專利名稱：具有預防和治療退行性疾病和炎性疾病作用的1,2,3,4-四氫異喹啉衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有預防和治療退行性疾病和炎性疾病作用的7-羥 基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉衍生物。
背景技術：
近期的研究顯示炎癥反應成為導致神經(jīng)退行性疾病的一個關鍵機 制。中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在的小膠質細胞、免疫細胞可能被外源性或內源性 物質激活，從而生成和釋放如炎性細胞因子、TNF-a或IL-1卩 一氧化氮 (NO)、前列腺素、過氧化物等物質。雖然它們在短時間內誘發(fā)免疫反應， 但是該物質連續(xù)不斷地生成以至于過量，因此導致鄰近神經(jīng)元損失并最 終導致神經(jīng)退行性疾病。此外，垂死神經(jīng)元釋放的物質誘發(fā)小膠質細胞 的再激活，因而神經(jīng)退行性疾病變得更為嚴重。據(jù)報道，小膠質細胞的 激活關聯(lián)到各種神經(jīng)退行性疾病，例如，阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)、巾白金森病(Parkinson's disease)、亨丁頓舞蹈病(Huntington's disease )、盧伽雷病(Lou Gehrig's disease )、古茲菲德-雅各氏病 (Creutzfelt-Jakob's disease, CJD)等。因此，有人認為抑制激活的小膠質 細胞所釋放的各種炎性物質的生成會對預防和/或治療神經(jīng)退行性疾病 非常有效。這是全世界研究的熱點。
目前，帕金森病的治療集中在通過給予多巴胺前體物L-DOPA減輕 運動障礙。不幸的是，給予L-DOPA可能不會使帕金森病患者過上正常 生活，并且它還會引起身體和精神的各種慢性副作用。此外，還有證據(jù) 表明L-DOPA本身有毒害神經(jīng)的作用?，F(xiàn)在仍幾乎不知道如何治療和預 防帕金森病導致的退化。目前治療阿爾茨海默氏病的藥物方法是基于乙 酰膽堿酯酶抑制劑，或者與此同時，或基于N-甲基-D-天冬氨酸通道阻斷 劑。雖然已經(jīng)試圖研發(fā)各種物質如分泌酶抑制劑，但是還沒對研發(fā)的這 類物質進行臨床試驗。此外，還沒有研究出治療其它神經(jīng)退行性疾病如 盧伽雷病、古茲菲德-雅各氏病和亨丁頓舞蹈病的有效方法。因此，迫切 要求根據(jù)它們的病因研究治療這類疾病更有效的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種新化合物，該化合物誘導激活的小膠質細胞內各種 炎性細胞因子和有毒物質生成的下調。
本發(fā)明還涉及一種新化合物，該化合物預防氧化應激導致的神經(jīng)元 損傷。
本發(fā)明還涉及一種用于合成有效預防和/或治療各種神經(jīng)退行性和 炎性疾病的新化合物的方法。
在一個方面，提供用于預防和治療神經(jīng)退行性疾病的7-羥基-6-甲氧 基-l,2，3，4-四氫異喹啉衍生物(式l)。
此處，Ri選自由H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2、 Ph、 CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，R2選 自由CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH2CH2CH2CH3 、 CH2Ph、 CH2CH2Ph、 COCH3(Ac) 、COCH2CH3 、COCH2CH2CH3 、COCH(CH3)2 、 COCH2CH(CH3)2、環(huán)己基甲基和環(huán)己羰基組成的組。
在另一方面，提供用于預防和治療炎性疾病的7-羥基-6-甲氧基 -1，2,3,4-四氫異喹啉衍生物(式l)。
此處，R!選自由H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2、 Ph、 CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，R2選 自由CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH2CH2CH2CH3、 CH2Ph、 CH2CH2Ph、 COCH3(Ac)、 COCH2CH3、 COCH2CH2CH3、 COCH(CH3)2、 OCH2CH(CH3)2、
環(huán)己基甲基和環(huán)己羰基組成的組。在另一方面，提供有效保護神經(jīng)元的7-羥基-6-甲氧基-l，2,3，4-四氫 異喹啉衍生物(式1)。
此處，R!選自由H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2、 Ph、 CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，R2選 自由CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH2CH2CH2CH3 、 CH2Ph、 CH2CH2Ph、 C0CH3(Ac)、 COCH2CH3、 COCH2CH2CH3、 COCH(CH3)2、 OCH2CH(CH3)2、
環(huán)己基甲基和環(huán)己羰基組成的組。
以下是配基Ri和R2的具體應用實例。
表1
化學式序號R!R2
2HAc
CH3Ac
CH2CH3Ac
9aCH2CH2CH3Ac
9cCH(CH3)2Ac
9eCH2CH(CH3)2Ac
5bPhAc
9dCH2PhAc
9f環(huán)丙基Ac
9g環(huán)丁基Ac
9h環(huán)己基Ac
11aHCOCH2CH3
libHCOCH2CH2CH3
lidHCOCH(CH3)2
lieHCOCH2CH(CH3)2
11cH環(huán)己羰基
12dHCH2CH3
12aHCH2CH2CH3
12bHCH2CH2CH2CH3
12cH環(huán)己基甲基
12eHCH2Ph
12fHCH2CH2Ph
本文所用的化合物可以是反式或順式構型。
8通過以下方法可合成7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(HMTIQ) 衍生物(式1)。
用醛和苯基乙酰胺通過皮克特-斯賓格勒(Pictet-Spengler)環(huán)化在 Cl位引入幾種烷基衍生物(化學方程式1)。 S卩，將式3化合物與乙醛在 酸性介質中環(huán)化，可容易地得到1-甲基化合物(式4a)，但是因為苯甲 醛在含水溶劑中的溶解性，可能得不到1-苯基化合物(式4b)。因此， 通過可選擇的方法，在甲醇中環(huán)化生成亞胺后，加入三氟乙酸(TFA) 與亞胺環(huán)化，由此獲得式4b化合物。
式4a和4b化合物與乙酸酐發(fā)生乙酰化來合成式5a和5b化合物。
<formula>formula see original document page 9</formula>化學方程式l中，式4a化合物的合成條件乙醛、1MHC1、 100°C、
24小時；
化學方程式1中，式4b化合物的合成條件i.苯甲醛、MgS04、 TEA、 MeOH、回流、3小時；ii. TFA、 80。C、 1小時40分鐘；以及
化學方程式l中，式5a和5b化合物的合成條件(b)Ac20、 Et3N、 CH2C12、室溫(RT)、 1小時。
4a' R = Mg (55%) 4b> R = Ph (74%)
Sa, R = Me (83%) 5b, R = Ph (89%》
7a (90%), 8a (18%), 9a (58%). R CH CH3 7b (94%), 8b (77%), 3b (45%〉,R = CH^CHjCHj
7c (96%), 8c (70%). 9c (67%). R = CH(CH3)2 7d (63%). 8d (63%), M (94%),R = CH2Ph
7e (93%), 8e (67%), 9e (73%), R = CHjCH(CH3)2
7f (88°/。),' 8f (58%),' M (72%), R =環(huán)禹i 7g (79%), 8g (81%), Sg (80%). R =環(huán)丁基 7 i (85%). 8h (72%). 9h (80%>.R =環(huán)己基化學方程式2中，式6化合物的合成條件(a) (Boc)20、Et3N、CHCl3、 RT、 24小時；(b)芐基溴、K2C03、丙酮、回流、12小時；(c) TFA、 CH2C12、 0。C、 40分鐘；
化學方程式2中，式7a-7h化合物的合成條件酰氯、TEA、 CH2C12、 RT、 30分鐘-1小時；
化學方程式2中，式8a-8h化合物的合成條件(e)POCb、 CH3CN、 回流、2-5小時；(f) NaBH4、 0。C-RT、 24小時；(g) Pd/C、 H2、 HC1、 MeOH、 RT、 12小時；以及
化學方程式2中，式9a-9h化合物的合成條件(h)Ac20、 CH2C12、 0。C-RT、 2小時。
通過畢世勒-納批拉爾斯基(Bischler-Napieralski)反應可在Cl位進 行四氫異喹啉衍生物的其它合成。分別用叔丁氧羰基酐和芐基溴保護伯 胺和酚，然后使叔丁氧羰基基團脫離可合成式6化合物。用幾種酰氯如 丙酰氯、丁酰氯、異丁酰氯、a-苯基乙酰氯、4-甲基丁酰氯、環(huán)丙甲酰氯、 環(huán)丁甲酰氯和環(huán)己甲酰氯來?；?化合物可合成胺衍生物(式7a-7h)。
可用磷酰氯(phosphorus oxychloride)處理這些?；幕衔?式 7a-7h)以得到環(huán)二氫異喹啉，然后可將其用氰基硼氫化鈉還原以合成7-芐氧基四氫異喹啉衍生物。通過鈀催化的脫芐基作用，獲得幾種烷基引 入C1位的、作為鹽酸鹽的四氫異喹啉衍生物(式8a-8h)。
所得的化合物與乙酸酐反應，生成式9a-9h的目標化合物。所有C1 位取代的四氫異喹啉衍生物(式5a-5b， 9a-9h)均作為外消旋混合物得 到分離。
10[化學方程式3]
10
MeO.
