本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及tmem104基因在制備治療椎間盤退行性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：椎間盤退行性疾病是指椎間盤組織在多種原因綜合作用下發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的生物化學(xué)變化，引起老化加速、椎間盤力學(xué)特性改變，使臨近骨關(guān)節(jié)、韌帶發(fā)生相應(yīng)變化，造成脊柱不穩(wěn)，壓迫脊髓、神經(jīng)根、動(dòng)脈，引起相應(yīng)臨床癥狀和體征的綜合征。它包括椎間盤源性腰痛、椎間盤突出癥、退行性脊椎不穩(wěn)癥、退行性椎管狹窄癥、退行性滑脫癥等，是臨床上常見疾病之一。其病因尚不清楚，目前普遍認(rèn)為椎間盤退行性疾病的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，近年來，人們逐漸意識(shí)到遺傳易感性即遺傳因素對(duì)于揭示椎間盤退行性疾病發(fā)病的重要作用。目前椎間盤退行性疾病一般采取保守治療，即從保守治療依次到微創(chuàng)、常規(guī)手術(shù)治療、非融合固定治療、融合固定治療的階梯。越是高級(jí)階梯的治療，創(chuàng)傷越大，對(duì)機(jī)體自然解剖狀態(tài)的干預(yù)越大，每一高級(jí)階梯的治療可作為對(duì)相對(duì)低級(jí)階梯治療的補(bǔ)救措施。對(duì)患者采取的治療方案要根據(jù)患者病情所處的階段，同時(shí)也要考慮到患者個(gè)體因素，如創(chuàng)傷、風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用以及患者的意愿。但是無論哪種手術(shù)方式，均不能在椎間盤退變的早期進(jìn)行有效地干預(yù)，不能延緩或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。開放手術(shù)(椎間盤切除融合內(nèi)固定術(shù))雖能較為徹底的切除退變椎間盤，但手術(shù)創(chuàng)傷大，費(fèi)用高，內(nèi)固定限制了脊柱的活動(dòng)度，加速鄰近節(jié)段椎間盤的退變。微創(chuàng)手術(shù)不能徹底切除退變椎間盤組織，術(shù)后癥狀可能不能完全緩解，術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性較大。tmem104基因(transmembraneprotein104，跨膜蛋白104)，在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)基因庫(kù)的參考序列為nm_001321264.1，位于人類染色體17q25.1，是蛋白編碼基因，參與氨基酸運(yùn)輸。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)椎間盤退行性疾病的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測(cè)椎間盤退行性疾病的產(chǎn)品。本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測(cè)椎間盤退行性疾病的試劑盒。本發(fā)明的目的之三在于提供tmem104基因在制備治療椎間盤退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)椎間盤退行性疾病的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測(cè)組織樣本中tmem104基因或其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平來診斷椎間盤退行性疾病。優(yōu)選地，所述tmem104基因或其表達(dá)產(chǎn)物在椎間盤退行性疾病組織中表達(dá)上調(diào)。優(yōu)選地，所述的檢測(cè)包括基因水平的檢測(cè)和蛋白水平的檢測(cè)，所述基因水平檢測(cè)包括rt-pcr法、實(shí)時(shí)定量pcr法、基因芯片法和高通量測(cè)序法；所述蛋白水平的檢測(cè)包括免疫組化、膠體金法、elisa法和westernblot法。優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量pcr法包括sybrgreen法和taqman探針法。優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒或試劑。優(yōu)選地，所述試劑盒可以是檢測(cè)tmem104基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑盒，如qpcr試劑盒，也可以是檢測(cè)tmem104蛋白的表達(dá)水平的試劑盒，如elisa試劑盒；所述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能夠檢測(cè)tmem104基因的表達(dá)水平；所述試劑包括tmem104的特異性引物和tmem104基因表達(dá)蛋白的特異性抗體。優(yōu)選地，所述elisa試劑盒除包含與tmem104蛋白特異性結(jié)合的抗體之外，還包含包被緩沖液、洗滌液、封閉液、加樣緩沖液、反應(yīng)終止液、目的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)選地，所述與tmem104蛋白特異性結(jié)合的抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。上述抗體可以從商業(yè)途徑獲取，也可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備。例如，將純化的人tmem104蛋白或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人tmem104蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備。tmem104蛋白的抗體包括可以阻抑tmem104蛋白功能的抗體，也可以是不影響人tmem104蛋白功能的抗體。優(yōu)選地，所述包被緩沖液為磷酸鹽緩沖液pbs，其成分為140mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，1.8mmkh2po4，ph值為7.4。優(yōu)選地，洗滌液為含1％tween-20的pbs，稱為pbst，其成分為pbs，1％tween-20。優(yōu)選地，封閉液為含1％bsa的pbs，其成分為pbs，1％bsa。優(yōu)選地，加樣緩沖液的成分為50mmtris-hcl，0.5mkcl，1％bsa，0.05％tween-20，ph值為8.4。優(yōu)選地，反應(yīng)終止液成分為2mh2so4。