本發(fā)明涉及一種基于atf3基因鑒定奶牛產(chǎn)奶性狀的方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)錄激活因子3(activatingtranscriptionfactor3，atf3)屬于atf/creb轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族代表一個堿性區(qū)/亮氨酸拉鏈區(qū)蛋白質(zhì)大家族，屬于受camp調(diào)控的同一個蛋白家族，其成員主要有：tf1(treb36)，creb，crem，atf2，(cre-bp1)，atf3，atf4，atf5(atfx)，atf6，atf7和b-atf。該家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，即一個位于c末端的高度保守的典型鋅指bzip結(jié)構(gòu)域，一個位于n末端的激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(kid)或磷酸化盒(p-box)和位于kid一側(cè)的兩個反式激活結(jié)構(gòu)域(crem和creb)。其中，堿性結(jié)構(gòu)域負責(zé)與atf/cre啟動子的特定dna序列(tgacgtca)相結(jié)合，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)負責(zé)形成同源二聚體，或與其他擁有bzip結(jié)構(gòu)域的蛋白形成異二聚體(如c/ebp或maf家族)，實現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄的差異化調(diào)節(jié)(thompsonetal.,2009)。目前哺乳動物中己有20種以上編碼與atf/cre位點結(jié)合的蛋白質(zhì)的cdna克隆被成功分離，所有這些cdna編碼的蛋白質(zhì)都含有bzipdna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(haietal.,1999)。研究表明atf3在不同細胞的生存中可能起不同的作用，可能與細胞的類型，應(yīng)激的程度，細胞所處的內(nèi)外環(huán)境、轉(zhuǎn)錄后修飾、相互作用蛋白的影響有關(guān)，有待進一步的研究。

牛的atf3基因位于第16號染色體上，全長12.95kb，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子。其mrna全長1994bp，共編碼181個氨基酸，mrna序列與人的同源性為86％，氨基酸序列與人的同源性為96％。

聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)技術(shù)是一種特異性dna體外擴增技術(shù)。以少量的dna為模板，經(jīng)過變性-退火-延伸的多次循環(huán)，以接近指數(shù)擴增的形式產(chǎn)生大量的目標dna分子，目前，該技術(shù)已經(jīng)成為最常用、也最重要的分子生物學(xué)技術(shù)之一。pcr產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后測序即可進行基因多態(tài)的鑒定工作，檢測方法簡單易行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測?；蚪M16號染色體上第72834301位脫氧核糖核苷酸和/或第72834229位脫氧核糖核苷酸和/或第72833969位脫氧核糖核苷酸和/或第72833562位脫氧核糖核苷酸和/或第72819850位脫氧核糖核苷酸和/或第72818819位脫氧核糖核苷酸和/或第72818292位脫氧核糖核苷酸和/或第72818161位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了檢測?；蚪M16號染色體上第72834301位脫氧核糖核苷酸和/或第72834229位脫氧核糖核苷酸和/或第72833969位脫氧核糖核苷酸和/或第72833562位脫氧核糖核苷酸和/或第72819850位脫氧核糖核苷酸和/或第72818819位脫氧核糖核苷酸和/或第72818292位脫氧核糖核苷酸和/或第72818161位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)在如下m1-m6)中任一種中的應(yīng)用：

m1)鑒定或輔助鑒定牛個體產(chǎn)奶性狀；

m2)制備鑒定或輔助鑒定牛個體產(chǎn)奶性狀的產(chǎn)品；

m3)牛育種；

m4)制備牛育種的產(chǎn)品；

m5)選育305天產(chǎn)奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛；

m6)制備選育305天產(chǎn)奶量高和/或乳脂量高和/或乳蛋白量高和/或乳蛋白率高的牛的產(chǎn)品。

上述應(yīng)用中，所述檢測?；蚪M16號染色體上第72834301位脫氧核糖核苷酸和/或第72834229位脫氧核糖核苷酸和/或第72833969位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成的引物對a；

2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對b；

所述序列a為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列b為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；

或所述檢測?；蚪M16號染色體上第72833562位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下3)或4)：

3)由序列表中序列3所示的單鏈dna分子和序列表中序列4所示的單鏈dna分子組成的引物對c；

4)由序列c所示的單鏈dna分子和序列d所示的單鏈dna分子組成的引物對d；

所述序列c為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列d為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸；

或所述檢測?；蚪M16號染色體上第72819850位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下5)或6)：