11a. R = CH2CH3(31%)— "b, R = CH2CH2CHS (75%) 1化.R-環(huán)己基(57%) -"d,R豕CH(CH3)2 (71%〉 He. R = CHjCH{CH3)2 (60。/o)
-12a. R s CH2CH3 (92%)
12b: R= CH2CH2CH-, (70%) -12c, R=環(huán)己基(90%)
〗3, R= Ph(52%) 12f， R- CH2Ph (56%〉
化學方程式3中，式lla-lle化合物的合成條件為(a)丙酸酑、丁 酰氯、環(huán)己甲酰氯、異丁酰氯或3-甲基丁酰氯、TEA、 CH2Cl2、 RT、 1 小時；(b)K2C03、 MeOH、回流、2小時；
化學方程式3中，式12d-12f化合物的合成條件為(c)i.乙醛、苯 甲醛或苯乙醛、Ti(OiPr)4、 EtOH、 RT、 1小時；ii.NaCNBH3、 THF、 RT、 20小時；
化學方程式3中，式12a-12c化合物的合成條件為(d)LAH、 THF、 回流、3-5小時。
合成了 N2-酰基衍生物(式lla-lle)和它們的羰基還原的衍生物(式 12a-12f)。
通過本領域熟知的方法制備7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(式 10) [Seo, J. W.; Srisook， E.; Son, H. J.; Hwang， O.; Cha, Y. N.; Chi, D. Y" C7^m.丄e". 2005， 15, 3369]。使酰氯(丁酰氯、環(huán)己甲酰氯、 異丁酰氯或3-甲基丁酰氯)或其酐(丙酸酐)與溶于二氯甲垸溶劑中的 三乙胺在室溫下反應，對混合物進行萃取，并且在甲醇溶劑中用碳酸鉀 對混合物進行回流，以此來合成幾種N2-羰基烷基四氫異喹啉(式 lla-lle)。通過兩種不同的方法來合成N2-烷基衍生物(式12a-12f)。用氫化 鋁鋰還原酰胺(式lla-llc)來形成N2-乙基、N2-丙基和N2-環(huán)己基四氫 異喹啉(式12a-12c)，使乙醛、苯甲醛或苯乙醛與異丙氧基鈦(IV)反 應形成亞胺，然后加入氰基硼氫化鈉可合成其它叔胺衍生物(式 12d-12f)。
上述的7-羥基-6-甲氧基-l，2，3,4-四氫異喹啉(HMTIQ)衍生物具有 下調激活的小膠質細胞內各種炎性細胞因子和炎性誘發(fā)物質的作用，保 護神經(jīng)元免受氧化性和炎性傷害，以及預防和/或治療神經(jīng)退行性疾病。
因此，HMTIQ衍生物或它們的藥學上可用的鹽被用于預防和治療神 經(jīng)退行性和炎性疾病。
此外，本發(fā)明可以提供一種用于預防和治療神經(jīng)退行性和炎性疾病 藥物組合物，其包括HMTIQ衍生物或其藥學上可用的鹽、以及藥學上可 用的稀釋劑或載體。
根據(jù)本發(fā)明，7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉衍生物顯著抑制激 活的微生物細胞內一氧化氮(NO)和過氧化物的增加，顯著抑制TNF-a、 IL-1(3誘導性NO合成酶和環(huán)氧化酶-2基因的表達，以及顯著抑制NF-kB 轉移到細胞核，減少ROS的生成、抑制GTP環(huán)水解酶I基因的表達和四 氫生物蝶呤(BH4)的過量生成，顯著保護多巴胺能神經(jīng)元免受激活的小 膠質細胞引起的傷害。


圖1是顯示N-乙基羰基-7-羥基-6-甲氧基-l，2,3,4-四氫異喹啉 (EHMTIQ)對激活的小膠質細胞內NO生成的抑制作用的圖。
圖2是顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內過氧化物生成的抑制作 用的圖。
圖3顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內TNF-a mRNA定量增加 的抑制作用A)是RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片；和B)是光密度 計(densitometer)測量的TNF-a條帶強度圖。
12圖4顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內IL-l)3mRNA定量增加的 抑制作用A)是RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片，和B)是光密度計 測量的IL-ip條帶強度圖。
圖5顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內COX-2 mRNA定量增加 的抑制作用A)是RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片；和B)是光密度 計測量的COX-2條帶強度圖。
圖6顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內iNOS mRNA定量增加的 抑制作用A)是RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片；和B)是光密度計 測量的iNOS條帶強度圖。
圖7顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內GTPCHmRNA定量增加 的抑制作用A)是RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳照片；和B)是光密度 計測量的GTPCH條帶強度圖。
圖8是顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內NF-kBp65轉移到細胞
核的抑制作用的圖。
圖9是顯示EHMTIQ對激活的小膠質細胞內氧化性物質聚集的抑制 作用的圖。
圖10是顯示EHMTIQ對由激活的小膠質細胞釋放的物質導致的多 巴胺能神經(jīng)元損傷的抑制作用的圖。
圖11是顯示EHMTIQ對微粒體酶誘發(fā)的降解穩(wěn)定性的圖。
圖12是顯示7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(HMTIQ)對激活 的小膠質細胞內BH4生成的抑制作用的圖。
圖13顯示小膠質標記物Iba-l免疫染色的小膠質細胞，顯示了 EHMTIQ對MPTP誘發(fā)的帕金森病小鼠模型黑質內小膠質細胞激活的抑 制作用。
圖14顯示多巴胺能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶(TH)免疫染色的 多巴胺能神經(jīng)元，顯示了 EHMTIQ對MPTP誘發(fā)的帕金森病小鼠模型黑 質內多巴胺能神經(jīng)元的保護作用(比例尺-200iam)。此處，右邊的兩個框圖是用fluro JadeC和TH雙標記的多巴胺能神 經(jīng)元照片，顯示了 EHMTIQ對黑質內多巴胺能神經(jīng)元退化的抑制作用(比 例尺20pm)。
圖15顯示TH免疫染色的多巴胺能神經(jīng)元，顯示了 EHMTIQ對 MTPT誘發(fā)的帕金森病小鼠模型紋狀體內多巴胺神經(jīng)末梢的保護作用 (比例尺-50nm)。
圖16顯示EHMTIQ對小鼠肝細胞不具有毒性(比例尺=100^1!1)。
具體實施例方式
在下文中，將描述合成中間體的方法和具有前述作用的終產(chǎn)物(5a、 5b、 9a-9h、 lla-lle和12a-12f)的結構分析。
實施例1:在Cl位用甲基或苯基取代的2-乙?；?7-羥基-6-甲氧基 -1,2,3,4-四氫異喹啉(AHMTIO)衍生物的合成和它們的結構分析
Me0.^^ a 隨 y、b 、 Me0m
AHMTIO (5a)的制備和分析
在100。C下，使乙醛(15.7mmo1， 692mg)與溶于1MHC1溶液(10ml) 的3-0-甲基多巴胺鹽酸鹽(1.96mmo1， 400mg)于壓力管內反應24小時。 使反應管冷卻，用碳酸氫鈉中和混合物。減壓除去水和剩余溶劑，真空 干燥所得物。將甲醇加到過濾器的殘留沉淀中，通過短柱色譜法提取粗 化合物4a。粗化合物4a結晶獲得白色粉末狀鹽酸鹽(250mg， 55%) 。H NMR (DMSO-a, 400 MHz) 59.93 (br s, 1H)， 9.40 (br s， 1H)， 9.06 (s, 1H)， 6.72 (s, 1H), 6.67 (s， 1H), 4.32-4.30 (m， 1H), 3.47 (s, 3H)， 3.28-3.36 (m, 1H): 3.21-3.22 (m， 1H)， 2.29-2.00 (m， 1H) 1.52(d, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (DMSO-d6， 100 MHz) S147,l， 145.4, 126.0, 122.1, 112.7, 111.9， 55.6， 49.7, 38.6， 24.6， 19.1; MS (CI) 194 (M++l， 100)， 178, 164]。
4a, R = Me (55%) 4b, R = Ph (74%)
Sa. R = (83%) 5b,R = Ph(89%)
14在室溫(RT)下，將中間體4a(0.435mmo1， 100mg)加入二氯甲烷溶劑 (5ml)中，向其加入乙酸酐(0.435mmo，45mg)和三乙胺(l.Ommol)。攪拌 所得的混合物1小時后，減壓除去剩余溶劑。將飽和碳酸氫鈉溶液倒入， 用二氯甲烷溶劑萃取混合物。重結晶獲得白色化合物5a(91mg， 83%) 。H NMR (CDCb, 400 MHz) S6.96 (s， C5-H的一種構象異構體)，6.66 (s, C5-H 的一種構象異構體)，6.59 (s, C8-H的一種構象異構體)，6.57 (s, C8-H的一 種構象異構體)，5.83 (s, O-H的一種構象異構體)，5.78 (s, O-H的一種構象 異構體)，5.53 (q， 《/= 6.6 Hz, Cl-H的一種構象異構體)，4.83 (q， 《/= 6.6 Hz, Cl-H的一種構象異構體)，4.70-4.65 (m， C3-H的一種構象異構體)， 3.82-3.76 (m, C3-H的一種構象異構體)，3.52-3.44 (m， C3-H的一種構象異 構體)，3.02-2.95 (m， C3-H的一種構象異構體)，2.90-2.79(m, 1H), 2.75-2.70 (m， L4"ti tfj一rrT厶j豕開懺J'Kl0, /.oy-z.ou (m， L4-n tf、j一rrT厶J豕并不勾體)， 2.18 (s, C1-CH3的一種構象異構體)，2.15 (s, C1-CH3的一種構象異構體)， 1.49 (d, / = 6.4 Hz, COC-H3的一種構象異構體)，1.40 (d, J = 6,8 Hz， COC-H3的一種構象異構體)；13C NMR (CDC13, 100 MHz) 5168.8， 168.7, 145.5, 145.3， 144.3, 144.1, 131,3, 130.0, 125,6, 124.4, 112.8, 112.3, 110.8, 110.4, 55.9， 52.3, 47.9, 40.4, 34.8, 29,0, 28.2， 22,5, 21.9, 21.5, 21.4; MS (EI): 471， 264, 236 (M++ 100)， 220]。
AHMTIQ (5b)的制備和分析
將化合物3 (l.Ommol， 204mg)、硫酸鎂(2.49mmo1， 300mg)、苯甲醛 (l.Ommol， 106mg)和三乙胺(2.0mmo1， 202mg)加入無水甲醇中(15ml)， 回流3小時。反應容器冷卻后，用C鹽(Celite)過濾混合物。減壓除去 溶劑，用乙酸乙酯過濾混合物除去白色沉淀。對過濾后的溶液進行再過 濾，并在減壓下真空干燥。將三氟乙酸加入干燥的所得物，回流1小時， 減壓除去溶劑。用碳酸氫鈉中和所得產(chǎn)物，然后用二氯甲烷萃取。
用硫酸鈉干燥有機層并減壓除去溶劑。通過柱色譜法(5%甲醇，95% 二氯甲烷)獲得中間體4b (188mg， 74%) 。H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) S8.57 (br s, lH),7.22-7,32 (m， 5H), 6.63 (s, 1H)， 6.04 (s， 1H), 3.72 (s， 3H), 3.01-3.10 (m, 1H)， 2.76-2.89 (m, 2H), 2.55-2.65 (m, 1H); 13C NMR (DMSO-4 100 MHz) S146.0, 145.6， 144.1, 130.7, 128.9, 128.0, 126.8,125.7， 114.4, 112.2, 60.8， 55.5, 42.0, 28.8; MS (CI): 284, 256 (M++1, 100)， 178]。
