210>6

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<213>小鼠

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<212>dna

<213>小鼠

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gagatatgcaatgcctatactgagctgaatgactccgtgcggcagaggcagctgtttgag60

gagcaggcca70

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<211>70

<212>dna

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