本發(fā)明屬于動物傳染病學領域，具體涉及一組區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的實時熒光定量pcr引物。

背景技術：

禽流感（avianinfluneza，ai）是由a型流感病毒引起的、主要侵害家禽及野鳥的一種急性、高度接觸性傳染病。高致病性h5亞型禽流感病毒（h5subtypeavianinfluenzavirus,h5aiv）引起的感染目前被世界動物衛(wèi)生組織（oie）列為必須報告的動物傳染病，在我國被列為一類動物疫病。

關于流感的最早記錄可追溯到1878年來自意大利的一次報道，隨后世界各地陸續(xù)發(fā)生流感的暴發(fā)和流行。1996年，在我國分離到的第一株h5n1亞型hpaiv（a/goose/guangdong/1/96（h5n1），gs/gd/96），緊接著香港于1997年發(fā)生h5n1亞型禽流感病毒直接感染人事件，這是第一個禽源流感病毒未經(jīng)中間宿主而直接感染人的證據(jù)。由于從祖源病毒gs/gd/96進化出多個譜系且命名不統(tǒng)一，為此who、fao和oie聯(lián)合制定了h5n1hpaiv統(tǒng)一分類準則，將h5n1hpaiv分為0~9共計10個不同clade。其中clade2.3.4最早于2003~2006年間流行于中國、越南、泰國、老撾和馬來西亞等地的病毒株，2006~2009年clade2.3.4分支在我國很多地區(qū)是優(yōu)勢流行株；而2010年后逐漸被clade2.3.2.1分支取代，但clade2.3.4分支依然在我國很多地區(qū)流行,并存在兩種病毒共存的現(xiàn)象。針對clade2.3.4分支我國已選取a/duck/anhui/1/2006毒株為ha和na的供體，研制出re-5株疫苗，同時以a/duck/guangdong/s1322/2006為ha和na基因供體研制re-6株疫苗來控制clade2.3.2.1分支病毒的流行。對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行鑒別診斷有助于指導h5aiv相應疫苗的科學使用。

然而，clade2.3.2.1和clade2.3.4二者之間的ha基因序列核苷酸同源率高達94.3%（以經(jīng)典毒株的同源率為例），很難通過常規(guī)的分子生物學方法（如常規(guī)rt-pcr方法）進行鑒別。

本發(fā)明的一組區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的實時熒光定量pcr引物僅需1組引物對（2條引物）即可有效對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行有效區(qū)分。該引物根據(jù)clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因（ha）所存在的特征性核苷酸序列差異來設計；利用實時熒光定量pcr反應后生成的熔解曲線的tm值和其gc含量正相關的特點，通過觀察clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv經(jīng)該組引物進行實時熒光定量pcr擴增反應后的熔解曲線tm值差異，即可精確對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染情況進行準確鑒別診斷，相關研究尚未見國內(nèi)外文獻報道，本發(fā)明可填補相關領域空白。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的實時熒光定量pcr引物及其應用，該引物能有效區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染（或共感染），為科學防控h5aiv提供技術保證。

本發(fā)明根據(jù)clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因（ha）存在特征性的核苷酸序列差異來設計一組實時熒光定量pcr引物。利用該擴增區(qū)域clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因（ha）存在的核苷酸gc含量差異，通過建立基于evagreen的實時熒光定量pcr方法對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因（ha）進行實時熒光定量pcr擴增反應，獲得的熔解曲線存在不同的熔解溫度（tm值）差異；根據(jù)熔解曲線tm值差異可直接對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染情況進行鑒別診斷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一組區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的實時熒光定量pcr引物f1/r1，其核苷酸序列為：

上游引物f1：5’-aacccaatgtgtgacgaat-3’；

下游引物r1：5’-ttgaaattccctgggtaaca-3’。

通過所述引物建立基于evagreen的實時熒光定量pcr方法，根據(jù)該引物擴增的clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因（ha）所存在的核苷酸特征性差異——gc含量差異，可導致實時熒光定量pcr反應擴增反應后的生成的熔解曲線存在不同的熔解溫度（tm值）的特點，可直接對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染進行鑒別。