5)由序列表中序列5所示的單鏈dna分子和序列表中序列6所示的單鏈dna分子組成的引物對e；

6)由序列e所示的單鏈dna分子和序列f所示的單鏈dna分子組成的引物對f；

所述序列e為將序列5刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列5具有相同功能的核苷酸；

所述序列f為將序列6刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列6具有相同功能的核苷酸；

或所述檢測?；蚪M16號染色體上第72818819位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下7)或8)：

7)由序列表中序列7所示的單鏈dna分子和序列表中序列8所示的單鏈dna分子組成的引物對g；

8)由序列g(shù)所示的單鏈dna分子和序列h所示的單鏈dna分子組成的引物對h；

所述序列g(shù)為將序列7刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列7具有相同功能的核苷酸；

所述序列h為將序列8刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列8具有相同功能的核苷酸；

或所述檢測?；蚪M16號染色體上第72818292位脫氧核糖核苷酸和/或第72818161位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)為如下9)或10)：

9)由序列表中序列9所示的單鏈dna分子和序列表中序列10所示的單鏈dna分子組成的引物對i；

10)由序列i所示的單鏈dna分子和序列g(shù)所示的單鏈dna分子組成的引物對g；

所述序列i為將序列9刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列9具有相同功能的核苷酸；

所述序列g(shù)為將序列10刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列10具有相同功能的核苷酸。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定牛產(chǎn)奶性狀的方法。

本發(fā)明提供的一種鑒定或輔助鑒定牛產(chǎn)奶性狀的方法為如下(1)-(8)中任一種：

(1)是檢測牛個體的基因型是cc基因型還是aa基因型還是ca基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

ca基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體；cc基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于ca基因型的牛個體，ca基因型在第一泌乳期的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體；

ca基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于aa基因型的牛個體；

所述cc基因型為?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基均為c的純合體；

所述aa基因型為?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基均為a的純合體；

所述ca基因型為?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基為c和a的雜合體；

(2)是檢測牛個體的基因型是cc基因型還是aa基因型還是ca基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

cc基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于ca基因型的牛個體，ca基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體；cc基因型的牛個體在第一泌乳期的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第一泌乳期的乳蛋白率高于ca基因型的牛個體；

ca基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體；ca基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于cc基因型的牛個體；

所述cc基因型為牛基因組16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基均為c的純合體；

所述aa基因型為?；蚪M16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基均為a的純合體；

所述ca基因型為牛基因組16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基為c和a的雜合體；

(3)是檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

ag基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于gg基因型的牛個體；aa基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；

ag基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；ag基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體；

所述aa基因型為牛基因組16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基均為a的純合體；

所述gg基因型為?；蚪M16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基均為g的純合體；

所述ag基因型為?；蚪M16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基為a和g的雜合體；

(4)是檢測牛個體的基因型是gg基因型還是tt基因型還是gt基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

tt基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于gt基因型的牛個體，gt基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；

gt基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；gt基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于tt基因型的牛個體；

所述gg基因型為?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基均為g的純合體；

所述tt基因型為?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基均為t的純合體；

所述gt基因型為?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基為g和t的雜合體；

(5)是檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：

aa基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；

gg基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體；

所述gg基因型為?；蚪M16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基均為t的純合體；

所述aa基因型為?；蚪M16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基均為c的純合體；

所述ag基因型為牛基因組16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基為a和g的雜合體；

(6)是檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

gg基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體；aa基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體在第一泌乳期的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于gg基因型的牛個體；

ag基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；ag基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體；

所述gg基因型為牛基因組16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基均為g的純合體；

所述aa基因型為?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基均為a的純合體；

所述ag基因型為?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基為a和g的雜合體；

(7)是檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量：

tt基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體，tc基因型在第一泌乳期的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體；

cc基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體；

所述tt基因型為?；蚪M16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基均為t的純合體；

所述cc基因型為牛基因組16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基均為c的純合體；

所述tc基因型為?；蚪M16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基為t和c的雜合體；

(8)是檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，根據(jù)所述牛個體的基因型確定所述牛個體在第一泌乳期和第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量和/或乳蛋白率：

tt基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體，tc基因型的牛個體在第一泌乳期的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體；

cc基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和乳脂量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體在第二泌乳期的305天產(chǎn)奶量和乳脂量高于tc基因型的牛個體；tc基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體在第二泌乳期的乳蛋白率高于cc基因型的牛個體；

