本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說(shuō)，涉及到一種口蹄疫病毒滅活抗原純化濃縮方法。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要感染豬、牛、羊、駱駝等偶蹄類(lèi)動(dòng)物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)o、a、c、sat1、sat2、sat3和asia17個(gè)血清型，各血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)，這就增加了口蹄疫防控的難度，一旦爆發(fā)就會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)列為通報(bào)性疫病，也是國(guó)內(nèi)首先防控的a類(lèi)頭號(hào)疫病。在我國(guó)，主要采用接種滅活疫苗的方式來(lái)控制該病。我國(guó)口蹄疫疫苗已形成規(guī)模化生產(chǎn)，但大部分口蹄疫疫苗均為粗制疫苗，抗原含量低，異源蛋白(細(xì)胞蛋白、牛血清蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白、內(nèi)毒素)含量在95％以上，大面積接種存在較嚴(yán)重的副反應(yīng)，口蹄疫防制受到了影響。針對(duì)fmdv滅活抗原制苗過(guò)程中抗原含量不足、純度不高的問(wèn)題，當(dāng)前生產(chǎn)中使用的大規(guī)模濃縮純化方法是膜過(guò)濾澄清技術(shù)配合中空纖維濃縮技術(shù)等物理學(xué)純化工藝。這種工藝能夠在一定程度上將抗原進(jìn)行濃縮、去除部分雜蛋白，提高制苗抗原的純度和含量，但卻存在操作復(fù)雜、對(duì)技術(shù)設(shè)備要求高，純化濃縮成本較高且抗原回收率和濃縮倍數(shù)較低、抗原中雜蛋白去除量較小等缺陷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種口蹄疫病毒滅活抗原純化濃縮方法，該方法能夠高效純化口蹄疫病毒滅活抗原、高效除去雜質(zhì)，抗原回收效率高、濃縮倍數(shù)高，對(duì)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，成本低。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種口蹄疫病毒滅活抗原純化濃縮方法，包括以下步驟：(1)將氨基酸序列如seqidno:2所示的接頭蛋白加入口蹄疫病毒滅活抗原中，混勻，孵育；(2)加入純化載體，混勻，孵育；所述純化載體為乳酸乳球菌骨架；(3)離心，取沉淀。在本發(fā)明中，步驟(1)中孵育條件如下：孵育過(guò)程中震蕩，孵育溫度為20-25℃，孵育時(shí)間為45min-60min。在本發(fā)明中，步驟(2)中孵育條件如下：孵育過(guò)程中震蕩，孵育溫度為20-25℃，孵育時(shí)間為25min-35min。優(yōu)選的技術(shù)方案中，接頭蛋白加入的比例如下：108.7tcid50-109.2tcid50的口蹄疫病毒滅活抗原中加入40～60μg的接頭蛋白。優(yōu)選的技術(shù)方案中，純化載體加入的比例如下：108.7tcid50-109.2tcid50的口蹄疫病毒滅活抗原中加入2.4×109-2.6×109個(gè)純化載體。在本發(fā)明中，所述接頭蛋白是通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)攜帶所述接頭蛋白編碼基因的重組菌獲得的。在本發(fā)明中，所述重組菌是將接頭蛋白編碼基因插入表達(dá)載體pet32中ndeⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)之間，然后導(dǎo)入大腸桿菌后獲得的。在本發(fā)明中，所述重組菌在35-37℃培養(yǎng)1-2h，在24-26℃培養(yǎng)2-4h，在15-17℃靜置10-20min，然后加入終濃度為0.1-0.3mmol/l的異丙基硫代半乳糖苷在15-17℃誘導(dǎo)培養(yǎng)18-22h，獲得接頭蛋白。在本發(fā)明中，所述乳酸乳球菌骨架是將乳酸乳球菌采用鹽酸煮沸、洗滌后得到。本發(fā)明還提供口蹄疫病毒滅活疫苗，上述方法獲得的沉淀。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果：本發(fā)明口蹄疫病毒滅活抗原純化濃縮方法中，由于接頭蛋白可以特異性地與口蹄疫病毒滅活抗原和乳酸乳球菌骨架結(jié)合，從而可以通過(guò)簡(jiǎn)單的離心步驟收獲以沉淀方式富集的口蹄疫病毒滅活抗原，因此本發(fā)明方法能夠高效純化口蹄疫病毒滅活抗原、高效除去雜質(zhì)，抗原回收效率高、濃縮倍數(shù)高，對(duì)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，成本低。本發(fā)明方法對(duì)口蹄疫病毒滅活抗原的回收效率高于99％，雜蛋白去除效率高于90％，所得抗原易于保存和制備口蹄疫多價(jià)疫苗。附圖說(shuō)明圖1是重組表達(dá)質(zhì)粒pet-pfl酶切鑒定結(jié)果，其中m為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道1、2、3為重組質(zhì)粒pet-pfl的ndeⅰ和xhoⅰ雙酶切產(chǎn)物。圖2是誘導(dǎo)表達(dá)接頭蛋白的sds-page電泳及western-blot鑒定結(jié)果，其中圖2(a)為sds-page電泳鑒定，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道1為誘導(dǎo)后pet/bl21全菌，泳道2為誘導(dǎo)后pfl/bl21全菌，泳道3為誘導(dǎo)后pfl/bl21裂解液沉淀，泳道4為誘導(dǎo)后pfl/bl21裂解液上清；圖2(b)為western-blot鑒定結(jié)果，其中m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道1為誘導(dǎo)后pet/bl21全菌，泳道2為誘導(dǎo)后pfl/bl21全菌，泳道3為誘導(dǎo)后pfl/bl21裂解液上清，泳道4為誘導(dǎo)后pfl/bl21裂解液沉淀。圖3為接頭蛋白與純化載體結(jié)合及解離sds-page鑒定結(jié)果，其中m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道1為上清1，泳道2為沉淀1，泳道3為沉淀2，泳道4為上清2。