本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種樣本直接加入的ebvdna一步法測定試劑盒。

背景技術(shù)：

eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)是一種常見的人類皰疹病毒，是傳染性單核細(xì)胞增多癥的主要病原，與多種人類疾病有關(guān)。全球約超過90％的人群均感染過ebv。ebv可累計(jì)全身多個系統(tǒng)，包括肝、脾、淋巴結(jié)、腎、心臟、肺、骨髓及腦等，且臨床狀多樣化。ebv的感染率高，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，常見的疾病有肝炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、器官移植后感染、造血干細(xì)胞移植后感染等。因此，檢測ebv的含量對疾病的篩查和輔助診斷具有重要意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)是一種根據(jù)生物體內(nèi)dna復(fù)制性質(zhì)而設(shè)計(jì)的體外快速擴(kuò)增特定dna序列的技術(shù)。pcr反應(yīng)體系主要由核酸引物、4種dntps、dna聚合酶、模板dna和pcr反應(yīng)緩沖液體系組成。自美國cetus公司人類遺傳室karymullis及其同事于1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)以來，pcr技術(shù)及其衍生技術(shù)就被快速開發(fā)出來，并在多種核酸檢測中得到了廣泛的運(yùn)用。尤其是病毒或其他病原體的檢測，當(dāng)知道待檢病原某一特定基因片段時，即可利用特異性的引物對樣品中微量的目標(biāo)dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使其達(dá)到檢測量，通過適當(dāng)?shù)臋z測手段進(jìn)行檢測，即可確定病原體的存在與否。

實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用dna擴(kuò)增過程中熒光信號的積累實(shí)時監(jiān)測整個pcr進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。與普通的pcr相比。實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)具有特異性強(qiáng)、快捷度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了pcr的定量分析。目前，實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究及臨床檢測中得到了廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種樣本直接加入的ebvdna一步法測定試劑盒，同時基于該方法提供相應(yīng)的試劑盒。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供的方案為：

一種樣本直接加入的ebvdna一步法測定試劑盒，其特征在于試劑盒主要包括(1)預(yù)先包裝在pcr擴(kuò)增八聯(lián)管中的核酸擴(kuò)增試劑(包括ebv-pcr反應(yīng)液和酶混合液)；(2)核酸釋放劑；(3)定量校準(zhǔn)品和質(zhì)控品(包括臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品)。

在本發(fā)明中，發(fā)明人預(yù)先將核酸擴(kuò)增試劑(主要包括ebv-pcr反應(yīng)液和酶混合液)分裝到pcr擴(kuò)增八聯(lián)管中，并用熔點(diǎn)低于42℃呈凝固狀態(tài)的石蠟油封閉。在使用時將核酸釋放劑加在凝固的石蠟油上方，與同時加入的檢測樣本、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品充分反應(yīng)。

所述的ebv-pcr的反應(yīng)液中包括ebv的引物和探針及特異性內(nèi)標(biāo)的引物和探針，序列如下：

ebv-f：5’-cccgtcacggtgacgtagtctgtct-3’(seqidno：1)

ebv-r：5’-ctagcaaaacctctagggca-3’(seqidno：2)

ebv-probe：5’-hex-tagacactgcaaaacctcaggacctac-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述eb病毒的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cccgtcacggtgacgtagtctgtcttgaggagatgtagacttgtagacactgcaaaacctcaggacctacgctgccctagaggttttgctag(seqidno：7)；由上述內(nèi)標(biāo)(ic)的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagtcgttggatg(seqidno：8)。其中，ebv及內(nèi)標(biāo)ic的5’端標(biāo)記了不同的熒光探針報告集團(tuán)，其中ebv的熒光探針報告集團(tuán)為hex，猝滅集團(tuán)為bhq1；內(nèi)標(biāo)(ic)的熒光探針報告集團(tuán)為fam，猝滅集團(tuán)為bhq2。

作為優(yōu)選，ebv-pcr反應(yīng)液體系包括引物、探針、tris堿、氯化鎂、氯化鉀和dntp。

作為優(yōu)選，核酸釋放劑的組成包括：0.2～0.4n氫氧化鈉、0.3～0.6m氯化鉀、0.01～0.05％n-月桂酰肌氨酸鈉、5mmedta、0.3～0.6mtris-hcl和1～2％曲通x-100中的一種或多種。

作為優(yōu)選，所述的核酸釋放劑加在凝固石蠟油上方，與同時加入的檢測樣本、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品充分反應(yīng)。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述方法包括以下步驟：