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)椎間盤退行性疾病的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)組織樣品提取總rna試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)定量pcr試劑。優(yōu)選地，組織樣品提取總rna試劑包括trizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括：5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、superrt逆轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、dntps、oligodtprimer(或random6mers)和rnasefreedh2o。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mmph8.3的tris-hcl，375mm的kcl，15mm的mgcl2，50mm的dtt。優(yōu)選地，所述定量pcr試劑包括特異性擴(kuò)增tmem104基因的引物組以及特異性捕獲tmem104基因的熒光探針。優(yōu)選地，所述的引物組包括如seqidno:2所示核苷酸序列的上游引物和如seqidno:3所示核苷酸序列的下游引物，所述熒光探針為如seqidno:4所示核苷酸序列。優(yōu)選地，所述定量pcr試劑還包括pcr緩沖液、dntp、taq酶。優(yōu)選地，所述試劑盒含有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。優(yōu)選地，所述陽性對(duì)照為正常的椎間盤髓核組織rna或dna，所述陰性對(duì)照為ddh2o。優(yōu)選地，所述pcr緩沖液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供tmem104基因在制備治療椎間盤退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述藥物包括促進(jìn)椎間盤退行性疾病細(xì)胞增殖的藥物和抑制椎間盤退行性疾病細(xì)胞凋亡的藥物。優(yōu)選地，所述藥物包括通過干擾rna抑制tmem104基因表達(dá)的sirna或用于抑制tmem104蛋白活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，所述rna干擾(rnainterference，rnai)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)誘發(fā)的、同源mrna高效特異性降解的現(xiàn)象。使用rnai技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和許多疾病的基因治療領(lǐng)域中。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的rnai篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類型都能使用rnai方法，并且相對(duì)較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達(dá)。優(yōu)選地，所述sirna包括如seqidno:8和seqidno:9所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括(但并不限于)：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。優(yōu)選地，所述藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型，包括但不限于，片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。優(yōu)選地，所述藥物還可與其他治療椎間盤退行性病變的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提高治療的成功率。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種椎間盤退行性疾病診斷分子標(biāo)記物tmem104基因，并進(jìn)一步證實(shí)tmem104基因表達(dá)水平在椎間盤退行性疾病組織中表達(dá)上調(diào)。因此，利用tmem104基因檢測(cè)椎間盤退行性疾病不僅能夠快速有效的做到早期診斷，其精確度大大提高。本發(fā)明還通過干擾髓核細(xì)胞中tmem104基因的表達(dá)可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，因此，tmem104基因?yàn)樽甸g盤退行性疾病的基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)tmem104基因在椎間盤退行性疾病髓核組織中的表達(dá)情況；圖2實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)sirna-tmem104對(duì)椎間盤退行性疾病髓核細(xì)胞中tmem104基因表達(dá)的影響；圖3利用cck-8法檢測(cè)tmem104基因?qū)λ韬思?xì)胞增殖的影響。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的技術(shù)方案主要包括：利用高通量測(cè)序方法對(duì)15例椎間盤退行性疾病患者的髓核組織樣本tmem104基因的水平與6例對(duì)照樣本的髓核組織中進(jìn)行差異比較。采用taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法驗(yàn)證tmem104基因在椎間盤退行性疾病患者髓核組織中的表達(dá)情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，椎間盤退行性病變發(fā)生的一個(gè)重要的生理特征在于髓核細(xì)胞的增殖減緩、衰老加快、凋亡加劇，利用rna干擾技術(shù)使體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中tmem104基因沉默，進(jìn)一步檢測(cè)髓核細(xì)胞增殖和凋亡情況。本發(fā)明所述“tmem104基因”包括以下核酸序列：(a)具有seqidno：1的核酸序列的核酸，(b)關(guān)于(a)的核酸的簡(jiǎn)并核酸，和(c)與(a)或(b)的核酸至少98％或至少99％同一的核酸。實(shí)施例1篩選與椎間盤退行性疾病相關(guān)的基因標(biāo)志物1、樣本收集取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科收集15例椎間盤退行性疾病患者作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組來源于同時(shí)期骨科住院的其他疾病患者，共收集6例。上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。