圖4為fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定結(jié)果，其中圖4(a)為sds-page電泳鑒定結(jié)果，泳道1為上清3，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道2為未純化fmdvo型病毒滅活抗原對(duì)照，泳道3為沉淀3；圖4(b)為western-blot鑒定結(jié)果，泳道1為沉淀3，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道2為上清3，泳道3為未純化fmdvo型病毒滅活抗原對(duì)照。圖5為fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定結(jié)果，其中圖5(a)為sds-page電泳鑒定結(jié)果，泳道1為沉淀4，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道2為4上清，泳道3為未純化fmdva型病毒滅活抗原對(duì)照；圖5(b)為western-blot鑒定結(jié)果，泳道1為4沉淀，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道2為上清4，泳道3為未純化fmdva型病毒滅活抗原對(duì)照。圖6為fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定結(jié)果，其中圖6(a)為sds-page電泳鑒定結(jié)果，泳道1為未純化fmdvasia1型病毒滅活抗原對(duì)照，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道2為沉淀5，泳道3為上清5；圖6(b)為western-blot鑒定結(jié)果，m為預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，泳道1為沉淀5，泳道2為上清5，泳道3為未純化fmdvasia1型病毒滅活抗原對(duì)照。圖7為fmdvasia1型滅活疫苗免疫動(dòng)物28d抗體水平阻斷elisa檢測(cè)結(jié)果。圖8為fmdva型滅活疫苗抗原免疫動(dòng)物28d抗體水平阻斷elisa檢測(cè)結(jié)果。圖9為fmdvo型滅活疫苗免疫動(dòng)物28d抗體水平阻斷elisa檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1重組表達(dá)質(zhì)粒pet-pfl的構(gòu)建與鑒定設(shè)計(jì)接頭蛋白，接頭蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。該接頭蛋白為一個(gè)融合蛋白，含有兩個(gè)功能識(shí)別區(qū)，能夠分別特異性地識(shí)別口蹄疫病毒滅活抗原和乳酸乳球菌骨架，該接頭蛋白的編碼基因如seqidno:1所示。為了便于鑒定接頭蛋白，在seqidno:2所示序列的羧基端添加his標(biāo)簽蛋白(hhhhhh)，在seqidno:1所示序列的3’-末端終止密碼子之前添加his標(biāo)簽蛋白編碼序列，添加后序列如seqidno:3所示。另外，在seqidno:3所示的5’-末端設(shè)計(jì)ndei酶切位點(diǎn)、3’-末端分別設(shè)計(jì)xhoⅰ酶切位點(diǎn)，送金斯瑞公司合成。將合成的基因片段插入puc載體，得到重組質(zhì)粒puc-pfl。采用內(nèi)切酶ndeⅰ和xhoⅰ對(duì)重組質(zhì)粒puc-pfl和原核表達(dá)載體pet32a進(jìn)行雙酶切，將接頭蛋白目的基因片段(縮寫(xiě)為pfl片段)和表達(dá)載體片段回收，通過(guò)t4連接酶連接，得到重組表達(dá)載體。puc-pfl和pet32a質(zhì)粒雙酶切體系(30μl)：其中10×q.cutbuffer、q.cutndeⅰ和q.cutxhoⅰ購(gòu)自大連寶生物有限公司。將雙酶切體系混勻后置于37℃條件下作用30min，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，切膠，按照axygen膠回收試劑盒說(shuō)明，分別回收目的片段pfl和載體片段pet32a，通過(guò)t4連接酶連接。t4連接酶連接體系如下(25μl)：將上述連接體系置于16℃條件下，連接12-16h，得到連接產(chǎn)物。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有50mg/ml氨芐青霉素的lb平板，置于37℃條件下靜置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種含有50mg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，按照axygen質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明操作，提取質(zhì)粒，用q.cutndeⅰ和q.cutxhoⅰ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳得到圖1。由圖1可以看出，陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切后，獲得大小為5389bp和981bp兩條目的條帶，鑒定成功的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pet-pfl。實(shí)施例2重組表達(dá)菌pfl/bl21的構(gòu)建與接頭蛋白表達(dá)1.重組表達(dá)菌株pfl/bl21的構(gòu)建將實(shí)施例1獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pet-pfl轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株bl21(de3)，得到重組表達(dá)菌株pfl/bl21。同時(shí)設(shè)空pet32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化bl21(de3)的對(duì)照，得到對(duì)照菌株pet/bl21。2.