所述tt基因型為?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基均為t的純合體；

所述cc基因型為?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基均為c的純合體；

所述tc基因型為?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基為t和c的雜合體。

上述方法中，

所述(1)中，所述檢測牛個體的基因型是cc基因型還是aa基因型還是ca基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(2)中，所述檢測牛個體的基因型是cc基因型還是aa基因型還是ca基因型的方法為直接測序或測序含有牛基因組16號染色體上第72834229個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(3)中，所述檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型的方法為直接測序或測序含有牛基因組16號染色體上第72833969個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(4)中，所述檢測牛個體的基因型是gg基因型還是tt基因型還是gt基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(5)中，所述檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72819850個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(6)中，所述檢測牛個體的基因型是aa基因型還是gg基因型還是ag基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(7)中，所述檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72818292個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物；

所述(8)中，所述檢測牛個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型的方法為直接測序或測序含有?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物。

上述方法中，

所述(1)和/或(2)和/或(3)中的pcr擴增產(chǎn)物所用的引物為如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的單鏈dna分子和序列表中序列2所示的單鏈dna分子組成的引物對a；

2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對b；

所述序列a為將序列1刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列b為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；

或所述(4)中的pcr擴增產(chǎn)物所用的引物為如下3)或4)：

3)由序列表中序列3所示的單鏈dna分子和序列表中序列4所示的單鏈dna分子組成的引物對c；

4)由序列c所示的單鏈dna分子和序列d所示的單鏈dna分子組成的引物對d；

所述序列c為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列d為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸；

或所述(5)中的pcr擴增產(chǎn)物所用的引物為如下5)或6)：

5)由序列表中序列5所示的單鏈dna分子和序列表中序列6所示的單鏈dna分子組成的引物對e；

6)由序列e所示的單鏈dna分子和序列f所示的單鏈dna分子組成的引物對f；

所述序列e為將序列5刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列5具有相同功能的核苷酸；

所述序列f為將序列6刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列6具有相同功能的核苷酸；

或所述(6)中的pcr擴增產(chǎn)物所用的引物為如下7)或8)：

7)由序列表中序列7所示的單鏈dna分子和序列表中序列8所示的單鏈dna分子組成的引物對g；

8)由序列g(shù)所示的單鏈dna分子和序列h所示的單鏈dna分子組成的引物對h；

所述序列g(shù)為將序列7刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列7具有相同功能的核苷酸；

所述序列h為將序列8刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列8具有相同功能的核苷酸；

或所述(7)和/或(8)中的pcr擴增產(chǎn)物所用的引物為如下9)或10)：

9)由序列表中序列9所示的單鏈dna分子和序列表中序列10所示的單鏈dna分子組成的引物對i；

10)由序列i所示的單鏈dna分子和序列g(shù)所示的單鏈dna分子組成的引物對g；

所述序列i為將序列9刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列9具有相同功能的核苷酸。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定牛產(chǎn)奶性狀的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定牛產(chǎn)奶性狀的產(chǎn)品為上述檢測牛基因組16號染色體上第72834301位脫氧核糖核苷酸和/或第72834229位脫氧核糖核苷酸和/或第72833969位脫氧核糖核苷酸和/或第72833562位脫氧核糖核苷酸和/或第72819850位脫氧核糖核苷酸和/或第72818819位脫氧核糖核苷酸和/或第72818292位脫氧核糖核苷酸和/或第72818161位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質(zhì)。

上述應(yīng)用或方法或產(chǎn)品中，所述牛為奶牛；

所述305天產(chǎn)奶量為從產(chǎn)犢到第305個泌乳日的總產(chǎn)奶量；

所述乳脂量為乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率與產(chǎn)奶量的乘積；所述乳脂率為乳中所含的脂肪的百分率；

所述乳蛋白率為乳中所含的蛋白的百分率；

所述乳蛋白量為乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率與產(chǎn)奶量的乘積；

所述第一泌乳期為母牛第一次產(chǎn)犢后產(chǎn)奶的時期，一般泌乳期是305天；

所述第二泌乳期為母牛第二次產(chǎn)犢后產(chǎn)奶的時期，一般泌乳期是305天。

上述應(yīng)用或方法或產(chǎn)品中，

所述?；蚪M序列為牛基因組bos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列。

本發(fā)明提供了一種基于atf3基因鑒定奶牛產(chǎn)奶性狀的方法及其應(yīng)用。通過實驗表明：g.72834301c>a和/或g.72834229c>a和/或g.72833969a>g和/或g.72833562g>t和/或g.72819850a>g和/或g.72818819a>g和/或g.72818292t>c和/或g.72818161t>c分子標記在第一泌乳期與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到顯著或極顯著水平的關(guān)聯(lián)(p＝0.0494，p＜0.0001)；在第二泌乳期與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到顯著或極顯著水平的關(guān)聯(lián)(p＝0.0461,p＜0.0001)。