步驟1)將預(yù)先包裝好核酸擴(kuò)增試劑的pcr擴(kuò)增管，置于干熱器43℃復(fù)溫1-2分鐘，放置在室溫冷卻1分鐘，使液體石蠟油凝固。

步驟2)去掉pcr擴(kuò)增管上的覆蓋膜，直接加入10μl核酸釋放劑和20μl待測樣品，蓋好八聯(lián)管蓋、顛倒混勻3-5次，避光放置5-10分鐘。

步驟3)將pcr擴(kuò)增管置于干熱器72℃復(fù)溫1-2分鐘，倒置將管底液體輕輕彈下，使管底核酸釋放劑和樣本與底部pcr反應(yīng)液徹底混勻，

步驟4)瞬間離心，直接進(jìn)行熒光定量pcr。其中熒光定量pcr反應(yīng)程序?yàn)?7℃，2min；95℃，15分鐘；然后進(jìn)行45～50循環(huán)的95℃，15秒鐘和60℃，45秒鐘；在60℃檢測熒光信號。

步驟5)結(jié)果分析。根據(jù)試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品的ct值，對待測樣品中的病毒量進(jìn)行準(zhǔn)確定值。

作為優(yōu)選，所述待測樣品包括但不限于血清、血漿或尿液等，優(yōu)選為血清或血漿。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)高效、快捷的檢測樣本中ebv病毒含量，根據(jù)ebv病毒的基因組序列，設(shè)計(jì)了該病毒的特異性引物和探針。同時，為了監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程是否得當(dāng)，本發(fā)明還納入了非質(zhì)粒型內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)選自非人源性病毒序列，不會對標(biāo)本造成污染，且能穩(wěn)定表達(dá)于整個實(shí)驗(yàn)過程。為了有效縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，減少外界環(huán)境對實(shí)驗(yàn)造成的污染，本發(fā)明創(chuàng)造性的將核酸擴(kuò)增試劑預(yù)先分裝到pcr擴(kuò)增八聯(lián)管中，并用熔點(diǎn)低于42℃的石蠟油將其封閉在管底。在使用時只需加入核酸釋放劑與待測樣品即可。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本方法不僅可以縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，且能對樣品中的ebv病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量。特異性引物可同時擴(kuò)增待測樣品或配置的標(biāo)準(zhǔn)品，都能精準(zhǔn)特異的反應(yīng)樣品中的病毒含量，并互不發(fā)生干擾。

本發(fā)明提供了一種樣本直接加入的ebvdna一步法測定試劑盒。作為優(yōu)選，本發(fā)明試劑盒包括了ebv病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，可用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對標(biāo)本中的病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的方法檢測ebvdna的結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的方法檢測ebvdna的結(jié)果圖；

圖3為利用本發(fā)明方法檢測ebvdna的敏感性結(jié)果圖；

圖4為利用本發(fā)明方法檢測ebvdna的重復(fù)性結(jié)果圖；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種樣本直接加入的ebvdna一步法測定試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。需要特別指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明，并且相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍的基礎(chǔ)上對本文所述內(nèi)容進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“核酸釋放劑”又名“裂解液”，即“l(fā)ysisbuffer”，是指為了使樣品中的核酸游離在裂解體系中所需加入的一種配制液體。

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

以下實(shí)施例中所用的pcr擴(kuò)增儀器為上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的實(shí)時熒光定量pcr儀。待測樣本采用經(jīng)臨床化驗(yàn)測定的ebvdna血清樣品及ebv標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。

實(shí)施例1：ebv實(shí)時熒光定量pcr檢測

將臨床診斷明確且經(jīng)過檢測ebvdna定量值為1×10²iu/ml的患者血清樣本按照如下步驟進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr檢測。

(1)eb病毒及內(nèi)標(biāo)特異性引物及探針的設(shè)計(jì)

用于檢測ebv及內(nèi)標(biāo)(ic)的引物和探針序列如下：

ebv-f：5’-cccgtcacggtgacgtagtctgtct-3’(seqidno：1)

ebv-r：5’-ctagcaaaacctctagggca-3’(seqidno：2)

ebv-probe：5’-hex-tagacactgcaaaacctcaggacctac-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述eb病毒的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cccgtcacggtgacgtagtctgtcttgaggagatgtagacttgtagacactgcaaaacctcaggacctacgctgccctagaggttttgctag(seqidno：7)；由上述內(nèi)標(biāo)(ic)的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagtcgttggatg(seqidno：8)。其中，ebv及內(nèi)標(biāo)ic的5’端標(biāo)記了不同的熒光探針報告集團(tuán)，其中ebv的熒光探針報告集團(tuán)為hex，猝滅集團(tuán)為bhq1；內(nèi)標(biāo)(ic)的熒光探針報告集團(tuán)為fam，猝滅集團(tuán)為bhq2。