重組表達(dá)菌株pfl/bl21誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定(1)挑取菌株pfl/bl21和對(duì)照菌株pet/bl21的單克隆，分別接種含有50mg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃、200rmp條件下過(guò)夜培養(yǎng)，獲得母液；(2)將上述各菌株的母液以1:200的比例接種至新鮮lb液體培養(yǎng)基(含50mg/ml氨芐青霉素)，37℃、180rmp條件下培養(yǎng)1.5h，25℃、180rmp條件下培養(yǎng)3h，然后在16℃靜置15min；(3)向步驟(2)所得培養(yǎng)物中加入終濃度為0.2mmol/l的iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為18h；(4)收集上述誘導(dǎo)后菌液，在8000g、4℃條件下離心10min，獲得菌體，菌體用pbs(ph7.0-7.4，0.1mol/l)洗滌兩遍，進(jìn)行重懸；(5)將菌體懸浮液在4℃條件下進(jìn)行高壓裂解，裂解條件：壓力800mpa，裂解3-5個(gè)循環(huán)；(6)將菌體裂解液在4℃、12000rpm條件下離心15min，分別收集裂解液上清和沉淀，沉淀用與上清等量的pbs緩沖液重懸。以上所有操作均在潔凈環(huán)境下進(jìn)行，所用試劑、容器均經(jīng)過(guò)高壓無(wú)菌處理，處理?xiàng)l件為：溫度121℃，壓力103.4kpa，時(shí)間20min；高壓破碎采用無(wú)菌進(jìn)料、收樣泵。(7)為分析鑒定重組表達(dá)菌株pfl/bl21表達(dá)情況，取上述誘導(dǎo)后pfl/bl21全菌及其裂解液上清和沉淀各80μl進(jìn)行sds-page鑒定，其中對(duì)照為誘導(dǎo)后pet/bl21全菌，得到圖2(a)。由圖2(a)可知與對(duì)照菌相比，誘導(dǎo)后pfl/bl21全菌及其裂解液上清和沉淀泳道在36kd處均出現(xiàn)明顯目的條帶，其中裂解液上清中可溶目的蛋白量約為總目的蛋白的50％-60％。(8)為了鑒定接頭蛋白，借助其羧基端his標(biāo)簽蛋白，取上述誘導(dǎo)后pfl/bl21全菌及其裂解液上清和沉淀進(jìn)行western-blot鑒定，其中對(duì)照為誘導(dǎo)后pet/bl21全菌，具體方法如下：將各樣品sds-page電泳結(jié)果轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，然后用含有5％bsa的tbst封閉緩沖液液室溫封閉轉(zhuǎn)印膜1h，tbst緩沖液洗滌3次，37℃條件下與1:5000稀釋的鼠源his單抗(購(gòu)自kpl公司，)孵育1h；接著再用tbst緩沖液洗滌3次，37℃條件下與1:10000稀釋的羊抗鼠hrp-igg二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg抗體，購(gòu)自kpl)孵育45min；抗體孵育結(jié)束后，tbst緩沖液洗滌3次，采用dab顯色試劑盒進(jìn)行顯色，拍照保存。結(jié)果如圖2(b)所示，誘導(dǎo)后pfl/bl21裂解液上清泳道在36kd位置出現(xiàn)一條明顯條帶，證實(shí)該條帶為接頭蛋白條帶。按照本實(shí)施例中方法采用重組表達(dá)菌株pfl/bl21誘導(dǎo)表達(dá)接頭蛋白。將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌進(jìn)行高壓裂解，取裂解液上清，即得接頭蛋白溶液。his(組氨酸)標(biāo)簽蛋白只是為了方便表達(dá)蛋白的鑒定，不影響蛋白表達(dá)及其功能發(fā)揮。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，只要將接頭蛋白編碼基因插入pet32a，然后導(dǎo)入bl21(de3)內(nèi)，篩選陽(yáng)性重組菌，就可以用于生產(chǎn)接頭蛋白。實(shí)施例3接頭蛋白定量分析1.純化載體的制備用新鮮gm17培養(yǎng)基，30℃條件下靜置培養(yǎng)乳酸乳球菌il1403(thecompletegenomesequenceofthelacticacidbacteriumlactococcuslactisssp.lactisil1403，genomeres.,10.1101/gr.169701.)，培養(yǎng)時(shí)間為16-18h，將培養(yǎng)液在8000rpm條件下離心5min，收集菌體，用pbs緩沖液洗滌沉淀一次，加入0.1m鹽酸，煮沸30min，在8000rpm條件下離心5min，然后用pbs緩沖液洗滌沉淀3次，最后用pbs緩沖液重懸，得到乳酸乳球菌骨架，即為純化載體。對(duì)純化載體進(jìn)行血球板計(jì)數(shù)，將2.5×109個(gè)純化載體記為1單位。2.蛋白解離按照實(shí)施例2中方法制備接頭蛋白溶液。在2ml接頭蛋白溶液(總蛋白含量為4.2mg)中，加入過(guò)量的純化載體(10×109個(gè))，孵育30min，使接頭蛋白完全與純化載體結(jié)合，9000rpm離心3min，獲得上清1和沉淀1，沉淀1中含有純化載體及其與接頭蛋白的復(fù)合物。沉淀1以400μlpbs緩沖液重懸。在沉淀1重懸液中加入終濃度為1％的sds(十二烷基硫酸鈉)，在100℃煮沸10min，使接頭蛋白與純化載體解離，然后在12000rpm離心10min，收獲上清液2和沉淀2，沉淀2用與上清2等量的pbs緩沖液重懸。3.蛋白解離鑒定為了分析接頭蛋白是否與純化載體完全解離，對(duì)上清1、沉淀1、上清2和沉淀2進(jìn)行sds-page電泳分析，結(jié)果如圖3所示，解離后接頭蛋白全部在上清2中(泳道4)。4.有效接頭蛋白含量測(cè)定用bca蛋白定量試劑盒測(cè)定上清2中總蛋白含量，結(jié)果即為2ml接頭蛋白溶液(實(shí)施例2中方法制備)中接頭蛋白總量。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，可知每毫升lb培養(yǎng)基最終可得到90μg接頭蛋白。用pbs緩沖液調(diào)整接頭蛋白溶液中接頭蛋白濃度為50μg/ml。實(shí)施例4fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮1.抗原制備fmdvo型病毒采用bhk細(xì)胞增殖，然后將培養(yǎng)物反復(fù)凍融，離心取上清液，滅活后，得到fmdvo型病毒滅活抗原?？乖味葹?08.5tcid50/ml，146s含量為5.6μg/ml。