本發(fā)明涉及牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

傳染性鼻氣管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)又名牛皰疹病毒ⅰ型感染癥(bovineherpesvirustype1infections，bohv-1)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒引起牛的一種急性接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)形式多樣，以呼吸道為主，又稱紅鼻病或牛傳染性壞死性鼻炎。自然條件下，僅牛對本病易感。病牛和帶毒動物是主要傳染源，隱性感染的種公牛精液帶毒。病牛愈后可帶毒6～12個月，甚至長達(dá)19個月。病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中。急性bohv-1呼吸道感染還可以繼發(fā)其他細(xì)菌性或病毒性感染，造成牛呼吸道疾病綜合征(brdc)。

此病目前在世界范圍內(nèi)流行，對乳牛的產(chǎn)奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有較大影響，結(jié)合流行病學(xué)，可做出初步診斷，但確診必須依靠實驗室診斷，實驗室診斷包括病毒分離鑒定和血清學(xué)試驗。通常檢測血清樣品中bohv-1抗體的方法有病毒中和試驗(vn)和各種酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)。另外，還有瓊脂擴散試驗和間接血凝試驗。bohv-1為dna病毒，屬皰疹病毒科，感染后一般發(fā)生病毒潛伏而長期帶毒，適當(dāng)應(yīng)激條件下重新發(fā)病，使疾病在牛群中廣泛流行。通常情況下鑒定血清學(xué)中陽性動物是檢查動物感染狀態(tài)非常有用而且理想的指標(biāo)，抗體陽性動物可認(rèn)為是病毒攜帶動物和潛在的排毒者，國內(nèi)目前大型養(yǎng)牛場有使用牛傳染性鼻氣管炎疫苗，或者幼畜通過吸食初乳獲得母源抗體，所以依靠血清抗體對疫病篩查需結(jié)合具體情況進(jìn)行分析，最后的臨床診斷仍是病原的檢測。bohv-1為雙股dna病毒，其病毒基因平均gc含量高于75％而有別與其它病毒，因其基因組特殊性限制了對bohv-1的病原學(xué)快速檢測方法的建立。鑒于目前臨床仍缺乏適于臨床現(xiàn)場應(yīng)用的bohv-1病原快速有效的檢測方法，所以建立快速高效的檢測方法對疫病得篩查為后期疫病得治療和養(yǎng)牛業(yè)得健康發(fā)展尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測方法靈敏性低、血清學(xué)檢測假陽性高、國外進(jìn)口試劑昂貴的問題，本發(fā)明提供一種牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒及其制備方法。

本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒，該試劑盒包括：mightyamp酶、2xbuffermix緩沖液、無菌雙蒸水、金納米顆粒溶膠、一對特異性引物和一個牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物p1和p2：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'；

所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒為含有306個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pmd18-t重組質(zhì)粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示；

所述含有306個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pmd18-t重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中增殖。

作為優(yōu)選的實施方式，所述含有306個堿基的核苷酸片段的序列如序列表中的seqidno:1所示。

作為優(yōu)選的實施方式，該試劑盒還包括陰性對照，所述陰性對照為蒸餾水。

本發(fā)明還提供了上述牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)配制pcr反應(yīng)液

所述pcr反應(yīng)液包括mightyamp酶、2xbuffermix緩沖液、無菌雙蒸水、金納米顆粒溶膠和一對特異性引物；

所述一對特異性引物分別為：鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒的引物p1和p2：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'；

(2)建立牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒

所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒為含有306個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pmd18-t重組質(zhì)粒；

所述含有306個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pmd18-t重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中增殖；

(3)陰性對照：所述陰性對照為蒸餾水。

作為優(yōu)選的實施方式，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒通過以下方法制備：以牛傳染性鼻氣管炎病毒的ge基因為模板，以p1和p2為引物進(jìn)行pcr擴增，得到長度為306bp的擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物回收并純化后克隆至pmd18-t載體，得到牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒，其序列如序列表中的seqidno:2所示。

作為優(yōu)選的實施方式，以p1和p2為引物進(jìn)行pcr擴增的反應(yīng)條件：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35個循環(huán)；68℃總延伸10min。

作為優(yōu)選的實施方式，所述金納米顆粒溶膠的直徑為20nm，濃度為0.5μg/μl。

本發(fā)明的有益效果是：

1、根據(jù)牛傳染性鼻氣管炎病毒基因組的保守基因ge序列設(shè)計一對特異性引物，通過組裝得到檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒可以在模板高gc含量、退火溫度溫差范圍5℃內(nèi)，退火時間3秒以內(nèi)檢測被檢測樣品中是否含有牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)核酸，具有較高的特異性和敏感性，比常規(guī)pcr技術(shù)高效，靈敏特異的特點。具可以對牛群中感染和發(fā)病動物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