(2)病毒核酸的提取及實(shí)時熒光定量pcr

步驟1)將預(yù)先包裝好核酸擴(kuò)增試劑的pcr擴(kuò)增管，置于干熱器43℃復(fù)溫1-2分鐘，放置在室溫冷卻1分鐘，使液體石蠟油凝固。

步驟2)去掉pcr擴(kuò)增管上的覆蓋膜，直接加入10μl核酸釋放劑和20μl待測樣品，蓋好八聯(lián)管蓋、顛倒混勻3-5次，避光放置5-10分鐘。

步驟3)將pcr擴(kuò)增管置于干熱器72℃復(fù)溫1-2分鐘，倒置將管底液體輕輕彈下，使管底核酸釋放劑和樣本與底部pcr反應(yīng)液徹底混勻，

步驟4)瞬間離心，直接進(jìn)行熒光定量pcr。其中熒光定量pcr反應(yīng)程序?yàn)?7℃，2min；95℃，15分鐘；然后進(jìn)行45～50循環(huán)的95℃，15秒鐘和60℃，45秒鐘；在60℃檢測熒光信號。

步驟5)結(jié)果分析。根據(jù)試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品的ct值，對待測樣品中的病毒量進(jìn)行準(zhǔn)確定值。

其中，所述ebv-pcr反應(yīng)液具體組成成分如下：pcrmastermix20ul，5umebv-f0.5ul，5umebv-r0.5ul，5umebv-probe0.5ul，5umic-f0.5ul，5umic-r0.5ul，5umic-probe0.5ul及ddh2o5.5ul。

其中，所述pcrmastermix組成成分包括：500mmtris-hcl(ph8.0)、500mmkcl、15mmmgcl2及10mmdntps。

其中，所述核酸釋放劑的組成包括：0.2n氫氧化鈉、0.3m氯化鉀、5mmedta、0.01％n-月桂酰肌氨酸鈉、0.3tris-hcl和1％曲通x-100中的一種或多種。

(3)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，按照本實(shí)例的檢測方法，可以有效準(zhǔn)確檢測出ebvdna定量值為1×10²iu/ml的ebv患者血清標(biāo)本。

實(shí)施例2：ebv實(shí)時熒光定量pcr檢測

將臨床診斷明確且經(jīng)過檢測ebvdna定量值為1×10²iu/ml的患者血清樣本按照如下步驟進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr檢測。

(1)eb病毒及內(nèi)標(biāo)特異性引物及探針的設(shè)計(jì)

用于檢測ebv及內(nèi)標(biāo)(ic)的引物和探針序列如下：

ebv-f：5’-cccgtcacggtgacgtagtctgtct-3’(seqidno：1)

ebv-r：5’-ctagcaaaacctctagggca-3’(seqidno：2)

ebv-probe：5’-hex-tagacactgcaaaacctcaggacctac-bhq1-3’(seqidno：3)

ic-f：5’-cagcgaaggccgaaaaga-3’(seqidno：4)

ic-r：5’-catccaacgaactcaccactgt-3’(seqidno：5)

ic-probe：5’-fam-agccatgcccttagtag-bhq2-3’(seqidno：6)

由上述eb病毒的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cccgtcacggtgacgtagtctgtcttgaggagatgtagacttgtagacactgcaaaacctcaggacctacgctgccctagaggttttgctag(seqidno：7)；由上述內(nèi)標(biāo)(ic)的引物及探針擴(kuò)增出的dna序列為：cagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggactagcaaattgaggggggtagcaacagtggtgagtcgttggatg(seqidno：8)。其中，ebv及內(nèi)標(biāo)ic的5’端標(biāo)記了不同的熒光探針報告集團(tuán)，其中ebv的熒光探針報告集團(tuán)為hex，猝滅集團(tuán)為bhq1；內(nèi)標(biāo)(ic)的熒光探針報告集團(tuán)為fam，猝滅集團(tuán)為bhq2。

(2)病毒核酸的提取及實(shí)時熒光定量pcr

步驟1)將預(yù)先包裝好核酸擴(kuò)增試劑的pcr擴(kuò)增管，置于干熱器43℃復(fù)溫1-2分鐘，放置在室溫冷卻1分鐘，使液體石蠟油凝固。

步驟2)去掉pcr擴(kuò)增管上的覆蓋膜，直接加入10μl核酸釋放劑和20μl待測樣品，蓋好八聯(lián)管蓋、顛倒混勻3-5次，避光放置5-10分鐘。

步驟3)將pcr擴(kuò)增管置于干熱器72℃復(fù)溫1-2分鐘，倒置將管底液體輕輕彈下，使管底核酸釋放劑和樣本與底部pcr反應(yīng)液徹底混勻，

步驟4)瞬間離心，直接進(jìn)行熒光定量pcr。其中熒光定量pcr反應(yīng)程序?yàn)?7℃，2min；95℃，15分鐘；然后進(jìn)行45～50循環(huán)的95℃，15秒鐘和60℃，45秒鐘；在60℃檢測熒光信號。