2.fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮(1)無(wú)菌條件下，調(diào)整接頭蛋白溶液(實(shí)施例2中方法制備)中接頭蛋白濃度至50μg/ml，然后加入待純化的fmdvo型病毒滅活抗原中，加入比例為：109.2tcid50的fmdvo型病毒滅活抗原中加入1ml濃度為50μg/ml的接頭蛋白溶液，充分混勻；(2)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育50min，使fmdvo型病毒滅活抗原完全與接頭蛋白結(jié)合；(3)無(wú)菌條件下，加入純化載體，加入比例為：109.2tcid50的fmdvo型病毒滅活抗原中加入2.5×109個(gè)純化載體，充分?jǐn)嚢杌靹颍?4)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育30min，使結(jié)合了fmdvo型病毒滅活抗原的接頭蛋白完全與純化載體結(jié)合；(5)無(wú)菌條件下，9000rpm離心5min，得到上清3和沉淀3。沉淀3為fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物。fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物是fmdvo型病毒滅活抗原、接頭蛋白及乳酸乳球菌骨架的復(fù)合物，形成fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物的原理在于接頭蛋白可以同時(shí)與fmdvo型病毒滅活抗原及乳酸乳球菌骨架進(jìn)行特異性的結(jié)合。因此，本實(shí)施例fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮方法的最終產(chǎn)物為fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物，即沉淀3。以0.1倍原病毒體積的te緩沖液(含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl的水溶液，ph8.0)重懸沉淀3。在純化過(guò)程中，為了保證fmdvo型病毒滅活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接頭蛋白都是過(guò)量加入的，因此，采用本實(shí)施例中純化濃縮方法得到的fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀3)中還含有少量乳酸乳球菌骨架及其與接頭蛋白的復(fù)合物。以下“fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物”均指沉淀3。3.fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定為了驗(yàn)證fmdvo型病毒滅活抗原通過(guò)本實(shí)施例中方法達(dá)到純化濃縮目的，對(duì)本實(shí)施例獲得的上清3和沉淀3進(jìn)行sds-page電泳和western-blot鑒定分析，得到圖4(a)和圖4(b)。對(duì)純化前fmdvo型病毒滅活抗原、沉淀3、上清3進(jìn)行sds-page電泳鑒定，得到圖4(a)。并對(duì)上述sds-page電泳結(jié)果進(jìn)行fmdvo型病毒特異性western-blot鑒定，得到圖4(b)。western-blot具體操作步驟如下：(1)轉(zhuǎn)?。簊ds-page電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡轉(zhuǎn)至pvdf膜(聚偏二氟乙烯膜)，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100v，時(shí)間45min；(2)封閉：將pvdf膜用含5％脫脂乳的tbst緩沖液(ph8.0)，4℃條件下封閉過(guò)夜；(3)孵育一抗：洗滌上述pvdf膜，浸入含2％bsa的tbst溶液1:40稀釋的牛fmdvo型病毒高免血清(高免血清為fmdvo型病毒免疫牛所得)，37℃孵育1h；(4)洗滌：取出pvdf膜，用tbst緩沖液漂洗4次，每次8min；(5)孵育二抗：將pvdf膜浸入含2％bsa的tbst溶液稀釋的hpr-山羊抗牛二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗牛igg抗體，購(gòu)自kpl公司，稀釋度為1:4000)，37℃孵育45min；(6)同(4)洗滌，dab顯色試劑盒顯色。圖4(a)和圖4(b)結(jié)果顯示，純化后sds-page和western-blot在上清3中未檢測(cè)到大小約為25kda的抗原條帶，抗原主要富集在沉淀3即fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物中，且由圖可見(jiàn)，純化后大部分的雜蛋白被去除，抗原純度顯著提高。4.fmdvo型病毒滅活抗原純化濃縮效率測(cè)定(1)為了檢測(cè)本實(shí)施例中方法純化病毒滅活抗原的效率，用fmdvo型抗體阻斷elisa檢測(cè)試劑盒(蘭州獸醫(yī)研究所)提供的抗體包被板檢測(cè)fmdvo型病毒滅活抗原(本實(shí)施例標(biāo)題1)及上清3中抗原含量。數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，上清3中抗原殘余量低于fmdvo型病毒滅活抗原稀釋28(256)倍后的抗原含量，說(shuō)明純化后上清3中殘余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，即本實(shí)施例中純化方法對(duì)抗原的回收效率高于99％。(2)為了分析fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物中抗原純度，采用實(shí)施例3標(biāo)題2中方法將沉淀3進(jìn)行解離，并用bca蛋白定量試劑盒對(duì)沉淀3的解離上清和未純化的fmdvo型病毒滅活抗原(本實(shí)施例標(biāo)題1)進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定，測(cè)得fmdvo型病毒滅活抗原中總蛋白含量為3582μg/ml，沉淀3的解離上清中蛋白總含量為490μg/ml，由于沉淀3的解離上清與fmdvo型病毒滅活抗原的體積比為0.1:1，因此雜蛋白去除率＝[1-(0.1*490/3582)]*100％，高于90％；根據(jù)抗原回收效率高于99％計(jì)算，fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀3)中146s含量約為56μg/ml，fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物中抗原純度＝(56/490)*100％，抗原純度高于10％。