將中間體4b (0.223mmol， 57mg)加入氯仿(5ml)中，并且在RT下向 其進一步加入乙酸酐(0.223mmo1， 23mg)。將混合物攪拌1小時后，減壓 除去溶劑，加入飽和碳酸氫鈉。接下來，用二氯甲烷萃取，除去溶劑， 通過重結晶獲得白色固體5b (59mg， 89%) 。H NMR (CDC13, 400 MHz) 57.32-7.18 (m, 5H), 6.86-6.58 (m, C5-H和C8-H的幾種構象異構體峰，H3)， 5.84-5.30 (m, O-H的幾種構象異構體峰，1H), 4.33-4.27 (m， Cl-H的一種 構象異構體)，3.89 (s, 3H) 3.72-3.66 (m， Cl-H的一種構象異構體), 3,46-3.38 (m, C3-H的一種構象異構體)，3.27-3,21 (m, C3-H的一種構象異 構體)，2.96-2.82 (m, C4-H的一種構象異構體)，2.76-2.60 (m, C4-H的一 種構象異構體)2.74 (s, COC-H3的一種構象異構體)，2.15 (s, COC-H3的一 種構象異構體)；13C NMR (CDC13, 100 MHz) S169.7, 168.9， 145.8， 144.2, 143.9， 142.4, 141.4, 128.6, 129.5， 128.1, 127.8, 127.7, 127.5, 127.2， 126.8, 125.7， 114.5， 113.8, 110.8, 110.4, 60,2, 55.9, 54.4， 40.4， 37.6， 28.6, 27.4, 22.1， 21.7 MS (EI); 297 (M+), 254, 239， 220, 178 (100)， 163]。
實施例2:在C1位用幾種烷基取代的AHMTI0衍生物(6、 7a-h、 8a-h和 9a-g)的合成方法和它們的結構分析
7a ~7h
HO
廣Y
R 0
7a (恥M)'8a(腦), 7b (9，，助(77%〉. 7c(96%),8c(70%>. (63%). 8(3(63%),
7h(85%),ah (72%),
9a (58%). R -Sb(45%),R: 9c (67%), R = M (94%), R' 9e (73%), R : 射(72%), R ， Sg (SO%).RB Sh (80%),
CH2Ph
環(huán)咼基 環(huán)丁基 環(huán)己基
①N-(2-(4-羥基-3-0-甲基苯基)乙基)-叔丁基碳酸鹽(6)的合成方法和分 近方法a)將叔丁氧羰基酐(7.63mmo1， 1.67g)和三乙胺(19.5mmo1， 1.93g) 與化合物3 (6.35mmo1， L30g)加入氯仿(20ml)中。在RT下攪拌混合物24 小時，向其加入氯化鋁溶液。用二氯甲垸溶劑萃取混合物，然后用水洗 滌有機層兩次。通過柱色譜法和重結晶獲得白色結晶化合物(1.32g， 59%) 卩H NMR (CDC13, 200 MHz) S6.83 (d， J= 8.4 Hz， 1H)， 6.63-6.67 (m, 2H)， 5.83 (s， 1H), 6,45 (br s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.35 (q, /= 6.6 Hz, 2H), 2.70 (t， / =7,0 Hz, 2H)， 1.43 (s， 9H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) S155.9, 146.5， 144.1, 130.6, 121.2, 114.4， 111.2, 79.1, 55.7, 41.9, 35.7, 28.3; MS (CI) 318， 267 (M++1), 212, 168， 151 (100)， 138]。
將碳酸鉀和芐基溴加入含有溶解的白色結晶化合物的丙酮中，然后 使混合物回流12小時。減壓除去溶劑后，用水和乙酸乙酯萃取混合物。 用硫酸鈉干燥有機層，除去硫酸鈉和溶劑。通過柱色譜法獲得白色固體 (1.57g， 95%) 。H NMR (CDC13, 200 MHz) 57.27-7.46 (m， 5H), 6,82 (d, / = 8.0Hz， 1H), 6.73 (d, /= 1.8 Hz, 1H), 6.65 (dd, /= 8.0, 1.8 Hz， 1H), 5.13 (s, 2H), 4.55 (br s， IH)， 3.88 (s， 3H), 3.44 Cq, J= 6.6 Hz, 2H), 2.72 (t, J= 7.2 Hz， 2H), 1.44 (s， 9H); 13C麗R (CDC13, 50 MHz) 5155.9， 149.9, 147.0, 137.4, 132.4, 128.5, 127.7, 127.3, 120.8， 114,8, 112.9, 79.2, 71.4, 56.1, 42.0， 35.9, 28.4; LC/MS (ESP) 615, 559, 379, 358 (M++1), 301 (100), 241, 224]。
在0。C下，將三氟乙酸(20ml)緩慢加入含有白色固體(16.8mmol，6.0g) 的二氯甲烷溶劑(20ml)中。將混合物攪拌40分鐘后，將混合物溶液緩慢 放入帶冰的碳酸氫鈉溶液中。用乙醚溶劑萃取混合物，然后除去乙醚溶 劑，使其溶于氯仿，用飽和碳酸氫鈉溶液中和，除去溶劑。用乙醚(20ml) 中的1M HC1處理所得物質得到白色鹽酸鹽中間體6 (1.32g， 64%) 。H 畫R (CDC13, 200 MHz) S8.24 (br s, 2H), 7.28-7.45 (m, 5H), 6.96 (d, / = 8.0Hz， 1H), 6.90 (d， J= 1.8 Hz, 1H)， 6.73 (dd, /= 8.0, 1.8 Hz, 1H)， 5.04 (s, 1H)， 3.77 (s, 3H)， 2.96-3.03 (m, 2H), 2.80-2.88 (m, 2H); 13C麗R (CDC13, 50 MHz) 5149.3， 146.6, 137.2, 130.3， 128.2, 127.6, 127.5, 120.5, 114.1, 113.0, 70.1, 55.6, 32.4; MS (CI): 258 (M+)， 241 (100)， 228, 91]。
②N-f2-(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基l烷基酰胺(7a-h)的一般合成方法
及分析在0。C下，將烷基氯(丙酰氯、丁酰氯、異丁酰氯、苯乙酰氯、4-甲基丁酰氯、環(huán)丙甲酰氯、環(huán)丁甲酰氯和環(huán)己甲酰氯)加入含有溶解的化
合物6的二氯甲垸溶劑中，然后向其緩慢加入三乙胺。將混合物攪拌30 分鐘至1小時。減壓除去溶劑，加入水。用乙酸乙酯萃取所得物質的有 機物質。用水洗滌有機層，用硫酸鈉干燥，然后過濾。減壓除去過濾后 的溶液中的溶劑，通過重結晶或柱色譜法獲得化合物7a-h。
N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]丙酰胺(7a)
用化合物6 (3.5Ommo1， 900mg)、丙酰氯(4.55mmo1， 421mg)、三乙 胺(10.5mmo1， 1.06g)獲得7a (984mg， 90%): & NMR (CDC13， 200 MHz) S7.26-7.46 (m， 5H), 6.81 ((!， /= 8.0 Hz， 1H), 6.73 (d， /= 2.2 Hz, 1H), 6.64 (dd， /= 8.2, 1.9 Hz, 1H), 5.65 (br s, 1H)， 5.12 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.46 (q， 《/ =6.6 Hz， 2H), 2.73 (t, J= 7.0 Hz, 2H)， 2.14 (q， /= 7.5 Hz， 2H), 1.11 (t, J = 7.7 Hz， 3H); 13C麗R (CDC13, 50 MHz) S173.7, 149.6, 146.7, 137,1, 132,1， 128.4， 127.7， 127.2， 120.5， 114.2， 112.4， 71.0, 55.8, 40.5, 35.2, 29.6, 9.8; MS (EI): 313 (M+)， 240, 149, 137, 91 (100), 65, 57, 30。
N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]丁酰胺(7b)
用化合物6 (3.50mmol，卯Omg)、 丁酰氯(4.20mmo1， 448mg)、三乙 胺(10.5mmo1， 1.06g)獲得7b (L08g， 94%): !H NMR (CDC13， 200 MHz) 57.46-7.26 (m, 5H)， 6.81 (d, J= 8.0Hz， IH)， 6.73 ((!, /= 1.8 Hz, IH)， 6.64 (dd, J= 8.0， 1,8, 1H), 5.56 (s， 1H), 5.12 (s， 2H), 3.86 (s, 3H), 3.47 (q, /= 6.6 Hz， 2H)， 2.74 (t, J= 7.0 Hz, 2H)， 2.09 (t, J= 7.6 Hz, 2H)， 1.61 (六重峰， / = 7.4 Hz， 2H), 0.91 (t， J= 7.3 Hz, 3H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) S172.9, 149.7, 146.7, 137.2, 132.0, 128.4, 127,7, 127.2, 120.5， 114.2, 112.4， 71.1, 55.9, 40,5， 38.6.35.3, 19.1， 13.7; MS (EI): 327 (M+)， 240, 149， 137， 91 (100)， 43。
N-[2[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]異丁酰胺(7c)
用化合物6 (3.50mmol， 900mg)、異丁酰氯(4.20mmo1， 448mg)、三 乙胺(10.5mmo1， L06g)獲得7c (1.10g， 96%): !H NMR (CDC13, 200 MHz) 57.46-7.26 (m, 5H), 6.82 ((!， /= 8.2Hz, 1H), 6.73 (d, /= 1.8 Hz, IH)， 6.64 (dd, /= 8.0， 1.4, 1H), 5.56 (br s, IH)， 5.13 (s, 2H)， 3.87 (s， 3H), 3.47 (q, / =6.6 Hz, 2H), 2.74 (t, /= 6.9 Hz, 2H)， 2.28 (五重峰，《/= 7.1 Hz, 1H), 1.11 (d， J= 7.0 Hz， 2H); 13C NMR (CDC13, 50 MHz): S176.8, 149.7, 146.7， 137.1,
132.1, 128,4, 127.7, 127.2, 120.6, 114.2， 112.4, 71.1, 55.9, 40.4, 35.5, 35.2, 19.5; MS (EI): 327 (M+), 240, 149, 137， 91(100), 43。
iv) N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]-2-苯乙酰胺(7d)
用化合物6(3.42mmol， l,Og)、三乙胺(10.3mmo1， 1.04g)、苯乙酰氯 (3.76mmol， 518mg)獲得7d(802mg, 63%): !H NMR (CDC13, 200 MHz) S7.71-7.47 (m, IOH)， 6.65 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 6.62 (d, 7=1.8Hz, 1H), 6.44 (dd, /= 8.2, 2.2 Hz, 1H), 5.39 (br s, IH)， 5.12 (s， 2H)， 3.82 (s, 3H), 3.51 (s, 2H), 3.42 (q, /=6.4 Hz， 2H)， 2.65 (t, /= 6.7 Hz, 2H); 13C NMR (CDC13, 100 MHz) 5170.8, 149.6, 146.7, 137.2, 134.7, 131.7， 129.4, 128,9, 128.5， 127.8,