2、本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒可以對細(xì)胞培養(yǎng)物、血液、組織培養(yǎng)物、鼻拭子及糞拭子等多種樣品的牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)進(jìn)行快速檢測，樣品適用范圍廣，試劑盒提供的試劑無感染性、無生物安全隱患成分，使用安全性高。

3、本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒可在收到樣品3小時內(nèi)給出進(jìn)行定性檢測結(jié)果，反應(yīng)靈敏特異，省時高效，是一種檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的有效工具。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒的特異性檢測電泳圖；

圖中：m為dl2000dnamarker，1-4為分別以bvdv、ibrv、bpiv3和ibrv陽性對照重組質(zhì)粒為模板，加入鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2的檢測結(jié)果，5為陰性對照(蒸餾水)。

圖2為本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒的敏感性檢測電泳圖；

圖2中：ibrv陽性對照重組質(zhì)粒的檢測濃度泳道2～7為2.23×10⁶拷貝/μl～2.23×10¹拷貝/μl，泳道1為陰性對照。

圖3為本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒的普通pcr敏感性檢測對比電泳圖；

圖中：ibrv陽性對照重組質(zhì)粒的檢測濃度泳道2～7為2.23×10⁶拷貝/μl～2.23×10¹拷貝/μl，泳道7為陰性對照。

圖4、為本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒的ibrv病毒樣品檢測電泳圖；

圖中：m為dl2000dnamarker，3、5、6、7、8陽性結(jié)果，2、4、9、10、11為陰性結(jié)果，1為陰性對照。

圖5為本發(fā)明的nano-pcr檢測試劑盒的臨床ibrv病毒樣品普通pcr檢測對比電泳圖；

圖中：m為dl2000dnamarker，3、5、6為陽性結(jié)果，1、2、4、7、8、9、10、11為陰性結(jié)果，1為陰性對照(蒸餾水)。

具體實施方式

本發(fā)明建立了牛傳染性鼻氣管炎病毒(bohv-1)的納米pcr(nano-pcr)新型分子檢測試劑盒。納米技術(shù)近年來在疫病臨床診斷中得到了廣泛運用，有十分突出的優(yōu)點。本發(fā)明針對bohv-1病毒ge基因(genbank:l27212.1)的序列設(shè)計引物，特異性識別靶基因序列的獨立區(qū)域，利用金納米顆粒導(dǎo)熱快速，可與dna片段結(jié)合的原理，在pcr反應(yīng)體系中加入一定濃度的金納米顆粒，通過試驗優(yōu)化反映條件，建立了通特異性好、靈敏度高的bohv-1病毒nano-pcr方法，并對重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示，試驗條件經(jīng)優(yōu)化后，該方法在模板2.23×10²拷貝/μl仍能被檢測出。應(yīng)用本發(fā)明建立的檢測試劑盒與普通pcr進(jìn)行比較，靈敏性是普通pcr的10倍。對臨床樣品的檢測，陽性檢出率高于普通pcr40％。nano-pcr具有簡單快速、靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢，為bohv-1的臨床檢測提供了一種靈敏高效的試驗手段，更適合ibr的診斷和臨床快速檢測。

實驗材料：

牛傳染性鼻氣管炎病毒ibrv病毒陽性質(zhì)粒、牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)病毒陽性質(zhì)粒、牛副流感3型病毒(bpi3)病毒陽性質(zhì)粒、牛呼吸道合胞體病毒(brsv)陽性質(zhì)粒和大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存；

m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶、rtaqdna聚合酶、mightyamp酶、dl2000dnamarker和dntp均購自寶生物工程(大連)有限公司；金納米顆粒(20nm)購自sigma公司；dna提取試劑盒購自invitrogen公司。

實施例1本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎nano-pcr檢測試劑盒的組裝

(1)配制nano-pcr反應(yīng)液：

①根據(jù)ibrv病毒ge基因組的保守基因序列設(shè)計一對特異性引物，為鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2，引物的序列如下：

p1：5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'，

p2：5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'，

②nano-pcr反應(yīng)液的配制：反應(yīng)液由mightyamp酶、金納米顆粒溶膠(20nm，濃度0.5μg/μl)，2xbuffermix緩沖液、無菌雙蒸水和上述①中的一對特異性引物組成。