實(shí)施例5fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮純化濃縮fmdva型病毒滅活抗原的方法包括如下步驟：1.抗原制備將fmdva型病毒采用bhk細(xì)胞增殖，然后將培養(yǎng)物反復(fù)凍融，離心取上清液，滅活后，得到fmdva型病毒滅活抗原?？乖味葹?08.3tcid50/ml，146s含量為5.2μg/ml。2.fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮(1)無(wú)菌條件下，調(diào)整接頭蛋白溶液(實(shí)施例2中方法制備)中接頭蛋白濃度至50μg/ml，然后加入待純化的fmdva型病毒滅活抗原中，加入比例為：109.0tcid50的fmdva型病毒滅活抗原中加入1ml濃度為50μg/ml的接頭蛋白溶液，充分混勻；(2)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育55min使fmdva型病毒滅活抗原完全與接頭蛋白結(jié)合；(3)無(wú)菌條件下，加入純化載體，加入比例為：109.0tcid50的fmdva型病毒滅活抗原中加入2.5×109個(gè)純化載體，充分?jǐn)嚢杌靹颍?4)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育30min，使結(jié)合了fmdva型病毒滅活抗原的接頭蛋白完全與純化載體結(jié)合；(5)無(wú)菌條件下，9000rpm離心5min，得到上清4和沉淀4。沉淀4即為fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物。以0.1倍原病毒體積的te緩沖液(含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl的水溶液，ph8.0)重懸。fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物是fmdva型病毒滅活抗原、接頭蛋白及乳酸乳球菌骨架的復(fù)合物，形成fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物的原理在于接頭蛋白可以同時(shí)與fmdva型病毒滅活抗原及乳酸乳球菌骨架進(jìn)行特異性的結(jié)合。因此，本實(shí)施例fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮方法的最終產(chǎn)物為fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物，即沉淀4。在純化過(guò)程中，為了保證fmdva型病毒滅活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接頭蛋白都是過(guò)量加入的，因此，fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀4)中還含有少量乳酸乳球菌骨架及其與接頭蛋白的復(fù)合物。3.fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定為了驗(yàn)證fmdva型病毒滅活抗原通過(guò)本實(shí)施例中方法達(dá)到純化濃縮目的，對(duì)純化前fmdva型病毒滅活抗原、本實(shí)施例標(biāo)題2獲得的上清4和沉淀4進(jìn)行sds-page電泳和western-blot鑒定分析，得到圖5(a)和圖5(b)。western-blot操作步驟同實(shí)施例4，不同之處在于一抗換成fmdva型病毒高免血清。fmdva型病毒高免血清制備方法：fmdva型病毒免疫牛，取抗體效價(jià)合格的牛采集血液，分離后得到高免血清。圖5(a)和圖5(b)結(jié)果顯示，上清4在sds-page電泳和western-blot中未檢測(cè)到大小約為25kda的抗原條帶，抗原主要富集在沉淀4即fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物中，且由圖可見(jiàn)，純化后大部分的雜蛋白被去除，抗原純度顯著提高。4.fmdva型病毒滅活抗原純化濃縮效率測(cè)定(1)為了檢測(cè)本實(shí)施例中方法純化濃縮病毒滅活抗原效率，用fmdva型抗體阻斷elisa檢測(cè)試劑盒(蘭州獸醫(yī)研究所)提供的抗體包被板檢測(cè)fmdva型病毒滅活抗原及上清4中抗原含量。數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，上清4中抗原殘余量低于fmdva型病毒滅活抗原稀釋28(256)倍后的抗原含量，說(shuō)明純化后上清4中殘余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，即本實(shí)施例中純化濃縮方法對(duì)抗原的回收效率高于99％。(2)為了分析fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物中抗原純度，采用實(shí)施例3標(biāo)題2中方法將沉淀4進(jìn)行解離，并用bca蛋白定量試劑盒對(duì)沉淀4的解離上清和未純化的fmdva型病毒滅活抗原進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定，測(cè)得未純化抗原總蛋白含量為3400μg/ml，沉淀4的蛋白總含量為456μg/ml，由于沉淀4的解離上清與fmdva型病毒滅活抗原的體積比為0.1:1，因此雜蛋白去除率＝[1-(0.1*456/3400)]*100％，高于90％；以抗原回收效率高于99％計(jì)算，fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀4)中146s含量約為52μg/ml，fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀4)中抗原純度＝(52/456)*100％，高于10％。實(shí)施例6fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮1.