127.2, 127.1, 120.5, 114.1， 112.2， 71.0, 55.9, 43.8, 40.6, 35.0; MS (EI): 375 (M+), 240， 149， 137， 91(100)， 65。
v) N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]-3-甲基丁酰胺(7e)
用化合物6(3.50mmol， 900mg)、異戊酰氯(4.20mmo1， 506g)、三乙 胺(10.5mmo1， 1.06g)獲得7e(l.llg， 93%): & NMR (CDC13,200 MHz) 57.46-7.25 (m， 5H), 6.82 (d, ■/= 8.0 Hz, IH)， 6,73 (d, /= 1.8 Hz, 1H), 6.63 (dd, J= 8.2， 2.0， 1H), 5.51(br s, IH)， 5.13 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.49 (q， 《/ =
6.7 Hz, 2H), 2.74 (t, /= 6.9 Hz， 2H), 2.15-1.95 (m, 3H), 0.90 (d, /= 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) S172.4, 149.7, 146.7, 137.1， 132.0， 128,5, 127.7, 127.2， 120.5, 114.2, 112.4， 71.1, 55.9, 46.1, 40.4， 35.3, 22.4; MS (EI): 341 (M+), 240, 149, 137, 91 (100)， 65, 57, 30。
vi) N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]-2-環(huán)丙基乙酰胺(7f)
用化合物6 (3.89mmol， l.Og)、環(huán)丙甲酰氯(5.45mmo1， 589 mg)、三 乙胺(11.7mmo1， 1.18g)獲得7f(1.12g， 88%): & NMR (CDC13, 200 MHz) S7.45-7.26 (m, 5H)， 6.82 ((!， /= 8.0Hz, IH)， 6.74 (d， 《/= 1.8 Hz, 1H), 6.58 (dd， J= 8.0, 1.8 Hz, 1H), 5.77 (br s, 1H), 5.13 (s, 2H), 3.87 (s, 3H)， 3.48(q, / =6.6 Hz, 2H), 2.74 (t， /= 7.0 Hz, 2H), 1.85-1.19 (m, 1H), 0.95 (五重峰， / =
3.8 Hz， 2H), 0.74-0.64 (m, 2H); 13C NMR (CDC13, 50 MHz) S173.4, 149.6,146.7, 137.2, 132.1, 128.4, 127.7， 127.2, 120.5, 114.2, 112.4， 71.1, 55.9, 40.8， 35.3, 14.6， 7.0; MS (EI): 325 (M+)， 240, 149, 137, 91 (100), 69, 41。
vii) N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]-2-環(huán)丁基乙酰胺(7g)
用化合物6 (3.50mmol， 900mg)、環(huán)丁甲酰氯(4.55mmo1， 539mg)、 三乙胺(10.5mmo1,1.06g)獲得7g (737mg，79%): !H NMR (CDC13, 200 MHz) S7.46-7.25 (m, 5H), 6.81 ((!， /= 8.0 Hz， IH), 6.73 ((!, /= 1,8 Hz, IH), 6.64 (dd, ■/= 8.2, 2.2 Hz, IH), 5.49 (br s, IH), 5.13 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.47 (q， / =6.6 Hz, 2H), 2.92 (五重峰， / = 8.5 Hz， IH), 2.73 (t, / = 7.0 Hz, 2H), 2.37-1.98 (m, 4H)， 1.94-1.78 (m, 2H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) 3174.9， 149.7, 146.7, 137.2， 132.1, 128.4， 127.7， 127.2, 120.6， 114.2, 112.4, 71.1， 55.9, 40.4, 39.9， 35.2, 25.3, 18.1; MS (EI): 339 (M+), 240， 149， 137, 91 (100), 55。
viii) N-[2-[(4-芐氧基-3-甲氧基苯基)乙基]-2-環(huán)己基乙酰胺(7h)
用化合物6 (3.50mmol，卯Omg)、環(huán)己甲酰氯(4.55mmo1， 667mg)、 三乙胺(10.5mmo1， 1.06g)獲得7h (1.09g， 85%): & NMR (CDC13， 400 MHz) S7.41-7.23 (m， 5H), 6.79 8.0 Hz， IH), 6.67 (d， /= 2.0 Hz， IH)， 6.61
(dd， 《/= 8.0， 2.0 Hz IH), 5.48 (br s, IH)， 5.09 (s, 2H), 3.83 (s， 3H), 3.43 (q， / =6.5 Hz, 2H)， 2.70 (t, /= 6.8 Hz, 2H)， 2.00-1.93 (m， IH), 1.78-1.71 (m， 4H), 1.63-1.59 Cm， IH)， 1.40-1.30 (m, 2H)， 1.25-1.12 (m, 3H); 13C NMR (CDC13, 100 MHz) S176.0, 149.7, 146.7， 137.2, 132.1， 128.4， 127.7, 127.2， 120.6， 114.3, 112.5， 71.1, 55.9, 45.4, 40.3， 35.2， 29.6, 25.6; MS (EI): 367 (M+), 240, 149, 137, 91 (100)， 83, 55。
③l-烷基-7-羥基-6-甲氧基-l,2.3,4-四氫異喹啉(8a-h)的制備和分析
將磷酰氯(POCl3)加入含有化合物7a-h的無水乙腈中，回流2-5小時。 減壓除去溶劑，真空干燥所得物。將干燥的化合物溶于甲醇，在0。C下 向其緩慢加入硼氫化鈉(NaBH4)。在RT下，將混合物攪拌24小時后，用 硅膠過濾混合物，用硫酸鈉干燥。將飽和碳酸氫鈉倒入，并用二氯甲垸 溶劑萃取有機物質，用硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑。使真空干燥的有機 物質溶于甲醇，向其加入HC1溶液和10%Pd/C，在RT、氫氣下攪拌混合物12小時。用C鹽過濾所得的溶液，減壓除去溶劑。通過柱色譜法或
重結晶獲得作為鹽酸鹽的化合物8a-h。
l-乙基-7-羥基-6-甲氧基-l，2，3，4-四氫異喹啉(8a)
用化合物7a (3.0mmo1， 940mg)、 P0C13 (9.0mmol， 1.38g)、 NaBH4 (15mmol， 587mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8a (128mg， 18°/。) 'HNMR (DMSO-^,400 MHz) 59.69 (br s, 1H), 9.07 (br s， 1H), 9.02 (s, 1H), 6.73 (s， 1H), 6,66 (s， 1H), 4.23 (br s, 1H)， 3.74 (s, 3H), 3.16 (br s, 1H), 3.01-2.93 (m, 1H)， 2.86-2.80 (m, 1H)， 1.97-1.87 (m, 2H)， 1.01 (t, /= 3.7 Hz, 3H); 13C NMR (畫S0-c 6， 100 MHz) 5147.1, 145.2, 124.5, 122.5, 113.0, 112.0， 55.6, 55.0, 54.6, 26.2, 24.5, 9.8; LC MS: 208.2 (M++1, 100)。
7-羥基-6-甲氧基-l-丙基-l,2,3，4-四氫異喹啉(8b)
用化合物7b(2.99mmo1， 980mg)、 P0C13 (8.98 mmol， 1.38g)、 NaBH4 (23.9mmol， 905mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8b (590mg， 77%): NMR (DMSO-A, 400 MHz) S9.80-9.20 (br s, 1H)， 9.04 (br s, 1H)， 6.72 (s, 1H),6.66 (s, IH), 4.26 (t， /= 3.2 Hz, IH)， 3.74 (s， 3H)， 3.36-3.30 (m, IH), 3.00-2.93 (m， IH), 2.85-2.78 (m， IH)， 1.88-1.81 (m, 2H), 1.52-1.42 (m. 2H)， 0.92 (t， /= 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (DMSO-^， 100 MHz) 5147.1， 145.2， 124.9， 122.5, 123.0， 112.0, 55.6， 53.5, 35.6, 24.5， 18.2, 13.7; LC MS: 479.2, 222.2 (M++1, 100)。
7-羥基-l-異丙基-6-甲氧基-l,2，3,4-四氫異喹啉(8c)
用化合物7c(2.99mmo1， 980mg)、 P0C13 (8.98mmol， 1.38g)、 NaBH4 (23.9mmol， 905mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8c (536mg， 70%): 'HNMR (DMSO-A, 400 MHz) S9.81 (br s， IH), 9.04 (br s， IH), 8.66 (br s, IH)， 6.69 (s， IH), 4.26 (br t, /= 3.4， IH), 3.75 (s, 3H), 3.37 (br s, IH), 3,10-3.08 (m, 2H), 2.78-2.73 (m, IH), 2.37-2.29 (m, IH), 1.08 (d， /= 7.2 Hz, 3H)， 0.84 (d, /= 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (畫SO誦^， 100 MHz) S146.9, 145.3， 123.7, 123A 113.0, 111.9, 58.9， 55.5, 43,3， 30.8， 24.6, 19.2， 16.2; LC MS: 479.2， 222.2 (M++1, 100)。
l-芐基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3，4-四氫異喹啉(8d)用化合物7d (0.51mmol， 135mg)獲得8d (101mg， 74%): & NMR (CDC13， 400 MHz) 57.22-7.36 (m， 5H)， 6.62 (s， 1H)， 6.57 (s, 1H), 4.04-4.10 (m, 1H)， 3.82 (s, 3H), 3.13-3.22 (m, 2H), 2,70-2.卯(m， 3H)， 2.62-2.70 (m， 1H); 13CNMR(CDC13， 100 MHz) 5145.1, 143.6, 139.1, 131.2, 129.3, 128.6， 126.6, 126.4, 112.0， 111.1, 56,8， 55.9, 42.4， 40.9, 29.5; MS (CI): 270 (M++1), 178 (100)。
7-羥基-l-異丁基-6-甲氧基-l,2，3，4-四氫異喹啉(8e)