具體包括以下步驟：

（1）設計并合成上述特異性引物對f1/r1；

（2）病毒rna提取：從檢測樣品中分別提取clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的rna；

（3）rt-pcr擴增：設計并合成h5aiv血凝素基因ha特異性引物對h5-haf/h5-har對提取的病毒rna進行rt-pcr擴增，獲得其ha基因序列；將rt-pcr擴增的目的片段進行膠回收并純化后，克隆到t載體上，獲得含有clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的血凝素基因ha的陽性重組質(zhì)粒（t-clade2.3.4-1和t-clade2.3.2.1-1），測定其od值計算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實時熒光定量pcr反應的標準品。

所用h5aiv血凝素基因ha特異性引物對h5-haf/h5-har的核苷酸序列為：

h5-haf:5’-tggttaccatgcaaacaac-3’；

h5-har:5’-ttacactttccatacattcattatc-3’。

（4）實時熒光定量pcr：用所述實時熒光定量引物對f1/r1對陽性重組質(zhì)粒t-clade2.3.4-1和t-clade2.3.2.1-1進行evagreen實時熒光定量pcr擴增，反應完成后獲得相應的擴增曲線，并生成evagreen實時熒光定量pcr擴增的熔解曲線。

（5）病毒感染情況判斷：實時熒光定量pcr反應結(jié)束后，通過觀察擴增曲線判斷是否存在clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染；通過觀察溶解曲線其tm值差異可對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行鑒別。

其中，本發(fā)明所設計的實時熒光定量pcr引物對f1/r1滿足如下要求：

（1）特異性強：該實時熒光定量pcr引物在針對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因ha核苷酸序列進行分析后保守的區(qū)域設計，對二者均具有高特異性，達到僅需一組引物便能對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行擴增的目的。即觀察實時熒光定量pcr反應后的擴增曲線即可判斷是否感染clade2.3.4或clade2.3.2.1h5aiv。

（2）兩種病毒的擴增區(qū)域gc含量不同：該組引物擴增的血凝素基因ha在clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv中存在核苷酸序列gc含量差異?；趯崟r熒光定量pcr反應生成的熔解曲線的tm值差異（該差異和核苷酸序列的gc含量差異正相關），即可通過觀察實時熒光定量pcr反應后的熔解曲線對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染進行判斷（可有效區(qū)分是clade2.3.4h5aiv還是clade2.3.2.1h5aiv）。

其中，所述的步驟（5）的病毒感染情況判斷方法如下：

若在tm=（83.56±0.08）℃出現(xiàn)單一的特異性tm峰判為clade2.3.4h5aiv陽性；

若在tm=（82.72±0.11）℃出現(xiàn)單一的特異性tm峰判為clade2.3.2.1h5aiv陽性；

若在tm=（83.56±0.08）℃以及tm=（82.72±0.11）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv雙重感染；

其他情況均判為陰性。

本發(fā)明所設計的實時熒光定量pcr引物對f1/r1可用于制備區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染的試劑盒。

本發(fā)明的有益效果：鑒定方法簡單，效率和準確率較高。使用本研究提供的一組實時熒光定量pcr引物對前期分離的2株clade2.3.4h5aiv和2株clade2.3.2.1h5aiv進行實時熒光定量pcr檢測，均和預期相符。且僅需1組引物對（2條引物）即可有效對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行有效區(qū)分。

附圖說明

圖1為clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv血凝素基因ha引物設計區(qū)及核苷酸序列特征性差異圖。

圖2引物f1/r1對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行實時熒光定量pcr反應的擴增曲線：f1/r1對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv病毒感染結(jié)果的判斷須在擴增成功的前提下做出，若擴增失敗，則不可依據(jù)熔解曲線做出感染類型判斷；若拷貝數(shù)相同，則clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv擴增曲線一致。