抗原制備將fmdvasia1型病毒采用bhk細(xì)胞增殖，然后將培養(yǎng)物反復(fù)凍融，離心取上清液，滅活后，得到fmdvasia1型病毒滅活抗原?？乖味葹?08.2tcid50/ml，146s含量為5.3μg/ml。2.fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮(1)無(wú)菌條件下，調(diào)整接頭蛋白溶液(實(shí)施例2中方法制備)中接頭蛋白濃度至50μg/ml，然后加入待純化的fmdvasia型病毒滅活抗原中，加入比例為：108.9tcid50的fmdvo型病毒滅活抗原中加入1ml濃度為50μg/ml的接頭蛋白溶液，充分混勻；(2)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育45min，使fmdv型病毒滅活抗原與接頭蛋白結(jié)合；(3)無(wú)菌條件下，加入純化載體，加入比例為：108.9tcid50的fmdvasia1型病毒滅活抗原中加入2.5×109個(gè)純化載體，充分?jǐn)嚢杌靹颍?4)將上述混合物置于25℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床中，震蕩孵育30min，使結(jié)合了fmdvasia1型病毒滅活抗原的接頭蛋白完全與純化載體結(jié)合；(5)無(wú)菌條件下，9000rpm離心5min，得到上清5和沉淀5。沉淀5即為fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物。以0.1倍原病毒體積的te緩沖液重懸重懸。fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物是fmdvasia1型病毒滅活抗原、接頭蛋白及乳酸乳球菌骨架的復(fù)合物，形成fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物的原理在于接頭蛋白可以同時(shí)與fmdvasia1型病毒滅活抗原及乳酸乳球菌骨架進(jìn)行特異性的結(jié)合。因此，本實(shí)施例fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮方法的最終產(chǎn)物為fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物，即沉淀5。在純化過(guò)程中，為了保證fmdvasia1型病毒滅活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接頭蛋白都是過(guò)量加入的，因此，fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀5)中還含有少量乳酸乳球菌骨架及其與接頭蛋白的復(fù)合物。3.fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮鑒定為了驗(yàn)證fmdvasia1型病毒滅活抗原通過(guò)本實(shí)施例中方法達(dá)到純化濃縮目的，對(duì)上清5和沉淀5進(jìn)行sds-page電泳和western-blot鑒定分析，得到圖6(a)和圖6(b)。western-blot操作步驟同實(shí)施例4，不同之處在于一抗換成牛fmdvasia1型病毒高免血清。牛fmdvasia1型病毒高免血清制備方法：fmdvasia1型病毒免疫牛，取抗體效價(jià)合格的牛采集血液，分離后得到高免血清。圖6(a)和圖6(b)結(jié)果顯示，上清5在sds-page電泳和western-blot中未檢測(cè)到大小約為25kda的抗原條帶，抗原主要富集在沉淀5即fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀5)中，且由圖可見(jiàn)，純化后大部分的雜蛋白被去除，抗原純度顯著提高。4.fmdvasia1型病毒滅活抗原純化濃縮效率測(cè)定(1)為了檢測(cè)本實(shí)施例中方法純化病毒滅活抗原效率，用fmdvasia1型抗體阻斷elisa檢測(cè)試劑盒(蘭州獸醫(yī)研究所)提供的抗體包被板檢測(cè)fmdvasia1型病毒滅活抗原及上清5中抗原含量。數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，上清5中抗原殘余量低于fmdvasia1型病毒滅活抗原稀釋27(128)倍后的抗原含量，說(shuō)明純化后殘余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，因此，抗原回收效率高于99％。(2)為了分析fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物中抗原純度，采用實(shí)施例3標(biāo)題2中方法將沉淀5進(jìn)行解離，并用bca蛋白定量試劑盒對(duì)沉淀5的解離上清和未純化fmdvasia1型病毒滅活抗原進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定，測(cè)的未純化抗原總蛋白含量為3290μg/ml，沉淀5蛋白總含量為416μg/ml，由于沉淀5解離上清與fmdvasia1型病毒滅活抗原的體積比為0.1:1，因此雜蛋白去除率＝[1-(0.1*416/3290)]*100％，高于90％；以抗原回收效率高于99％計(jì)算，fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀5)中146s含量約為53μg/ml，fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物(沉淀5)中抗原純度＝(53/416)*100％，高于10％。實(shí)施例7fmdv病毒滅活抗原純化濃縮免疫效力鑒定將fmdvasia1型病毒滅活抗原(實(shí)施例6中標(biāo)題1)、fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物(實(shí)施例6標(biāo)題2中沉淀5)分別采用te緩沖液(含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl，ph8.0)稀釋至146s濃度為5.3μg/ml，純化載體含量約為5×108個(gè)，然后與206佐劑(購(gòu)自法國(guó)seepic)按照體積比為46:54混合，乳化，分別制得asia1型滅活疫苗及其對(duì)照苗。