用化合物7e(3.13mmo1， 1.07mg)、 P0C13 (9.40mmol， 1.44g)、 NaBH4 (25.0mmol， 947mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8e (567mg， 67%): & NMR (DMSO-A, 400 MHz) 59.75 (br s, 1H), 9.36 (br s, 1H), 9.06 (s, IH)， 6.72 (s, 1H)，6.64 (s, 1H), 4.27 (br d， /= 3.6 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H)， 3.37-3.11 (m, 1H), 3.20-3,08 (m， IH)， 3.02-2.90 (m， 1H), 2.卯-2.78 (m， 1H), 2.00-1.89 (m, 1H), 1.88-1.77 (m， IH)， 1.65-1.55 (m, IH)， 0.98 (d, J= 6.4 Hz， 3H), 0.95 (d, / = 6.8 Hz， 3H); 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) S147.0, 145.2, 125.4， 122.5, 113.0, 112.0, 55.6， 51.8, 43,3, 38.7, 24.4， 23.8, 23.0. 21.6; LC MS: 236.2 (M++1, 100)。
l-環(huán)丙基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3，4-四氫異喹啉(8f)
用化合物7f (3.07mmol, l.Og)、 P0C13 (9.22mmol， 1.4g)、 NaBH4 (24.6mmol， 929mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8f (458mg， 58%): 'HNMR (DMSO-c/6, 400 MHz) 59.64 (br s, 2H)， 9.09 (s， 1H), 6.97 (s, 1H), 6.73 (s, IH)， 3.74 (s, 3H), 3.55 (d， 《/= 9.6 Hz, 1H), 3.41-3.36 (m， IH)， 3.14-2.97 (m, 2H), 2.86-2.77 (m, 1H), 1.18-1.09 (m, 1H), 0.88-0.81 (m， 1H), 0.81-0.72 (m, 1H), 0.72-0.64 (m, 1H), 0.60-0,52 (m, 1H); 13C NMR (DMSO-^， 100 MHz) J 147.3， 145.2， 125.1， 122.4, 113.1， 111.9, 58.9, 55.6， 39.8, 24.5, 14.6, 5.8, 2.8; LC MS: 220.2 (M++l， 100). 203.2。
vii)l-環(huán)丁基-7-羥基-6-甲氧基-l，2，3,4-四氫異喹啉(8g)
用化合物7g (2,95mmol， l.Og)、 P0C13 (8.8mmol， 1.36g)、 NaBH4 (23.6mmol， 893mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8g (645mg， 81%): & NMR (DMSO-A, 400 MHz) 59.90-9.00 (br s， 2H), 9.07 (s， 1H), 6.73 (s, 1H), 6.62 (s, IH)， 4.20 (d, /= 9.2, Cl-H的一種構象異構體)，4.14 (br d, >/= 4.8, Cl-H的一種構象異構體)，3.73 (s, 3H), 3.31-3,25 (m， 1H)， 3.16 (d， ■/= 4.0 Hz， 1H), 3.13-3.07 (m， 1H)， 2.98-2.91 (m， 1H)， 2.85-2.76 (m, 1H), 2.78-2.67 (m, 1H), 2,17-2.02 (m， 3H)， 2.02-1.92 (m， 1H), 1.89-1.70 (m， 2H); 13C NMR (DMS(W6， 100 MHz) S147.1, 145.1, 124.1, 122.4， 112.9， 112.1， 57.5， 55.5, 48.6, 38.3, 26.8, 25.2, 24.5， 17.6; LC MS: 234.2 (M++1, 100)。
l-環(huán)己基-7-羥基-6-甲氧基-l,2，3,4-四氫異喹啉(8h)
用化合物7h(2.53mmo1， 930mg)、 P0C13 (7.59mmol， 1.16g)、 NaBH4 (20.2mmol, 757mg)、 10。/。披鈀木炭(100mg)獲得8h (541mg， 72%): & NMR (DMSO-A, 400 MHz) S9.85 (br s， IH)， 9.03 (s， IH)， 8.67 (br s, 1H), 6.73 (s, IH)， 6.67 (s, IH)， 4.22 (br s, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.53 (br s, 1H), 3.04 (br s, 1H), 2.98-2.90 (m， 1H), 2.80-2.74 (m， 1H), 1,91 (br s， 1H), 1.80-1.58 (m, 4H), 1.50-1.00 (m, 6H); 13C NMR (DMSO誦^, 100 MHz) 5147.0, 145.1, 123.4, 123.3， 113.3, 112.0, 58.4, 55.5， 40.7， 29.3, 26.2， 25.9, 25.7, 25.6, 24.5; LC MS: 262.2 (M++1, 100)。
④2-乙?；?l-烷基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(9a-h)的合成方
法和分析
將二氯甲垸溶劑加入裝有化合物8a-h反應容器，在RT下，順序加 入乙酸酐和三乙胺。將混合物攪拌約2小時后，減壓除去溶劑，通過柱 色譜法獲得粗化合物9a-h。然后，重結晶獲得純化合物9a-h。
i) 2-乙?；?l-乙基-7-羥基-6-甲氧基-l，2，3,4-四氫異喹啉(9a)
用化合物8a(85mg， 0.36mmo1)、乙酸酐(36mg， 0.35mmo1)、三乙胺 (177mg， 1.75mmol)獲得9a (51mg， 58%): & NMR (CDC13, 400 MHz) S6.70 (s, C6-H或C8-H的一種構象異構體)，6.65 (s, C6-H或C8-H的一種構象異 構體)，6.58 (s， C6-H或C8-H的一種構象異構體)，6.56 (s, C6-H或C8-H的 一種構象異構體)，5.46-5.40 (dd, 8.8, 6.0 Hz, Cl-H的一種構象異構體)， 4.66-4.59 (m, C3-H的一種構象異構體)，4.59-4.53 (t, J= 7.2 Hz, Cl-H的一 種構象異構體)，3.859 (s， OCH3的一種構象異構體)，3.850 (s, OCH3的一種 構象異構體)，3.78-3.73 (m, C3-H的一種構象異構體)，3.55-3.42 (m, C3-H 的一種構象異構體)，3.06- 2.97 (m, C3-H的一種構象異構體)，2.94-2.79 (m: C4-H的一種構象異構體，1H), 2.79-2.70 (m, C4-H的一種構象異構體),2.65-2.57 (m, C4-H的一種構象異構體)，2.17 (s， -NCOCH3的一種構象異 構體)，2.16 (s， -NCOCH3的一種構象異構體)，1.88-1.70 (m, 2H), 0.96 (td, J =7.2, 29,2 Hz, 3H)。 ^jf(C14H19N03)計算的C, 67.45; H， 7.68; N， 5,62; 發(fā)現(xiàn)C, 67.32; H， 7.84; N, 5.67。
2-乙?；?7-羥基-6-甲氧基-l-丙基-l，2，3,4-四氫異喹啉(9b)
用化合物8b (200mg， 0.78mmo1)、乙酸酐(79mg， 0.78mmo1)、三乙 胺(236mg， 2.34mmol)獲得9b (92mg， 45%): & NMR (CDC13, 400 MHz) S6.69 (s， C6-H或C8-H的一種構象異構體)，6.64 (s, C6-H或C8-H的一種 構象異構體)，6.58 (s, C6-H或C8-H的一種構象異構體)，6.56 (s， C6-H或 C8-H的一種構象異構體)，5.54-5.48 (m, Cl-H的一種構象異構體)， 4.70-4.56 (m， Cl-H的一種構象異構體和C3-H)， 3.854 (s， OCH3的一種構 象異構體)，3.845 (s, OCH3的一種構象異構體)，3.79-3.71 (m， C3-H的一種 構象異構體)，3.57-3.47 (m, C3-H的一種構象異構體)，3.10-3.00 (m， C3-H 的一種構象異構體)，2.95-2.58 (m， C4-H的一種構象異構體，2H), 2.164 (s， -NCOCH3的一種構象異構體)，2.157 (s， -NCOCH3的一種構象異構體)， 1.88-1.60 (m， 2H)， 1.50-1.24 (m, 2H)， 1,12-0.84 (m, 3H); 13C NMR (CDC13, 100 MHz) S169.4, 145.5, 144.1， 143.8， 130.8， 129.9, 125.5, 124.4, 113.3, 112.5， 110.9， 110.4， 57.1, 55.9, 51.9, 40.7， 29.4， 38.7， 35.4, 28.7， 27.6， 21.8， 21.7, 19.9, 19.6, 14.0。分析((:151121^
HO.11a, r-oh2ch3(31%) 一 11b. R = CH2CH2CH3 (75%) 11c. R-環(huán)己基(57%) — "d'R ■ CH(CH3)2 (71%〉 11e. R = CH2CH<CH3)2 (60%)12a, R- CH2CHs (92%) 12b: R= CHsCHjCH-, (70%) 12c. r =環(huán)己基細") 12d, r ch3 (50%)R = ph (52%) 12f' R=CH2Ph'(56%)CD在N2位用酰胺取代的HMTIO衍生物nia-e)的制備和分析制備a)和b):使化合物10 (l.Ommol或2.0mmol)溶于二氯甲垸溶劑 (10-15ml)中，向其緩慢加入烷基酰氯(丙酸酐、丁酰氯、環(huán)己甲酰氯、異 丁酰氯或3-甲基丁酰氯)。將三乙胺(3.0mmol或6.0mmo1)緩慢加入，在 RT下將混合物攪拌約1小時。用水終止反應，并用水洗滌有機層。減壓 除去溶劑。使所得化合物溶于甲醇(10-20ml)，并向其加入碳酸鈣(3.0mmo1 或6.0mmo1)，然后使混合物回流約2-3小時。過濾回流溶液，然后用足 量的二氯甲垸溶劑萃取，用l.OMHCl溶液和水洗滌有機層。減壓除去溶 劑，并且通過柱色譜法獲得在N2位用酰胺取代的HMTIQ衍生物(lla-e)。2-乙基羰基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(EHMTIQ， lla)用化合物10(420mg， 2.0mmo1)、丙酸酐(410mg， 3.Ommo1)、三乙胺 (1.0ml)、碳酸鈣(370mg)獲得lla (146mg， 31%): & NMR (CDC13， 200 MHz) 56.71 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.66 (s, C5-H或C8-H的一種 構象異構體)，6.62 (s, C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.60 (s， C5-H或 C8-H的一種構象異構體)，6.10 (s， O-H的一種構象異構體)，5.96 (s, O-H 的一種構象異構體)，4.62 (s, Cl-H的一種構象異構體)，4.50 (s, Cl-H的一 種構象異構體)，3.86 (s, 0-CH3, 3H), 3,95-3.49 (m， C4-H, 2H), 2.85-2.70 (m, C3-H, 2H)， 2.46 (q, /= 7.4 Hz, 2H), 1.15-1.05 (m, 3H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) S172.8, 145.5, 144.6， 144.3， 126.12， 126.11， 112.5， 111.8, 111.0，110.6, 56.0, 46.8， 43.8, 43.2, 39.8, 29.1， 28.1, 26.9， 26.7, 9.4; MS厠235 (M+， 100), 220， 178, 163, 150, 135。