圖3引物對f1/r1對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行實時熒光定量pcr反應的熔解曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。

實施例1

1、毒株：

h5亞型流感病毒clade2.3.4分支（cx1株）和clade2.3.2.1分支（dy1株）均由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

2、引物設計與合成

根據(jù)clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的血凝素基因ha核苷酸特征性差異區(qū)設計實時熒光定量pcr反應的引物f1和r1，其中f1和r1引物序列為：

上游引物f1：5’-aacccaatgtgtgacgaat-3’

下游引物r1：5’-ttgaaattccctgggtaaca-3’。

3、病毒rna提取以及rt-pcr擴增：

以常規(guī)方法提取clade2.3.4分支（cx1株）和clade2.3.2.1分支（dy1株）h5aiv的病毒rna。利用針對h5aiv血凝素基因ha設計特異性引物（h5-haf:5’-tggttaccatgcaaacaac-3’和h5-har:5’-ttacactttccatacattcattatc-3’）對提取的病毒rna進行rt-pcr擴增，獲得其ha基因編碼區(qū)序列；將rt-pcr擴增的目的片段進行膠回收后純化后，克隆到t載體上，獲得含有clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的血凝素基因ha的陽性重組質(zhì)粒（t-clade2.3.4-1和t-2.3.2.1-2），測定其od值計算出拷貝數(shù)后，連續(xù)倍比稀釋，作為實時熒光定量pcr反應的標準品。

4、實時熒光定量pcr反應：

優(yōu)化出的20μl最佳反應體系為體系：evagreen10μl，濃度為10μmol/l的f1、r1各0.2μl、模板2μl、水補足至20μl。最佳反應條件為：95℃，2min預變性；95℃10s，60℃15s，共40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，根據(jù)條件做出對應的熔解曲線。

5、病毒感染情況判斷：

實時熒光定量pcr反應結(jié)束后，觀察擴增曲線，判斷建立的方法有無特異性擴增（沒有擴增曲線，熔解曲線的檢測結(jié)果沒有意義）。實時熒光定量pcr反應結(jié)束后做出的熔解曲線，直接在和實時熒光定量pcr儀器連接的電腦上，利用實時熒光定量pcr對應的軟件進行分析（可直接肉眼觀察），對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv感染情況進行判斷，判斷方法為：

若在tm=（83.56±0.08）℃出現(xiàn)單一的特異性tm峰判為clade2.3.4h5aiv陽性；

若在tm=（82.72±0.11）℃出現(xiàn)單一的特異性tm峰判為clade2.3.2.1h5aiv陽性；

若在tm=（83.56±0.08）℃以及tm=（82.72±0.11）℃出現(xiàn)雙峰，則判斷為clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv雙重感染；

其他情況均判為陰性。

從圖3可以看出，引物對f1/r1對兩株病毒血凝集素基因（ha）片段擴增特異性強，且二者的tm值存在差異，可有效區(qū)分兩株病毒。試驗結(jié)果表明，使用本研究提供的一組實時熒光定量pcr引物對前期分離的2株clade2.3.4h5aiv和2株clade2.3.2.1h5aiv進行實時熒光定量pcr檢測，均和預期相符。且僅需1組引物對（2條引物）即可有效對clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv進行有效區(qū)分。

實施例2

對臨床送檢的41份死亡鴨病料經(jīng)處理后進行實時熒光定量pcr檢測后發(fā)現(xiàn)，clade2.3.4h5aiv感染陽性有2株，陽性率為4.87%（2/41）；clade2.3.2.1h5aiv感染陽性有3株，陽性率為7.31%（3/41）；未檢測到臨床送檢的41份死亡鴨存在clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv共感染現(xiàn)象。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>區(qū)分clade2.3.4和clade2.3.2.1h5aiv的實時熒光定量pcr引物

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