將fmdva型病毒滅活抗原(實(shí)施例5標(biāo)題1)、fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物(實(shí)施例5標(biāo)題2中沉淀4)分別采用te緩沖液(含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl，ph8.0)稀釋至146s濃度為5.2μg/ml，純化載體含量約為5×108個(gè)，然后與206佐劑(購(gòu)自法國(guó)seepic)按照體積比為46:54混合，乳化，分別制得a型滅活疫苗及其對(duì)照苗。將fmdvo型病毒滅活抗原(實(shí)施例4標(biāo)題1)、fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物(實(shí)施例4標(biāo)題2中沉淀3)分別采用te緩沖液(含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl的水溶液，ph8.0)稀釋至146s濃度為5.6μg/ml，純化載體含量為約5×108個(gè)，然后與206佐劑(購(gòu)自法國(guó)seepic)按照體積比為46:54混合，乳化，分別制得o型滅活疫苗及其對(duì)照苗。按照實(shí)施例4標(biāo)題2中方法將接頭蛋白溶液與純化載體混合，孵育，除了不加入fmdv病毒滅活抗原外，其他條件不變，取沉淀采用te緩沖液(含有10mmol/ltris、50mmol/lnacl的水溶液，ph8.0)稀釋至含有5×108個(gè)純化載體，然后與206佐劑(購(gòu)自法國(guó)seepic)按照體積比為46:54混合，乳化，制得對(duì)照疫苗1。對(duì)照疫苗2：含有10mmol/ltris，50mmol/lnacl的水溶液，ph8.0。各疫苗的編號(hào)及所含抗原見(jiàn)表1。表1疫苗的編號(hào)及所含抗原疫苗名稱(chēng)抗原asia1型滅活疫苗fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物asia1型對(duì)照滅活疫苗fmdvasia1型病毒滅活抗原a型滅活疫苗fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物a型對(duì)照滅活疫苗fmdva型病毒滅活抗原o型滅活疫苗fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物o型對(duì)照滅活疫苗fmdvo型病毒滅活抗原對(duì)照疫苗1純化載體與接頭蛋白復(fù)合物對(duì)照疫苗2te緩沖液(1)免疫效果試驗(yàn)取40-45日齡的口蹄疫抗體陰性的健康仔豬80頭，按照按照表2中方法隨機(jī)分為8組，頸部肌肉注射方式免疫40-45日齡的口蹄疫抗體陰性的健康仔豬，免疫劑量為2ml/頭，每組免疫的疫苗見(jiàn)表2。免疫后28d采血，分離血清，檢測(cè)液相阻斷抗體水平，評(píng)價(jià)抗原復(fù)合物的免疫原性。從圖7、8、9可見(jiàn)，對(duì)照疫苗1(g7組)與對(duì)照疫苗2(g8組)免疫組抗體水平為陰性，說(shuō)明純化過(guò)程中引入的純化載體、接頭蛋白與te緩沖液不會(huì)影響疫苗抗體水平；三種fmdv亞型病毒純化后抗原復(fù)合物免疫后的抗體水平顯著高于未純化抗原制成的疫苗，其中fmdvasia1型病毒滅活抗原復(fù)合物免疫組(g1)比其對(duì)照組(g2)平均抗體水平約高1個(gè)滴度，fmdva型病毒滅活抗原復(fù)合物免疫組(g3)比其對(duì)照組(g4)平均抗體水平約高0.7個(gè)滴度，fmdvo型病毒滅活抗原復(fù)合物免疫組(g5)比其對(duì)照組(g6)平均抗體水平約高2個(gè)滴度。三種fmdv亞型病毒滅活抗原復(fù)合物免疫后的抗體滴度升高水平不一致，可能與抗原或是機(jī)體免疫環(huán)境有關(guān)，不影響其整體抗體提高的趨勢(shì)。說(shuō)明本發(fā)明純化濃縮方法制備的fmdv病毒滅活抗原復(fù)合物可用于制備抗原純度高、免疫效果較好的單價(jià)或多價(jià)口蹄疫疫苗。表2免疫分組分組疫苗名稱(chēng)g1asia1型滅活疫苗g2asia1型對(duì)照滅活疫苗g3a型滅活疫苗g4a型對(duì)照滅活疫苗g5o型滅活疫苗g6o型對(duì)照滅活疫苗g7對(duì)照疫苗1g8對(duì)照疫苗2(2)副反應(yīng)試驗(yàn)g1-g8組免疫后立即觀察記錄仔豬免疫應(yīng)激反應(yīng)，包括體溫、采食、精神狀態(tài)等，并對(duì)免疫后28d內(nèi)仔豬生長(zhǎng)狀況(采食、體重、被毛等)進(jìn)行觀察記錄。結(jié)果顯示，g1、g3、g5、g7組與g8對(duì)照組免疫后體溫、采食均正常，無(wú)明顯異常反應(yīng)，生長(zhǎng)狀況良好。g2、g4組各有一頭仔豬免疫后0.5h出現(xiàn)亢奮應(yīng)激，g2組有1頭、g4、g6各有兩頭出現(xiàn)體溫升高，采食量下降等應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果表明g1、g3、g5組免疫的疫苗由于其fmdv抗原復(fù)合物的純度顯著提高，疫苗的免疫應(yīng)激反應(yīng)明顯減輕。g7對(duì)照組免疫后至檢測(cè)結(jié)束并未出現(xiàn)明顯異常反應(yīng)，說(shuō)明在純化過(guò)程中引入的純化載體和接頭蛋白并不會(huì)給機(jī)體帶來(lái)毒副作用，不會(huì)影響機(jī)體正常生長(zhǎng)。sequencelisting<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種口蹄疫病毒滅活抗原純化濃縮方法<130>201701261<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>957<212>dna<213>artificial<220><223>接頭蛋白編碼基因<400>1atgactacttataccgtcaaatctggtgatactctttggggaatctcacaaagaacaggt60tcagcttcttctacaaattcaggtggttcaaacaattccgcaagcactactccaaccact120tctgtgacacctgcaaaaccaacttcacaaacaactgttaaggttaaatccggagatacc180ctttgggcgctatcagtaaaatataaaactagtattgctcaattgaaaagttggaatcat240ttaagttcagataccatttatattggtcaaaatcttattgtttcacaatctgctgctgct300tcaaatccttcgacaggttcaggctcaactgctaccaataactcaaactcgacttcttct360aactcaaatgcctcaattcataaggtcgttaaaggagatactctctggggactttcgcaa420aaatctggcagcccaattgcttcaatcaaggcttggaatcatctacgaataaaaatgcct480caattcataaggtcgttaaaggagatactctctggggactttcaattgcttcaatcaagg540cttggaatcatttatctagcgatggaattagtgtcgctcaaattcaaagtgcgaataatc600ttaaaagtaccattatctacattgtactgcatactattttatattcaaagtgcgaataat660cttaaaagtaccattatctacattggtcaaaaacttgtactggatacctgtaacgaaagt720accatctatctgcgtaaataccagtccaaagttaaacgccaataccagtccgaagtcgac780atcattcgcgatgaaatcaccagcgacaccagctacgaaagcgttggtcgtttcattcgt840gacgatgcgaaaaacatggtgctgatgaaccgtaagccggaggatgcggtttactatggt900ctgcgtgcgagcaccgcgggttgggaaccgcgttgtagctggggtacccccgtttaa957<210>2<211>318<212>prt<213>artificial<220><223>接頭蛋白<400>2metthrthrtyrthrvallysserglyaspthrleutrpglyileser151015glnargthrglyseralaserserthrasnserglyglyserasnasn202530seralaserthrthrprothrthrservalthrproalalysprothr354045serglnthrthrvallysvallysserglyaspthrleutrpalaleu505560servallystyrlysthrserilealaglnleulyssertrpasnhis65707580leuserseraspthriletyrileglyglnasnleuilevalsergln859095seralaalaalaserasnproserthrglyserglyserthralathr100105110asnasnserasnserthrserserasnserasnalaserilehislys115120125valvallysglyaspthrleutrpglyleuserglnlysserglyser130135140proilealaserilelysalatrpasnhisleuargilelysmetpro145150155160glnpheileargserleulysgluileleuserglyasppheglnleu165170175leuglnserargleuglyileiletyrleualametgluleuvalser180185190leulysphelysvalargileileleulysvalproleuserthrleu195200205tyrcysileleuphetyrileglnseralaasnasnleulysserthr210215220ileiletyrileglyglnlysleuvalleuaspthrcysasngluser225230235240thriletyrleuarglystyrglnserlysvallysargglntyrgln245250255sergluvalaspileileargaspgluilethrseraspthrsertyr260265270gluservalglyargpheileargaspaspalalysasnmetvalleu275280285metasnarglysprogluaspalavaltyrtyrglyleuargalaser290295300thralaglytrpgluproargcyssertrpglythrproval305310315<210>3<211>975<212>dna<213>artificial<220><223>帶有his標(biāo)簽的接頭蛋白<400>3atgactacttataccgtcaaatctggtgatactctttggggaatctcacaaagaacaggt60tcagcttcttctacaaattcaggtggttcaaacaattccgcaagcactactccaaccact120tctgtgacacctgcaaaaccaacttcacaaacaactgttaaggttaaatccggagatacc180ctttgggcgctatcagtaaaatataaaactagtattgctcaattgaaaagttggaatcat240ttaagttcagataccatttatattggtcaaaatcttattgtttcacaatctgctgctgct300tcaaatccttcgacaggttcaggctcaactgctaccaataactcaaactcgacttcttct360aactcaaatgcctcaattcataaggtcgttaaaggagatactctctggggactttcgcaa420aaatctggcagcccaattgcttcaatcaaggcttggaatcatctacgaataaaaatgcct480caattcataaggtcgttaaaggagatactctctggggactttcaattgcttcaatcaagg540cttggaatcatttatctagcgatggaattagtgtcgctcaaattcaaagtgcgaataatc600ttaaaagtaccattatctacattgtactgcatactattttatattcaaagtgcgaataat660cttaaaagtaccattatctacattggtcaaaaacttgtactggatacctgtaacgaaagt720accatctatctgcgtaaataccagtccaaagttaaacgccaataccagtccgaagtcgac780atcattcgcgatgaaatcaccagcgacaccagctacgaaagcgttggtcgtttcattcgt840gacgatgcgaaaaacatggtgctgatgaaccgtaagccggaggatgcggtttactatggt900ctgcgtgcgagcaccgcgggttgggaaccgcgttgtagctggggtacccccgttcaccac960caccaccaccactaa975當(dāng)前第1頁(yè)12