7-羥基-6-甲氧基-2-丙基羰基-l,2，3，4-四氫異喹啉(llb)用化合物10 (215mg， l.Ommol)、 丁酰氯(93mg， l.Ommol)、三乙胺 (0.45ml)、碳酸^(100mg)獲得lib (187mg， 75%): & NMR (CDC13， 100 MHz) 86,71 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.66 (s， C5-H或C8-H 的一種構象異構體)，6.61 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.60 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.21 (s, O-H的一種構象異構體)，6.03 (s, O-H的一種構象異構體)，4.62 (s， Cl-H的一種構象異構體)，4.50 (s, Cl-H的一種構象異構體)，3.85 (s, 0-CH3, 3H), 3.95-3.60 (m， C4-H, 2H)， 2.卯-2.70 (m， C3-H, 2H), 2.46 (t, >/ = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.60 (m, 2H), 1.05-0,90 (m, 3H); 13C NMR (CDC13， 50 MHz) 5172.1, 145.8, 144,7, 144.5， 126.2, 125.2， 112.7, 111.9， 111.2, 110.8， 56.1, 47.1， 43.9, 43,5， 39.9, 35.8， 35.7， 29.3, 28.2, 18.7, 14.1; MS (EI) 249 (M+, 100), 220, 178, 163, 150。2-環(huán)己羰基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉(llc)用化合物10 (430mg， 2.0mmol)、環(huán)己甲酰氯(5卯mg， 4.0mmol)、三 乙胺(0.90ml)、碳酸鈣(320mg)獲得11c (302mg， 57%): !H麗R (CDC13， 200 MHz) 56.72 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體),6.68 (s, C5-H或 C8-H的一種構象異構體)，6.60 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，5.95 (s， O-H的一種構象異構體)，5.76 (s, O-H的一種構象異構體)，4.61 (s, Cl-H的一種構象異構體)，4.54 (s， Cl-H的一種構象異構體)，3.86 (s， 0-CH3, 3H), 3.72 (m, C4-H, 2H), 3.82-3.62 (m, 2H), 2.85-2.64 (m, C3-H, 2H)， 2.62-2.45 (m, IH)， 1.90-1.20 (m, 10H); MS (EI) 289 (M+， 100), 274, 178, 163， 150。7-羥基-6-甲氧基-2-異丙基羰基-l,2,3，4-四氫異喹啉(lld)用化合物10 (215mg， l.Ommol)、異丁酰氯(0.21ml， 2.0mmol)、三乙 胺(0.5ml)、碳酸鈣(160mg)獲得11d(178mg， 71%): 'H NMR (CDC13， 200 MHz) 56.76 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.67 (s, C5-H或C8-H 的一種構象異構體)，6.61 (s, C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.20 (s， O-H的一種構象異構體)，6.00 (s， O-H的一種構象異構體)，4.61 (s, Cl-H的一種構象異構體)，4.55 (s, Cl-H的一種構象異構體)，3.86 (s, 0-CH3， 3H), 3.95-3.60 (m, C4-H, 2H), 3.00-2.65 (m， 3H), 1.45 (t, /= 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (CDCb， 50MHz)S175.8, 145.5, 144.4, 126.3, 125.0, 112.6, 111.7, 111,0， 110.7, 56.0, 46.8, 44,0, 43.1, 40.1， 30.4， 29.4， 28.0, 19.3; MS (EI) 249 (M+, 100)， 234, 206, 178， 163, 150。7-羥基-6-甲氧基-2-異丁基羰基^，2,3,4-四氫異喹啉(He)用化合物10(215mg, l.Ommol)、異戊酰氯(0.25ml， 2.Ommo1)、三乙 胺(0,5ml)、碳酸鈣(160mg)獲得11e(158mg， 60%): & NMR (CDC13, 200 MHz) S6.71 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.66 (s, C5-H或C8-H 的一種構象異構體)，6.61 (s, C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.60 (s， C5-H或C8-H的一種構象異構體)，6.21 (s, O-H的一種構象異構體)，6.04 (s， O-H的一種構象異構體)，4.63 (s， Cl-H的一種構象異構體)，4.51 (s， Cl-H的一種構象異構體)，3.85 (s, 0-CH3, 3H), 3.95-3.60 (m， C4-H, 2H), 2.85-2.67 (m, 2H), 2.38-2,05 (m, 3H), 1.10-0.95 (m， 6H); 13C NMR (CDC13, 50 MHz) 5171.4, 145.7, 145.5, 144.6， 144.3, 126.2, 126.1， 125.0， 112.5， 111.7， 111.0, 110.6, 55,9, 47.2, 43.8, 43.6, 42.5, 42,3, 39.8, 29.2， 28.1, 25.6， 22.7; MS (EI) 263 (M+) 220 (100), 206, 178, 163, 150。②在N2位用烷基取代的HMTIO衍生物(12a-f)的制備和它們的結構分 近制備d):將1M氫化鋁鋰(四氫呋喃)溶液加入溶解有化合物lla-c 的經(jīng)蒸餾的四氫呋喃溶液(10-20ml)中，將混合物回流4-5小時。使反應 終止，然后將約5當量重量的乙酸乙酯、l.OM氫氧化鉀溶液和水加入上 述混合物。用二氯甲烷溶劑萃取所得溶液，然后通過柱色譜法獲得化合 物12a-c。制備c):將化合物10與醛(乙醛、苯乙醛或苯甲醛)和異丙氧基鈦 混合并攪拌約1小時。將混合物溶于乙醇，并與氰基硼氫化鈉在RT下攪 拌約20小時，用水終止反應。將所得溶液過濾，減壓除去溶劑。通過柱 色譜法純化所得化合物，然后溶于甲醇。加入35n/。HCl溶液得到鹽酸鹽， 在乙醚中重結晶獲得化合物12d-f。7-羥基-6-甲氧基-2-丙基-l,2,3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12a)根據(jù)制備d):用化合物11a(160mg， 0.68mmol)、 1M氫化鋁鋰(四氫呋喃)(0.6ml， 0.6mmol)獲得12a(138mg， 92%): & NMR (DMS0-4, 400MHz) 59.14 (bs, OH, 1H)， 6.74(s， 1H)， 6.59 (s， 1H)， 4.27 (d, 7 = 12.6 Hz,IH)， 4.06 (dd, J= 16.0, 8.0 Hz, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,37 (bs, IH)， 3.25-3.00(m, 4H)， 2.95-2.卯(bm， 1H), 1.85-1.75 (m, 2H), O.卯(t, /= 7.2 Hz, 3H); 13CNMR (DMS(W6， 100 MHz) S147.3, 145.4, 121.6, 120.1, 112.9, 111.8, 56.4,55.6, 51.0, 48.7, 24.3， 16.8, 11,0; MS (EI) 221 (M+) 192 (100), 150。
2-丁基-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12b)
根據(jù)方法d):化合物11b(140mg， 0.56mmol)、 1M氫化鋁鋰(四氫呋喃)(0.6ml， 0.6mmol)獲得12b (92mg， 70%): & NMR (DMSO-d6， 200 MHz)S6.77(s， 1H), 6,60 (s， 1H), 4.34 (d, /= 13.6 Hz, IH)， 4.06 (dd, /= 15.2， 8.0Hz, IH)， 3.75 (s, 3H), 3.37 (bs, IH)， 3.25-3.00 (m， 4H), 2.95-2.90 (bm, 1H),1.85-1.75 (m， 2H), 1.50-1.25 (m， 2H), 0.93 (t, /= 7.0 Hz， 3H); 13C NMR(DMSCW6, 50 MHz) S147.3, 145.4， 121.6, 120.1, 112.9， 111.8, 55.6, 54.6,51.0， 48.7， 25,1, 24.3， 19.5, 13.5; MS (EI) 235 (M+) 192 (100), 150。
2-(環(huán)己基甲基)-7-羥基-6-甲氧基-l,2,3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12c)
根據(jù)制備d):化合物11c (175mg， 0.6mmol)、 IM氫化鋁鋰(四氫呋喃)(0.4ml， 0.4mmol)獲得12c (149mg，卯％): &畫R (DMSO-^, 200 MHz)S6.76(s， IH)， 6.61 (s， 1H), 4.34 (d, J= 13.2 Hz， IH)， 4.11 (dd， J= 15.2， 7.2Hz, IH)， 3.74 (s, 3H)， 3.65-2.65 (m, 6H), 2.00-1.65 (m, 6H)， 1,40-1.80 (m,5H); 13C NMR (DMSO-4 50 MHz) 5147.3， 145.4, 121.5, 119.9, 113.1，111.8, 60.6, 55.9, 55.6， 32.1, 30.7, 25.4， 25.0, 23.9, 18.5; MS (EI) 275 (M+)192 (100), 150。
2-乙基-7-羥基-6-甲氧基-l,2，3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12d)
用化合物10(215mg， l.Ommol)、乙醛(0.12ml， 2.0mmol)、異丙氧基鈦(370mg， 1.3mmol)、 l.OM氰基硼氫化鈉溶液(四氫呋喃)(0.6ml， 0.6mmol)獲得12d (103mg， 50%): ^麗R (DMSCW6， 200 MHz) S6.76(s， IH)， 6.59(s， IH)， 4.40-4.20 (bm， IH)， 4.20-3.95 (bm, 1H), 3.74 (s， 3H), 3.60-2.65 (m，6H), 1.31 (t力7.6Hz, 3H)。
2-芐基-7-羥基-6-甲氧基-i,2,3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12e)， l.Ommol)、苯甲醛(0.1ml， l.Ommol)、異丙氧基鈦(370mg， 1.3mmol)、 1.0M氰基硼氫化鈉溶液(四氫呋喃)(0.6ml，0.6mmol)獲得12e (140mg， 52%)。
7-羥基-6-甲氧基-2-(2-苯乙基)H3,4-四氫異喹啉，鹽酸鹽(12f)