附圖說明

圖1為g.72834301c>a、g.72834229c>a、g.72833969a>g、g.72833562g>t、g.72819850a>g、g.72818819a>g、g.72818292t>c和g.72818161t>c的突變位置。(請去除附圖中的g.72818818c>t的箭頭)

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下述實施例中的中國荷斯坦公牛管制凍精樣品和女兒群體的母牛血樣分別來源于北京三元綠荷奶牛養(yǎng)殖中心和北京市畜牧獸醫(yī)總站。

下述實施例中的305天產(chǎn)奶量：從產(chǎn)犢到第305個泌乳日的總產(chǎn)奶量。

下述實施例中的乳脂率：乳中所含的脂肪的百分率。

下述實施例中的乳脂量：乳中所含脂肪的重量，它等于乳脂率與產(chǎn)奶量的乘積。

下述實施例中的乳蛋白率：乳中所含的蛋白的百分率。

下述實施例中的乳蛋白量：乳中所含蛋白的重量，它等于乳蛋白率與產(chǎn)奶量的乘積。

下述實施例中的第一泌乳期：母牛第一次產(chǎn)犢后產(chǎn)奶的時期，一般泌乳期是305天。

下述實施例中的第二泌乳期：母牛第二次產(chǎn)犢后產(chǎn)奶的時期，一般泌乳期是305天。

實施例1、奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的分子標記及鑒定奶牛產(chǎn)奶性狀的方法

一、奶牛atf3基因多態(tài)位點的確定

1、dna池的制備

選擇北京地區(qū)共40頭中國荷斯坦公牛作為基因多態(tài)性檢測的試驗群體，將40頭中國荷斯坦公牛隨機均分為兩組，利用核酸分析儀準確測定其凍精基因組dna的濃度，并將這些dna均稀釋成濃度為50ng/μl，等量混合成兩個dna池，作為pcr擴增的模板。

2、引物的設(shè)計

根據(jù)牛atf3基因序列(位于genbank登錄號為ac_000173.1的序列中，更新日為2014年12月31日)，設(shè)計如表1的14對引物。

表1atf3基因pcr擴增引物序列信息

3、pcr擴增

以步驟1得到的dna池為模板，分別采用表1中的各組引物進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。

表1中引物1f和1r、8f和8r、10f和10r、12f和12r采用降落pcr方法(touchdownpcr)，其余引物采用了常規(guī)pcr的方法。降落pcr的原理大致如下：首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有；隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，退火溫度的逐步降低，非特異擴增也會逐步增多；但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高pcr的特異性和效率。表1中部分引物的退火溫度表示為“a-btouchdown”(a>b)的形式即為降落pcr中所用的退火溫度范圍，表示在反應(yīng)過程中退火溫度逐步由a℃降落到b℃。

pcr反應(yīng)體系如表2所示(表2中的正向引物f和反向引物r分別表示1f和1r、2f和2r等)。常規(guī)pcr和降落pcr反應(yīng)條件如表3所示。

表2、pcr反應(yīng)體系

表3、pcr反應(yīng)條件

4、pcr擴增產(chǎn)物的測序及序列分析

將pcr擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)公牛群體atf3基因上游2000bp的側(cè)翼序列中存在4個snp標記、下游2000bp的側(cè)翼序列中存在4個snp標記，如表4所示，突變位置如圖1所示。

上述atf3基因的8個snp中，

g.72834301c>a是以牛的基因組dna為模板，以1f和1r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列11所示)的自5’末端起第196位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基均為c的個體的基因型命名為純合cc基因型，將?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基均為a的個體的基因型命名為純合aa基因型，將?；蚪M16號染色體上第72834301個核苷酸位點的堿基為c和a的個體的基因型命名為雜合ca基因型。

g.72834229c>a是以牛的基因組dna為模板，以1f和1r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列11所示)自5’末端起第268位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基均為c的個體的基因型命名為純合cc基因型，將?；蚪M16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基均為a的個體的基因型命名為純合aa基因型，將?；蚪M16號染色體上第72834229個核苷酸位點的堿基為c和a的個體的基因型命名為雜合ca基因型。