(2)陽性對照重組質(zhì)粒的構(gòu)建

①制備牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)陽性對照質(zhì)粒：利用mdbk細(xì)胞增殖牛傳染性鼻氣管炎病毒，培養(yǎng)40h后參照病毒dna提取試劑提取牛傳染性鼻氣管炎病毒dna為模板，以5'-gctcgccaacttctttcaggg-3'(p1)和5'-gcgtcaaactcctcctcttcctc-3'(p2)為引物進(jìn)行pcr擴增，得到長度為306bp的擴增產(chǎn)物(ibrv306bp目的片段)，其序列如序列表中的seqidno:1所示。pcr反應(yīng)條件為：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35個循環(huán)；68℃總延伸10min，將擴增產(chǎn)物回收并純化后克隆至pmd18-t載體，利用pmd18-t載體構(gòu)建ibrv陽性對照重組質(zhì)粒，最終得到牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒，送至invitrogen公司進(jìn)行測序；

②陽性對照重組質(zhì)粒的建立結(jié)果：上述一個陽性對照重組質(zhì)粒經(jīng)過測序后，進(jìn)行核酸比對發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因的核酸同源性達(dá)到99％以上，這表明所獲得的陽性對照重組質(zhì)粒均為陽性質(zhì)粒，牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性對照質(zhì)粒的序列如序列表中的seqidno:2所示。

(3)設(shè)置陰性對照：陰性對照為蒸餾水。

實施例2本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎nano-pcr檢測試劑盒的使用方法

(1)對待檢測的樣品提取樣品dna，待檢測的樣品包括細(xì)胞培養(yǎng)物、血液、組織培養(yǎng)物、鼻拭子及糞拭子等。

(2)nano-pcr反應(yīng)條件的確定

經(jīng)過對反應(yīng)濃度和退火溫度的條件的優(yōu)化，確定在25μl反應(yīng)體系中，引物p10.5μl，引物p20.5μl，mightyamp酶0.5μl，2×buffer12.5μl，模板1μl，金納米顆粒溶膠0.5μl，去離子水補齊反應(yīng)體系至25μl，brsv標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒為陽性模板。反應(yīng)條件設(shè)置為：98℃2min；98℃10s，退火溫度范圍55℃～63℃，退火時間5s～15s，68℃1min，30個循環(huán)，68℃總延伸10min，以雙蒸水為陰性對照。

(3)以提取的樣品dna為模板，將樣品dna、陽性對照質(zhì)粒、陰性對照分別加入到含有mightyamp酶、1xbuffermix緩沖液、無菌雙蒸水和一對特異性引物的管中，98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35個循環(huán)；68℃總延伸10min。

(4)取5μlpcr產(chǎn)物，以1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

(5)判定結(jié)果：如果從待檢測的樣品中擴增到了306bp片段，則該待檢測的樣品中含有牛傳染性鼻氣管炎病毒。

實施例3本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒的特異性實驗

分別以ibrv、brsv、bvdv和bpi3陽性對照重組質(zhì)粒以及陰性對照(蒸餾水)為模板，加入鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)的引物p1和p2，進(jìn)行nano-pcr檢測試劑盒的特異性實驗。

實驗結(jié)果：如圖1所示，分別以bpiv3、brsv、bvdv和ibrv陽性對照重組質(zhì)粒為模板出現(xiàn)其對應(yīng)的陰性、陰性、陰性和306bp條帶，陰性對照未擴增出任何條帶。

實施例4本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒的敏感性實驗

分別以不同濃度的ibrv陽性對照重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行nano-pcr檢測試劑盒的敏感性實驗，并與普通pcr進(jìn)行對比研究，ibrv陽性對照重組質(zhì)粒的檢測濃度為5.8×10⁷拷貝/μl～5.8×10¹拷貝/μl。

實驗結(jié)果：如圖2所示，m為dna2000marker，1為陰性對照，2至7為ibrv陽性對照重組質(zhì)粒10倍系列稀釋，最低檢測結(jié)果為2.23×10²拷貝/μl。如圖3所示，m為dna2000marker，1-6為ibrv陽性對照重組質(zhì)粒10倍系列稀釋，最低檢測結(jié)果為2.23×10²拷貝/μl，7為陰性對照。

實施例5利用本發(fā)明的牛傳染性鼻氣管炎病毒nano-pcr檢測試劑盒檢測臨床采集樣品

(1)制備病毒核酸模板(病毒dna的提取)

參照病毒dna提取試劑提取臨床樣品的總dna作為ibrv病毒的nano-pcr模板。

(2)nano-pcr反應(yīng)

以ibrv病毒提取的dna為模板，加入到包含引物的nano-pcr反應(yīng)體系中，采用nano-pcr最佳反應(yīng)條件對病毒模板進(jìn)行檢測，并與普通pcr方法進(jìn)行比對檢驗。

(3)檢測結(jié)果

如圖4和圖5所示，ibrv病毒出現(xiàn)其對應(yīng)的306bp。nano-pcr檢出5份陽性樣品，pcr檢出3份陽性樣品。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定；對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動；這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉；而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。