用化合物10 (215mg， l.Ommol)、苯甲醛(1.2ml， l.Ommol)、異丙氧基鈦(370mg， 1.3mmo1)、 1M氰基硼氫化鈉溶液(四氫呋喃)(0.6ml， 0.6mmo1)獲得12f (158mg， 56%): NMR (DMS0-4 200 MHz) S7.42-7.20 (m, 5H),6.76(s， 1H)， 6.62 (s, 1H)， 4.41 (d, /= 14.8 Hz, 1H), 4.17 (dd， 《/= 14.8， 7.4Hz, 1H)， 3.74 (s, 3H), 3.67 (bs, 1H), 3.48-3.05 (m, 6H), 3.30-2.80 (m， 2H);13C麗R (畫SO-c 6， 50 MHz)M47.4, 145.5， 137.2, 128.64, 128.61， 126.7,121.6， 120.1, 112.9， 111.9, 55.8, 55.6, 51.0, 48.9, 29.4， 24.4。
以用沸石簡單蒸餾過的二氯甲垸、乙酸乙酯和己烷為溶劑，并且購買和使用純度至少為99%的不知名溶劑。然后，在UV范圍內或通過磷鉬酸鹽指示劑來觀察TLC。在瓦里安核磁共振儀(Varian spectrometer)的200 MHz或400 MHz下記錄&和13C NMR譜。用ppm來表示化學位移并參照內溶劑峰。使用仁荷大學(InhaUniversity)或韓國基礎科學研究院(Korean Basic Science Institute (KRISS))提供的質譜儀記錄質譜來測定未知化合物的結構。
細胞培養(yǎng)
在37。C下、5%<:02和95%空氣的氣氛中、在補充有10%牛血清、100IU/I青霉素和10pg/ml鏈霉素的達氏修正依氏培養(yǎng)基(Dulbecco'smodified Eagle's medium, DMEM)中培養(yǎng)BV-2小膠質細胞系、CATH.a神經(jīng)元系和SK-N-BE(2)C神經(jīng)元系。以下列密度將細胞種植在聚苯乙烯培養(yǎng)皿中BV-2 (2.5xl()5個細胞/24孔或2.6xl()6個細胞/60mm培養(yǎng)皿；SK-N-BE(2)C(1.5xl()5個細胞/24孔)；禾B CATH.a (2.4xl04個細胞/96孔)。
NO生成的測定
將一小部分(200iil)細胞培養(yǎng)基和100nl格里斯試劑(Griess reagent,2.5%H3P04、 1%磺胺和0.1%萘基乙二胺二鹽酸鹽)混合于96孔微量滴定板中，用微量滴定板讀數(shù)器(多孔分光光度計)在540nm下讀取樣品吸光度。用亞硝酸鈉的標準曲線來計算亞硝酸鹽濃度。NF-kB r>65轉移到細胞核的試驗
用冷的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)洗滌細胞，并緩慢懸浮于400pl含有10mMHEPES (pH7.9)、 10mMKCl、 O.lmMEDTA、 O.lmMEGTA、1MM DTT和0.5mM PMSF的緩沖溶液中。將細胞懸浮液放于冰上15分鐘，并與25^d NP-40 (0.5%)反應10秒。離心30秒鐘獲得細胞核的粒狀沉淀(nuclear pellet),然后將其重懸于含有20mM HEPES (pH 7.9)、400mMNaCl以及DTT、 EDTA、 EGTA和PMSF各為ImM的冷PBS中。將懸浮液渦旋15分鐘。在ll，OOOxg下，將細胞核的提取物離心15分鐘得到上清液，測量其蛋白含量。對等量的細胞提取物(5嗎)在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯-硝化纖維素膜上。在RT下，用含有8。/。脫脂乳的TBST封閉該膜1小時，用一抗(抗NF-kB p65抗體(l:500稀釋))在4。C下過夜培養(yǎng)，并且進一步用結合有辣根過氧化物酶的二抗再培養(yǎng)一個小時。根據(jù)廠商說明，通過化學發(fā)光檢測法檢測蛋白條帶。
GTPCH、 iNOS、 TNF-a、 IL-1B和C0X隱2的RT-PCR
對由BV-2細胞分離得到的總RNA樣品各5ng進行反轉錄(RT)，然后在94。C下30秒、60。C下40秒和72。C下1分鐘的條件下進行聚合酶鏈反應(PCR)30個循環(huán)。PCR中使用的引物如下
iNOS (正向引物，ATGTCCGAAGCAAACATCAC ;反向引物，TAATGTC CAGGAAGTAGGTG)、
TNF-a (正向引物，CAGACCCTCACACTCAGATCATCTT;反向引物，CAGAGCAATGACTCCAAAGTAGACCT)、
IL-ip (正向引物，ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT;反向引物，CAGGACAGGTAT AGATTCTTTCCTTT )、
C0X-2(正向引物，CAGCAAATCCTTGCTGTTCC;反向引物，TGGGC AAAGAATGC AAAC ATC)、
GTPCH (正向引物，GGATACCAGGAGACCAT CTCA;反向引物，TAGCATGGTGCTAGTGACAGT )。
同時進行B2M的RT-PCR作為內對照(internal control)。對PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，由此證實存在所需尺寸的單條帶。乳酸脫氫酶(XDH)活性的測定
將0.26mM NADH、 2.87mM丙酮酸鈉和lOOmM磷酸鉀緩沖溶液(pH7.4)加入細胞培養(yǎng)基(50pl)中，使總體積為200nl，然后在RT下培養(yǎng)。用微孔分光光度計(SPECTRAMAX340pc; Molecular Devices, Menlo Park,加州，美國)每隔2秒鐘在340nm下測量所得的NAD+，測量持續(xù)5分鐘。
從激活的小膠質細胞釋放的物質對神經(jīng)元死亡的保護作用的評價
將BV-2小膠質細胞以密度為2.5xl()S個細胞/ml種植于24孔培養(yǎng)皿中。過夜培養(yǎng)后，用lmg/ml脂多糖和EHMTIQ (lla)處理細胞，然后再培養(yǎng)12個小時。同時，將SK-N-BE(2)C細胞以0.5xl()5個細胞/ml種植于24孔培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時。除去SK-N-BE(2) C細胞所用的培養(yǎng)基，并向其加入BV-2所用的培養(yǎng)基。24小時后，用LDH測量SK-N-BE(2)C細胞的死亡率。
過氧化物生成的測定
將BV-2小膠質細胞以0.5xl()S個細胞/ml種植于96孔培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24小時后，用不含苯酚紅的Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細胞兩次，并用EHMTIQ (lla)和WST-1來處理。然而，有些樣品不用20^1超氧化物歧化酶(SOD; 800UI/ml)來處理。在37。C下，將所有樣品培養(yǎng)10分鐘。用Spectra Max Plus微孔分光光度計在450nm下讀取樣品吸光度。根據(jù)使用SOD和不使用SOD的樣品之間吸光度的差值計算過氧化物的產(chǎn)率。
清除自由基活性的測定
基于清除2，2-二苯基-l-苦基偕腙肼(DPPH)游離基的活性來評價抗氧化劑活性。將DPPH溶于80%甲醇，使最終濃度為lOOpl。使溶于二甲亞砜的8pl EHMTIQ (lla)與232|il DPPH游離基溶液反應。在RT下，將反應混合物培養(yǎng)25分鐘，然后用SPECTRA Max GEMINI XS熒光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale,加州，美國)在517nm下測量DPPH吸光度。
藥物穩(wěn)定性評價
將ImM EHMTIQ (lla)加入lmg大白鼠肝微粒體樣品中，并且在NADPH-再生體系(2.6mM卩-NADP+、 10mM葡萄糖-6-磷酸鹽、4UI/ml葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶和10mM MgCl2)存在下，在37。C下，將樣品培養(yǎng)O分鐘、30分鐘、120分鐘和240分鐘。將高氯酸加入樣品使最終濃度為500mM，然后使反應停止。在16,000xg下，將反應混合物離心20分鐘。以5-30%線性梯度的乙腈為流動相，用Waters HPLC系統(tǒng)[717 plus自動進樣器、515泵和Symmetry C18柱(4.6mmxl50mm， 5mm)]來純化上清液(120fi1)。用Waters 486 UV檢測器在254nm下檢測EHMTIQ (lla)，用EMPOWER軟件(Millipore Corporation, Milford，馬薩諸塞州，美國)進行分析。
數(shù)據(jù)分析
用重復試驗得到的數(shù)據(jù)計算平均值iSEM。用方差分析(單因素方差分析，one-way ANOVA)進行數(shù)據(jù)計算，并通過事后杜納多重比較檢驗(post Dunnett's multiple comparison test)，對至少3個對照的結果進行比較。用PRISM (GraphPad軟件，圣地亞哥，加州)進行所有的統(tǒng)計學分析。p值O.05被認為是顯著的。
試驗例l: EHMTIO(lla)的作用分析
對NO生成的抑制作用
為測定EHMTIQ (lla)是否抑制在激活的微生物細胞內NO的生成，在該試驗中使用小鼠小膠質細胞系。用不同濃度的EHMTIQ (lla)處理脂多糖(LPS)剌激的BV-2細胞樣品，然后測量樣品的NO水平。結果如圖1所示。
由圖1可看出，LPS引起B(yǎng)V-2細胞的NO水平顯著增加(為3.5±0.1倍)。此處，當用EHMTIQ (lla)處理細胞時，NO的水平與EHMTIQ (11a)濃度成反比。即，與沒有用EHMTIQ處理的對照相比較，低濃度(5nm)EHMTIQ (lla)可以將LPS誘導的NO生成降低到63±4%。此外，高濃度(100nm) EHMTIQ (lla)可將NO的生成抑制到對照水平。只用EHMTIQ(11a)治療并沒有顯示出任何細胞毒性(沒有顯示出)。測得EHMTIQ (11a)的ICso值為2.81 pm。
對源自NADPH氧化酶的過氧化物生成的作用小膠質細胞的激活導致NADPH氧化酶的激活和過氧化物的生成。因此，進行試驗以測定EHMTIQ (lla)是否影響源自NADPH氧化酶的過氧化物的生成。用不同濃度的EHMTIQ (lla)處理LPS刺激的BV-2細胞樣品，然后測量所釋放的過氧化物水平。結果如圖2所示。
參照圖2，與未被激活的細胞相比較，LPS引起過氧化物的生成增加為3.0士0.3倍。此處，過氧化物的生成與EHMTIQ (lla)的濃度成反比。5pm或10pm EHMTIQ (lla)可以使過氧化物的生成降低到62±3.1%或65±3.1%。
3) 對TNF-a基因表達的作用
進行試驗以測定EHMTIQ(lla)是否影響激活的小膠質細胞內TNF-a的生成。用不同濃度的EHMTIQ處理LPS-刺激的BV-2細胞樣品(lla)，并通過RT-PCR估計TNF-a基因的表達。結果如圖3所示。
由圖3可看出，LPS誘導的TNF-a的mRNA水平顯著增加(26士1倍)，與EHMTIQ (lla)的濃度成反比。低濃度(2.5nm)的EHMTIQ (lla)將mRNA水平降到統(tǒng)計學上的顯著水平，具體而言，與只用LPS處理的對照相比較，5pm和100pm EHMTIQ (lla)分別使TNF-a的mRNA水平降低到74±1%和36±1%。
4) 對IL-IB基因表達的作用
進行試驗以考察EHMTIQ (lla)是否影響激活的小膠質細胞內IL-1|3的生成。用不同濃度的EHMTIQ (11a)處理LPS-刺激的BV-2細胞樣品，并通過RT-PCR估計IL-lp基因的表達。結果如圖4所示。
由圖4可看出，LPS引起IL-lp的mRNA水平顯著增加(26±1倍)，與EHMTIQ (lla)濃度成反比。低濃度(2.5nm) EHMTIQ (lla)使mRNA水平降到74±0.7%，這在統(tǒng)計學上是顯著的，而lOOum EHMTIQ (lla)使LPS的作用顯著降低(pX).05，與未用EHMTIQ處理的對照相比較)。
5) 對C0X-2基因表達的作用
剌激前列腺素合成而導致對神經(jīng)元的氧化應激的環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因的表達由于小膠質細胞的激活而提高。用不同濃度的EHMTIQ (11a)處理LPS-剌激的BV-2細胞樣品，并通過RT-PCR估計COX-2基因的表達。結果如圖5所示。