g.72833969a>g是以牛的基因組dna為模板，以1f和1r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列11所示)的自5’末端起第528位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基)。將牛基因組16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基均為a的個體的基因型命名為純合aa基因型，將?；蚪M16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基均為g的個體的基因型命名為純合gg基因型，將牛基因組16號染色體上第72833969個核苷酸位點的堿基為c和a的個體的基因型命名為雜合ag基因型。

g.72833562g>t是以牛的基因組dna為模板，以2f和2r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列12所示)的自5’末端起第416位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基均為g的個體的基因型命名為純合gg基因型，將牛基因組16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基均為t的個體的基因型命名為純合tt基因型，將?；蚪M16號染色體上第72833562個核苷酸位點的堿基為g和t的個體的基因型命名為雜合gt基因型。

g.72819850a>g是以牛的基因組dna為模板，以11f和11r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列13所示)的自5’末端起第100位(也即為牛基因組bos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基均為a的個體的基因型命名為純合aa基因型，將?；蚪M16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基均為g的個體的基因型命名為純合gg基因型，將牛基因組16號染色體上第72819850個核苷酸位點的堿基為a和g的個體的基因型命名為雜合ag基因型。

g.72818819a>g是以牛的基因組dna為模板，以13f和13r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列14所示)的自5’末端起第246位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基均為a的個體的基因型命名為純合aa基因型，將?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基均為g的個體的基因型命名為純合gg基因型，將?；蚪M16號染色體上第72818819個核苷酸位點的堿基為a和g的個體的基因型命名為雜合ag基因型。

g.72818292t>c是以牛的基因組dna為模板，以14f和14r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列15所示)的自5’末端起第82位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基均為t的個體的基因型命名為純合tt基因型，將牛基因組16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基均為c的個體的基因型命名為純合cc基因型，將?；蚪M16號染色體上第72818292個核苷酸位點的堿基為t和c的個體的基因型命名為雜合tc基因型。

g.72818161t>c是以牛的基因組dna為模板，以14f和14r為引物進行pcr擴增得到的產(chǎn)物(產(chǎn)物的核苷酸序列如序列15所示)的自5’末端起第213位(也即為?；蚪Mbos_taurus_umd3.1.1/bostau8版本參考序列16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基)。將?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基均為t的個體的基因型命名為純合tt基因型，將?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基均為c的個體的基因型命名為純合cc基因型，將?；蚪M16號染色體上第72818161個核苷酸位點的堿基為t和c的個體的基因型命名為雜合tc基因型。

表4、atf3基因發(fā)現(xiàn)的8個snps

二、奶牛atf3基因多態(tài)位點與產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性分析

1、基因型檢測

根據(jù)步驟1中獲得的atf3基因的snps，采用各個snp對應(yīng)的引物對40頭荷斯坦公牛家系共1093頭女兒群體進行群體基因型分型。具體步驟如下：提取女兒群體的母牛血樣(為非抗凝血)的基因組dna，基因組樣品交由博淼生物科技(北京)有限公司使用“用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法”，即maldi-tof-ms檢測技術(shù)對步驟一獲得的8個snps位點的基因型進行檢測?；蛐蜋z測結(jié)果如表5所示。

2、產(chǎn)奶性狀檢測

分別檢測上述1093頭試驗?zāi)概５?05天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5個產(chǎn)奶性狀。每個個體的測定日的記錄依次包括牛只個體號、父號、母號、外祖父號、出生日期、泌乳期、產(chǎn)犢日期、測定日期、測定日產(chǎn)奶量、測定日乳脂率、測定日乳蛋白率、測定日體細胞數(shù)、估計的305天產(chǎn)奶量、估計的305天乳脂量和305天乳蛋白量15項信息。

3、單個snp位點與性狀的關(guān)聯(lián)分析模型

采用sas9.13軟件中的mixed過程對奶牛305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率等5個產(chǎn)奶性狀和基因型進行關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析采用動物模型，具體模型如下：y＝μ+hys+b×m+g+a+e。其中，y：產(chǎn)奶性狀(個體305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)觀察值，μ：總體均值，hys：場年季效應(yīng)，b：協(xié)變量m的回歸系數(shù)，m：產(chǎn)犢月齡效應(yīng)，g：基因型效應(yīng)，a：個體隨機加性遺傳效應(yīng)，e：隨機殘差效應(yīng)。關(guān)聯(lián)分析方法參見文獻“東天，基于gwas后分析策略研究eef1d基因與奶牛產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)[d].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.”。