獲取所有研究對(duì)象椎間盤髓核組織，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、對(duì)髓核組織進(jìn)行總rna提取采用reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本rna提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把髓核組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入depc處理過的水溶解沉淀；⑥用nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量rna純度及濃度，凍存于-80℃。rna質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：rna樣本的od260/od280值為1.7-2.2之間；總rna電泳圖譜有清晰的28s、18s條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、rna樣品的質(zhì)量分析rna提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的rna樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過nanodrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品的提取情況，rna-seq測(cè)序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。4、高通量測(cè)序測(cè)序平臺(tái)為illumina公司的hiseq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用fast-qc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，gc含量，pcrduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的fpkm值，采用國(guó)際公認(rèn)算法ebseq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，log2fc>1或<-1,fdr<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了geneontology和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異性表達(dá)基因tmem104，該基因在髓核組織樣本中表達(dá)上調(diào)。實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證椎間盤退行性疾病患者tmem104基因的表達(dá)情況1、材料按照實(shí)施例1的樣本收集方式收集10例椎間盤退行性疾病患者髓核組織及8例對(duì)照髓核組織，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。2、方法2.1對(duì)髓核組織進(jìn)行總rna提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄采用rtreagentkit(takara，貨號(hào)drr037a)進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄。采用10μl反應(yīng)體系：5xprimerscriptbuffer2μl、primescriptrtenzymemixi0.5μl、oligodtprimer0.5μl、random6mers2μl、rna模板為0.5μg和rnasefreedh2o補(bǔ)至10μl。獲得的cdna保存放-20℃冰箱備用。2.3taqmanpcr利用abiprimerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)管家基因(actin)和目的基因(tmem104，nm_001321264.1)的熒光定量擴(kuò)增引物及探針，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物和探針序列如表1所示：表1引物和探針序列表用probeqpcrmix(toyobo)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。熒光定量pcr反應(yīng)體系如下：thunderbirdprobeqpcrmix：12.5ul，引物(10μm)：正、反向引物各0.8ul，taqmanprobe(10μm)：0.4ul，roxreferencedye(50×)：0.5ul，rnase-freedh2o：8ul，模板cdna：2ul，總體系25ul。反應(yīng)程序在abi7500上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40個(gè)循環(huán)。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，基線平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；采用2-δδct法分析結(jié)果，比較tmem104基因在椎間盤退行性疾病患者髓核組織和對(duì)照組髓核組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中tmem104基因在椎間盤退行性疾病組織表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，約是對(duì)照組的3.5倍，具體見圖1，以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量測(cè)序分析的結(jié)果。實(shí)施例3rnai干擾椎間盤退行性疾病患者髓核細(xì)胞中tmem104表達(dá)一、細(xì)胞培養(yǎng)(1)將獲取的髓核組織在無菌條件下用d-hanks(華邁科，貨號(hào)hmk03230)液沖洗3次。(2)用剪刀將髓核組織剪碎(約1mm3大小)，置于無菌離心管中。(3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min搖動(dòng)一次。(4)800rpm離心5min，棄去上清液。(5)0.2％ⅱ型膠原酶37℃消化4h，用200目篩網(wǎng)過濾。(6)濾液以800rpm離心5min，棄去上清液。(7)dmem/f12培養(yǎng)基沖洗，800rpm離心5min，重復(fù)3次。(8)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶，含10％體積胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基作為養(yǎng)液，于37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二、sirna設(shè)計(jì)與合成依據(jù)在線設(shè)計(jì)軟件sidirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根據(jù)基因序列參照ncbi:nm_001321264.1(tmem104)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的sirna，具體序列見表2。