由圖5可看出，LPS弓I起COX-2的mRNA水平顯著增加，與EHMTIQ(lla)濃度成反比。經(jīng)證實，2.5pm、 5pm和10jim的EHMTIQ (lla)分別使COX-2的表達降低了 62±3%、 75±3%和83±2%。
6) 對iNOS基因表達的作用
進行試驗以測定EHMTIQ(lla)是否影響iNOS基因的表達。用不同濃度的EHMTIQ (lla)處理LPS刺激的BV-2細胞樣品，并通過RT-PCR估計iNOS基因的表達。結果如圖6所示。
由圖6可看出，與對照相比較，LPS引起iNOS基因的表達顯著增加8.5倍。與只用LPS處理的對照相比較，用5pm和lOOpm EHMTIQ (lla)處理可分別將該增加抑制到82±1%和24±1%。
7) 對GTPCH基因表達的作用
GTP環(huán)化水解酶I (GTPCH)在四氫生物蝶呤(BH4)的合成中是限速酶，所述BH4對iNOS催化很重要。因此，GTPCH的下調可以降低NO的生成。進行試驗以測定EHMTIQ(lla)是否影響LPS引起的GTPCH基因的表達。用不同濃度的EHMTIQ (lla)處理LPS刺激的BV-2細胞樣品，并通過RT-PCR估計GTPCH基因的表達。結果如圖7所示。
由圖7可看出，GRPCH的mRNA水平通過LPS增加36.2倍，但是與EHMTIQ (lla)濃度成反比。低濃度(2.5nm) EHMTIQ (lla)可以將GTPCH的基因表達降低17±1%，而100pm EHMTIQ (lla)可將其降低75±1%。 EHMTIQ (lla)本身與GTPCH的催化不直接相關(沒顯示出)。
8) 對NF-kB轉移到細胞核的作用
轉錄因子NF-kB轉移到細胞核中以調節(jié)幾種炎性基因的表達。因此，進行試驗以測定EHMTIQ (lla)是否抑制NF-kB轉移到細胞核中。只用LPS處理、或用LPS和不同濃度的EHMTIQ(lla)處理細胞樣品，對各細胞核組分進行電泳和Western印跡以分析NF-kB p65。結果如圖8所示。由圖8可看出，雖然在對照中未檢測出，但是在LPS處理的樣品中NF-kB的表達增加，然而，在10pm EHMTIQ (lla)存在下，卻被完全抑制。
9) 清除自由基的活性
激活的小膠質細胞產(chǎn)生的自由基引起氧化應激和蛋白、核酸和神經(jīng)元脂質的結構變化，從而導致細胞損傷。因此，進行試驗以測定EHMTIQ(lla)是否具有清除自由基的活性。由圖9可看出，清除DPPH游離基的活性與EHMTIQ (lla)的濃度成正比。
10) 保護神經(jīng)元免受免疫傷害導致其死亡的作用
進行試驗以測定EHMTIQ (lla)是否保護多巴胺能細胞免受激活的小膠質細胞釋放的炎性物質引起的傷害。將SK-N-BE(2)C細胞轉移到含有LPS刺激的BV-2細胞所釋放的物質的培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)基含有的LDH活性來測量細胞死亡率，并與用EHMTIQ (lla)處理的BV-2培養(yǎng)基中的細胞死亡率相比較。
由圖IO可看出，在含有LPS刺激的BV-2細胞所釋放物質的培養(yǎng)基中，49±10%的SK-N-BE(2)C細胞受到傷害。然而，當用5pm EHMTIQ(lla)+LPS處理的BV-2細胞得到的培養(yǎng)基處理SK-N-BE(2)C細胞時，細胞損傷率被減少(p〉0.05，與未用EHMRIQ處理的對照相比較)。
11) 藥物穩(wěn)定性
因為幾乎所有的微小分子均被肝內的酶降解，所以藥物對這些酶的穩(wěn)定性非常重要。為體內評價EHMTIQ (lla)的生物利用度，在與肝微粒體接觸后，測量肝微粒體酶對EHMTIQ (lla)的降解率，并與剩余的EHMTIQ平衡。
由圖11可看出，接觸30分鐘后仍有幾乎95%的EHMTIQ (lla)剩余，顯示出該化合物對肝酶具有相當大的穩(wěn)定性。接觸2小時后，約12.52%的EHMTIQ被降解，顯示出如果時間充裕，在體內它可被肝酶完全降解。計算得到EHMTIQ的降解率為1.115±0.203 nmole (EHMTIQ)/分鐘/mg (肝內微粒體蛋白)。
實施例4: TI0衍生物對N0和BH4生成的抑制作用根據(jù)所述方法合成20種四氫異喹啉(TIQ)衍生物，并且進行如下的NO和BH4的生成以及細胞毒性對BV-2激活的小膠質細胞的作用的試驗。
工業(yè)實用性
結果，本發(fā)明化合物作為治療炎性和神經(jīng)退行性疾病的藥物是有效的。
盡管參照某些實施例對本發(fā)明進行了說明和描述，但是本領域技術人員可以理解，在不脫離所附權利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍內，可以對本發(fā)明的形式和細節(jié)進行各種改變。
權利要求
1.一種用于預防和治療退行性疾病的式1所示的7-羥基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氫異喹啉衍生物，[式1]其中，R1選自由H、CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH(CH3)2、CH2CH(CH3)2、Ph、CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，R2選自由CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3、CH2CH2CH2CH3、CH2Ph、CH2CH2Ph、COCH3(Ac)、COCH2CH3、COCH2CH2CH3、COCH(CH3)2、COCH2CH(CH3)2、環(huán)己基甲基和環(huán)己羰基組成的組。
2. —種用于預防和治療炎性疾病的式1所示的7-羥基-6-甲氧基 -1，2,3,4-四氫異喹啉衍生物，[式1]<formula>formula see original document page 2</formula>其中，選自由H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2、 Ph、CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，R2選自由CH3、CH2CH3、 CH2CH2CH3 、 CH2CH2CH2CH3 、 CH2Ph 、 CH2CH2Ph 、 COCH3(Ac)、 COCH2CH3、 COCH2CH2CH3、 COCH(CH3)2、 COCH2CH(CH3)2、環(huán)己基 甲基和環(huán)己羰基組成的組。
3. —種具有保護神經(jīng)元作用的式1所示的7-羥基-6-甲氧基 -1,2,3，4-四氫異喹啉衍生物，[式1]<formula>formula see original document page 3</formula>其中，R！選自由H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3、 CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2、 Ph、 CH2Ph、環(huán)丁基、環(huán)丙基和環(huán)己基組成的組，112選自由CH3、 CH2CH3、 CH2CH2CH3 、 CH2CH2CH2CH3 、 CH2Ph 、 CH2CH2Ph 、 COCH3(Ac)、 COCH2CH3、 COCH2CH2CH3、 COCH(CH3)2、 COCH2CH(CH3)2、環(huán)己基甲基和環(huán)己羰基組成的組。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，P^是H， R2 是Ac。
5. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Rt是CH3， R2是Ac。
6. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，P^是CH2CH3， R2是Ac。
7. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是 CH2CH2CH3， R:s是Ac。
8. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，&是 CH(CH3)2， R2是Ac。
9. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R！是 CH2CH(CH3)2， Rz是Ac。
10. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是Ph， R2 是Ac。
11. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R^是CH2Ph， R2是Ac。
12. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，！^是環(huán)丙基， R2是Ac。
13. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R!是環(huán)丁基， R2是Ac。
14. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是環(huán)己基， R2是Ac。
15. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R,是H， R2 是COCH2CH3。
16. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R4是H， R2 是COCH2CH2CH3。
17. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R是H， R2 是COCH(CH3)2。
18. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R^是H， R2 是COCH2CH(CH3)2。
19. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是H， R2 是環(huán)己羰基。
20. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R^是H， R2是CH2CH3 o
21. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是H， R2 是CH2CH2CH3。
22. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，F(xiàn)4是H， R2 是CH2CH2CH2CH3。
23. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，R,是H， R2 是環(huán)己基甲基。
24. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是H， R2 是CH2Ph。
25. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的衍生物，其中，Ri是H， R2 是CH2CH2Ph。
26. 根據(jù)權利要求1所述的衍生物，其中，所述退行性疾病包括神 經(jīng)退行性疾病和關節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明提供7-羥基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氫異喹啉衍生物及其合成方法。所述化合物顯著抑制激活的小膠質細胞內一氧化氮(NO)和過氧化物的生成，并且抑制TNF-α、IL-1β誘導性NO合成酶和環(huán)氧合酶-2基因的表達。這些衍生物還防止NF-kB轉移到細胞核，減少活性氧(ROS)、抑制GTP環(huán)化水解酶I基因的表達和四氫生物蝶呤(BH₄)的過量生成，以及保護多巴胺能神經(jīng)元免受激活的小膠質細胞引起的傷害。因此，所述化合物對治療炎性和神經(jīng)退行性疾病有效。
文檔編號A61K31/472GK101553229SQ200780045274
公開日2009年10月7日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權日2006年12月8日
發(fā)明者孫孝真, 徐載雄, 池大潤, 黃溫裕 申請人:蔚山大學校產(chǎn)學協(xié)力團