5個產(chǎn)奶性狀和基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出：

在第一泌乳期時，

g.72834301c>a與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.001)，優(yōu)勢等位基因為c。ca基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體；cc基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于ca基因型的牛個體，ca基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體。

g.72834229c>a與乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到顯著或極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＝0.0494-p＝0.003)，優(yōu)勢等位基因為c。cc基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于ca基因型的牛個體，ca基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體；cc基因型的牛個體的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的乳蛋白率高于ca基因型的牛個體。

g.72833969a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.0057)，優(yōu)勢等位基因為a。ag基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于gg基因型的牛個體；aa基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體。

g.72833562g>t與乳脂量和乳蛋白量分別達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＝0.0029)和顯著關(guān)聯(lián)水平(p＝0.0275)，優(yōu)勢等位基因為t。tt基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于gt基因型的牛個體，gt基因型的牛個體的乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體。

g.72819850a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到極顯著相關(guān)(p<0.0021)，優(yōu)勢等位基因為a。aa基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體。

g.72818819a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到顯著或極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＝0.0108-p＝0.0004)，優(yōu)勢等位基因為c。gg基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量高于aa基因型的牛個體；aa基因型的牛個體的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于ag基因型的牛個體，ag基因型的牛個體的乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于gg基因型的牛個體。

g.72818292t>c與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到顯著相關(guān)(p＝0.0253-p＝0.0156)，優(yōu)勢等位基因為t。tt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體，tc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體。

g.72818161t>c與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到顯著相關(guān)(p<0.0004)，優(yōu)勢等位基因為t。tt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體，tc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體。

在第二泌乳期時，

g.72834301c>a與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.0051)。ca基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率高于aa基因型的牛個體。

g.72834229c>a與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.001)，優(yōu)勢等位基因是c。ca基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于cc基因型的牛個體，cc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體；ca基因型的牛個體的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的乳蛋白率高于cc基因型的牛個體。

g.72833969a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.0015)，優(yōu)勢等位基因是a。ag基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；ag基因型的牛個體的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體。

g.72833562g>t與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.0014)，優(yōu)勢等位基因是t。gt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；gt基因型的牛個體的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體的乳蛋白率高于tt基因型的牛個體。

g.72819850a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到極顯著相關(guān)(p<0.003)。gg基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于ag基因型的牛個體。

g.72818819a>g與305天產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率達到極顯著關(guān)聯(lián)水平(p＜0.0003)，優(yōu)勢等位基因為a。ag基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于aa基因型的牛個體，aa基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于gg基因型的牛個體；ag基因型的牛個體的乳蛋白率高于gg基因型的牛個體，gg基因型的牛個體的乳蛋白率高于aa基因型的牛個體。

g.72818292t>c與305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量達到顯著相關(guān)(p<0.0057)，優(yōu)勢等位基因為c。cc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量高于tc基因型的牛個體。

g.72818161t>c與305天產(chǎn)奶量極顯著相關(guān)(p＝0.0078)，與乳脂量和乳蛋白率達到顯著相關(guān)(p<0.0239)，優(yōu)勢等位基因為c。cc基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量和乳脂量高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體的305天產(chǎn)奶量和乳脂量高于tc基因型的牛個體；tc基因型的牛個體的乳蛋白率高于tt基因型的牛個體，tt基因型的牛個體的乳蛋白率高于cc基因型的牛個體。

表5atf3基因與產(chǎn)奶性狀關(guān)聯(lián)分析(最小二乘均值±標準誤)

注：^*p<0.05，表示差異顯著；^**p<0.01，表示差異極顯著。^a,b同一列數(shù)據(jù)有不同上標表示差異顯著；^a,b同一列數(shù)據(jù)有不同上標表示差異極顯著。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種基于atf3基因鑒定奶牛產(chǎn)奶性狀的方法及其應(yīng)用

<160>15

<210>1

<211>22bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tgtaagggagggaaatagacac22

<210>2

<211>18bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tctggagcttcgggaaag18

<210>3

<211>20bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tgcgaaagctgaaggtgtat20

<210>4

<211>17bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ggcatgagccaatggtg17

<210>5

<211>20bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gagatggtgatgtagggagt20

<210>6

<211>21bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

aagccttcacgaagagttcta21

<210>7

<211>20bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gagatggtgatgtagggagt20

<210>8

<211>21bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

aagccttcacgaagagttcta21

<210>9

<211>16bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

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