設(shè)計(jì)后送往公司合成。表2sirna序列列表三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染1、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按照lipofectaminetm2000transfectionreagent提供的步驟進(jìn)行。(1)將5×104細(xì)胞接種在6孔板上，這些用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70％；(2)準(zhǔn)備質(zhì)粒dna-lipofectaminetm2000復(fù)合物:a.以250μlopti-mem稀釋5μllipofectaminetm2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘；b.實(shí)驗(yàn)各組分別取7.5ulsirna加入250ulopti-memi中進(jìn)行稀釋，并輕輕搖動(dòng)將其混勻；c.孵育5分鐘后，將稀釋的sirna和lipofectaminetm2000混合后在室溫下孵育20分鐘。(3)在培養(yǎng)板中的每個(gè)孔中都加入細(xì)胞、培養(yǎng)基及sirna-lipofectaminetm2000復(fù)合物。然后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，使他們充分混合；(4)轉(zhuǎn)染放置在37℃，co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48小時(shí)。2、利用qpcr檢測(cè)tmem104基因的轉(zhuǎn)錄水平2.1細(xì)胞總rna的提取步驟同實(shí)施例2。2.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。2.3qpcr擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，sirna-tmem104能有效抑制tmem104基因的表達(dá)。實(shí)施例4tmem104對(duì)人椎間盤退行性疾病細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞分組：髓核細(xì)胞加非特異性的sirna組、髓核細(xì)胞加sirna-tmem104組。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞配置成1×104/ml單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入cck-8試劑，2h后用酶標(biāo)儀測(cè)定其450nm波長(zhǎng)吸光度值作為零點(diǎn)。之后分別在12、24、48和72小時(shí)節(jié)點(diǎn)上，每孔加入cck-8試劑10μl溫育2h后，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果如圖3所示，抑制tmem104表達(dá)后，髓核細(xì)胞在0-24小時(shí)細(xì)胞增殖不明顯，但是隨著時(shí)間的增加，在48、72小時(shí)節(jié)點(diǎn)上髓核細(xì)胞增殖率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)施例5tmem104對(duì)人椎間盤退行性疾病細(xì)胞凋亡的影響使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)tmem104基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。3.1步驟按照實(shí)施例3方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72h后，使用預(yù)冷pbs洗滌細(xì)胞，然后用0.25％胰酶消化細(xì)胞，中止消化，將離心收集的細(xì)胞使用pbs重懸，將細(xì)胞定量為1×106個(gè)/ml，取200μl上述細(xì)胞懸液放置到appendorf管中，加入10μlannexin-v-fitc混勻，室溫暗處孵育染色15min，上機(jī)前5min加入10mg/l碘化丙錠(pi)染色5μl。未轉(zhuǎn)染sirna的細(xì)胞分別用annexin-v-fitc和pi染色用于標(biāo)準(zhǔn)定量。用facs流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.3結(jié)果tmem104基因干擾組的細(xì)胞凋亡率為(12.39±0.26)％，陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(42.43±2.13)％，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，上述結(jié)果表明抑制tmem104基因的表達(dá)能明顯抑制髓核細(xì)胞的凋亡。實(shí)施例6試劑盒的制備本實(shí)施例檢測(cè)椎間盤退行性疾病的試劑盒包括以下組成部分：(1)組織樣品提取總rna試劑包括trizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑包括：5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、superrt逆轉(zhuǎn)錄酶、dntps、oligodtprimer、random6mers和rnasefreedh2o，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包含：250mmph8.3的tris-hcl，375mm的kcl，15mm的mgcl2，50mm的dtt。進(jìn)行1次反轉(zhuǎn)錄pcr的用量如表3所示，反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃30min，85℃5min。表3反轉(zhuǎn)錄試劑體系組分加入量5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μloligodtprimer(50μm)0.5μlrandom6mers(100μm)2μlsuperrt逆轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)1μldntps(2.5mm)4μl總rna1μgrnasefreedh2o至20μl(3)定量pcr試劑包括：pcrmix反應(yīng)體系、actin和tmem104的引物和探針。