步驟5)結(jié)果分析。根據(jù)試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品的ct值，對待測樣品中的病毒量進(jìn)行準(zhǔn)確定值。

其中，所述ebv-pcr反應(yīng)液具體組成成分如下：pcrmastermix20ul，5umebv-f0.5ul，5umebv-r0.5ul，5umebv-probe0.5ul，5umic-f0.5ul，5umic-r0.5ul，5umic-probe0.5ul及ddh2o5.5ul。

其中，所述pcrmastermix組成成分包括：500mmtris-hcl(ph8.0)、500mmkcl、15mmmgcl2及10mmdntps。

其中，所述核酸釋放劑的組成包括：0.4n氫氧化鈉、0.6m氯化鉀、5mmedta、0.05％n-月桂酰肌氨酸鈉、0.6tris-hcl和2％曲通x-100中的一種或多種。

(3)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，按照本實(shí)例的檢測方法，可以有效準(zhǔn)確檢測出ebvdna定量值為1×10²iu/ml的ebv患者血清標(biāo)本。

實(shí)施例3：本發(fā)明實(shí)時熒光定量pcr檢測的敏感性及內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定性測試

用ebvdna為陰性的血清樣本作為稀釋液，將臨床診斷明確且經(jīng)過檢測ebvdna定量值為1×10⁶iu/ml的患者樣本進(jìn)行稀釋，獲得ebvdna濃度為50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的樣品將其用于敏感性測試。利用與實(shí)施例1相同的方法對上述樣品進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：從右至左的實(shí)性曲線依此代表濃度為50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×i0⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的樣品。結(jié)果表明，本發(fā)明可檢測出濃度范圍在50iu/ml～1×10⁶iu/ml的ebvdna樣品，同時表明本發(fā)明方法的靈敏度可低至50iu/ml。虛性曲線為內(nèi)標(biāo)，從低至高的各種ebv病毒濃度的內(nèi)標(biāo)的ct值均在33左右，說明內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定表達(dá)不受病毒濃度的影響。

實(shí)施例4：本發(fā)明實(shí)時熒光定量pcr檢測的重復(fù)性測試及變異系數(shù)分析

用ebvdna為陰性的血清樣本作為稀釋液，將臨床診斷明確且經(jīng)過檢測ebvdna定量值為1×10⁶iu/ml的ebv患者血清進(jìn)行稀釋，獲得ebvdna濃度為50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×i0⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的樣品。將其用于重復(fù)性測試。利用與實(shí)施例1相同的方法對上述樣品分別進(jìn)行3復(fù)孔檢測。觀察檢測的重復(fù)性及變異系數(shù)。同時用市面上出售的ebv檢測商品試劑盒對樣品進(jìn)行檢測，比對兩種方法的重復(fù)性及變異系數(shù)。

結(jié)果如圖4和表1所示，圖4為應(yīng)用本發(fā)明對濃度為50iu/ml、1×10²iu/ml、1×10³iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10⁵iu/ml、1×10⁶iu/ml的樣品進(jìn)行重復(fù)性檢查，如圖4所示，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好，各濃度曲線基本在同一ct值處。另外，各濃度所對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)曲線，如圖4虛線所示亦表達(dá)穩(wěn)定，ct值在33左右。表1為將本發(fā)明及市面上出售的ebv檢測試劑盒對1×10⁶iu/ml、1×10⁴iu/ml、1×10²iu/ml各濃度標(biāo)本進(jìn)行3復(fù)孔重復(fù)檢測，觀察ct值并計(jì)算cv(％)。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測各濃度ct值均優(yōu)于市面上出售的ebv檢測試劑盒的各濃度ct值，在1×10⁶iu/ml、1×10⁴iu/ml兩個濃度的變異系數(shù)與市面上出售的ebv檢測試劑盒無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而本發(fā)明在1×10²iu/ml濃度的變異度顯著優(yōu)于市面上出售的ebv檢測試劑盒的變異度。從而得出結(jié)論：本發(fā)明方法的檢測重復(fù)性及變異系數(shù)優(yōu)于市面上出售的ebv檢測試劑盒。

表1ebvdna實(shí)時熒光定量pcr檢測的重復(fù)性測試及變異系數(shù)分析結(jié)果

以上所述的市面上出售的ebv檢測試劑盒適用于尿液、血清樣本。其操作步驟如下：

(1)取100ul血清樣本，加入等體積的濃縮液，12000rpm離心5min。

(2)棄上清，往沉淀中加入50ul核酸釋放劑。

(3)用移液槍挑起沉淀吸打混勻。

(4)每個pcr反應(yīng)管中加入上述處理的后的待測樣本。

(5)靜置10min后，每管加入pcr反應(yīng)液40ul，吸打混勻后蓋上管蓋并2000rpm離心30s。

(6)pcr擴(kuò)增。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。