所述pcrmix反應(yīng)體系的組分包含反應(yīng)緩沖液、dntps、rtaqdna聚合酶及抗dna聚合酶抗體的2×預(yù)混液。所述引物和探針見表1所示。進(jìn)行1次定量pcr的用量如表4所示。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40個(gè)循環(huán)。表4定量pcr體系組分加入量pcrmix反應(yīng)體系12.5μl上游引物(10μm)0.5μl下游引物(10μm)0.5μltaqmanprobe(10μm)0.4μl模板cdna2.0μl加入滅菌蒸餾水至25μl試劑盒還包括：陽性對(duì)照為正常的椎間盤髓核組織rna或dna和陰性對(duì)照為ddh2o。一個(gè)試劑盒可以包括上述各成分進(jìn)行多次pcr的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具體量視情況需要而定。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京賽爾得生物技術(shù)有限公司<120>tmem104基因在制備治療椎間盤退行性疾病藥物中的應(yīng)用<130>p16zjp20<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>1803<212>dna<213>基因序列<400>1ggcgcatgcgcgctgcggaagctggtgctggacagctggcgccggcagcagcggaccggc60gggagacggcggcttgggagctggctgtgctgcaggagctgcggcagccgccgtccttgc120acctaaggaacctctgctgccagcccttcctcacttttggaaatggcgggtgaaattaca180gagaccggggaactctactcttcctacgttgggctggtgtacatgtttaacctcatcgtg240ggcacgggcgcactcaccatgcccaaggcattcgccactgccgggtggcttgtcagcctc300gtcctgctggtgttcctgggcttcatgagcttcgtgaccaccacctttgtgatagaggcc360atggctgcagccaacgcgcagctccactggaagaggatggagaacctcaaggaggaggaa420gatgacgactcctccacagcctcagacagcgatgttctcatccgggacaactacgagcgg480gcagagaagcggcccatcctgtctgtgcagagacgtggatctcccaacccgtttgaaatc540acagaccgggtggaaatgggacaaatggcctccatgttcttcaataaagtgggggtcaac600ttgttctatttctgcatcatcgtttacctgtatggagacctcgccatctatgctgctgcc660gtgcccttctccctcatgcaggtgacctgcagcgccactggcaatgactcctgcggtgtg720gaagcagacaccaaatacaatgacactgaccggtgctgggggcccctgcgccgagtggac780gcctaccgcatctacttggcgatcttcactctcctcctcggaccgttcaccttctttgac840gtccagaagaccaagtacctgcagatcctgacctctctgatgagatggatcgatgggccc900ccggggtcagtgatgggaagagcagaagaggatgccagcccagcctggcccaggagcagg960tgtcgttgtggaggaaagcttaaactcaacagcctctacccaacatctgccacctgcatg1020gccccagatgcccccggtgcaggccaggtcaaggtgggagtaaactttctttgcctccct1080ccccacagaagcaccagacccacctgagccccagagcctcatgccagcagctcctggctg1140ttcctcacctgaggctagagcagcagctgccagcttatagatggggcggatggcaggtga1200tagactgggaagcactgctgggtggtggaggtgggcagtggcaccatgacgggcccctag1260ccacacagctgtcctcactacggggcagggagcagcctcggcaacaggcaaaggccagag1320tcagagtggtggggaggacaggggctgctgccccgctcctggaaagccactgcagagggg1380cagtggctggcagtgccaggcctgggggaagtggaagcgtcctgtctgggggcagattcc1440caagcaagggtgacccatggttaagggccactggaaagctggagagagcttgggatccct1500tccacctggggccaatggtgttgattgcagactggaggggtaacctccgctgagggtcat1560tatgtgccaggcatggcattgggtactttctgcattgggaccaggcagccgggcctgcca1620tttgaggcagcgagcctccgtgacctgtcctccctcatttgtaaagtggggtaacagcta1680tgtcactggccagttgtggggattaaagtgctgagcttagtgcccagcccaaaatgctca1740ataaagctattcagtgatacctgtttcccacatcactcaccagccataaaaaaaaaaaaa1800aaa1803<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tggacgcctaccgcatctac20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3tctggacgtcaaagaaggtgaa22<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4tggcgatcttcactctcctcctcgg25<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gatacgaagggagggtgtacca22<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6ctcggccagggtgttgaa18<210>7<211>29<212>dna<213>人工序列<400>7gcttctgatggcaagctctacgtctcctt29<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<400>8aauuucacccgccauuuccaa21<210>9<211>21<212>rna<213>人工序列<400>9ggaaauggcgggugaaauuac21<210>10<211>21<212>rna<213>人工序列<400>10auuuugcgguggaaauguccu21<210>11<211>21<212>rna<213>人工序列<400>11gacauuuccaccgcaaaaugg21當(dāng)前第1頁(yè)12