本發(fā)明涉及一種靶向癌干細(xì)胞的合成的勝肽。本發(fā)明還公開了包含該裝置的套組。本發(fā)明還公開一種組合物，包含所述的合成的勝肽。本發(fā)明還公開一種篩選特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽的方法。
背景技術(shù)：
：：自1994年首次發(fā)現(xiàn)急性骨髓性白血病的癌干細(xì)胞(cscs)以來，亦在乳癌、腦癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌和胰臟癌中證實(shí)分辨出cscs。除了一般干細(xì)胞的自我更新活性，cscs具有對(duì)化療、放療、低氧及免疫監(jiān)測(cè)的抗性。此外，cscs被認(rèn)為是癌癥復(fù)發(fā)的主因。仍需要特異性靶向癌干細(xì)胞的藥劑，以用于治療、影像和其他目的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一方面，本發(fā)明提供一種靶向癌干細(xì)胞的合成的勝肽，其由seqidno:1至seqidno:15任一的氨基酸序列所組成。另一方面，本發(fā)明提供所述的合成的勝肽在癌癥的診斷的應(yīng)用。又一方面，本發(fā)明提供所述的合成的勝肽在將治療劑靶向癌干細(xì)胞的應(yīng)用。所述的合成的勝肽可接合至一可偵測(cè)部分(detectablemoiety)。在本發(fā)明的部分具體實(shí)施例中，所述可偵測(cè)部分為一放射性標(biāo)記、一熒光團(tuán)或一磁性成像造影劑。所述的合成的勝肽可接合至一治療劑。在本發(fā)明的部分較佳具體實(shí)施例中，所述治療劑為一抗癌劑。所述抗癌劑包括但不限于一化療劑、一放射治療劑或一免疫治療劑。另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含所述的合成的勝肽以及一醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑。較佳地，所述的合成的勝肽結(jié)合至一治療劑。又另一方面，本發(fā)明提供一種篩選特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽的方法，其包含：藉由使用一噬菌體表達(dá)系統(tǒng)來建立一寡勝肽庫；使該寡勝肽庫中的噬菌體與一癌細(xì)胞系的一般癌細(xì)胞的培養(yǎng)物接觸；使未與所述一般癌細(xì)胞結(jié)合的噬菌體與該癌細(xì)胞系的癌干細(xì)胞的培養(yǎng)物接觸；以及從與所述癌干細(xì)胞結(jié)合的噬菌體中篩選出特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽。從以下的配合附圖的較佳具體實(shí)施例的說明，了解本發(fā)明的所述方面及其他方面，然而，在不悖離本文揭露的創(chuàng)新概念的精神與范圍下可進(jìn)行變化及修改。附圖說明圖1a顯示癌干細(xì)胞(csc)歸巢勝肽(hps)對(duì)cscs的選擇性結(jié)合。經(jīng)羅丹明b標(biāo)記的cschp1(rd-cschp-1)和cschp2(rd-cschp-2)以及經(jīng)fitc記的cschp11(fitc-cschp-11)被直接用來對(duì)emt6cscs和癌細(xì)胞(ccs)染色。細(xì)胞以dapi復(fù)染。在相同的曝光條件下擷取熒光影像。圖1b顯示cschps對(duì)cscs的選擇性結(jié)合。emt-6、ct26、hepa1-6和panc-1的cscs分別以rd-cschp-1、rd-cschp-2、fitc-cschp-3、fitc-cschp-8、fitc-cschp-9、fitc-cschp-10或fitc-cschp-11染色。在相同的曝光條件下擷取熒光影像。圖2顯示cschp-hp1-dsred對(duì)panc-1ccs和cscs的結(jié)合。最終濃度為25μg/ml的cschp-hp1-dsred重組蛋白被用來對(duì)panc-1ccs和cscs染色。箭頭指出在panc-1cc組別中觀察到的微弱信號(hào)。圖3a-圖3f顯示透過聚糖微陣列和免疫熒光分析的cschps的靶標(biāo))。圖3a顯示以生物素標(biāo)記的cschp-hp1的聚糖微陣列分析結(jié)果。圖3b顯示以生物素標(biāo)記的cschp-9的聚糖微陣列分析結(jié)果。圖3c顯示globo系列聚糖(聚糖26)對(duì)lacto/neolacto系列聚糖(glycan19)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，其以同一微陣列的收集自15個(gè)cschps的陽性對(duì)照組信號(hào)3進(jìn)行歸一化(normalized)。圖3d顯示來自15個(gè)cschps的聚糖63和聚糖69的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。圖3e顯示收集自cschp-10、cschp-11和cschp-hp2芯片的聚糖66(gal-b-1,3-galnac-b-)、聚糖67(gal-b-1,3-(neu5ac-a-2,6)-galnac-b-)、聚糖68(neu5ac-a-2,6-gal-b-1,3-galnac-b-)、聚糖69(neu5ac-a-2,6-gal-b-1,3-(neu5ac-a-2,6)-galnac-b-)和聚糖70(neu5ac-a-2,3-gal-b-1,3-(neu5ac-a-2,6)-galnac-b-)信號(hào)。圖3f為panc-1cscs上的干細(xì)胞特異性聚糖標(biāo)記的免疫熒光影像，其以抗globo系列(ssea-4和gbh)、抗lacto/neolacto(lc/nlc)系列(ssea-1andssea-5)和抗lewisy的單克隆抗體來完成。圖4a為一流程圖，顯示自原始的m13phd7庫的第一級(jí)篩選，以制備emt6cschp庫，以及第二級(jí)篩選以產(chǎn)生ct26cschp庫、hepa1-6cschp庫、csc/eschp庫和cschp庫。圖4b為一流程圖，例示panc-1cschp庫的建立。具體實(shí)施方式除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者所理解的相同的涵義。在一方面，本發(fā)明提供一種靶向癌干細(xì)胞的合成的勝肽，其由seqidno:1至seqidno:15任一的氨基酸序列所組成。所述合成的勝肽能夠選擇性地或特異性地歸巢至(homesto)癌干細(xì)胞，因此其可以一結(jié)合物的形式使用，以將透過全身性投藥的治療劑選擇性地靶向至癌干細(xì)胞。這樣的劑選擇性靶向能夠增加投遞至癌干細(xì)胞的藥劑的有效量，同時(shí)減低藥劑對(duì)其他細(xì)胞或身體的其他部分造成副作用的可能性。在本文中所使用的術(shù)語“癌干細(xì)胞(cancerstemcells,cscs)”是指哺乳動(dòng)物的癌干細(xì)胞，例如，小鼠的或人類的癌干細(xì)胞。本發(fā)明的合成的勝肽歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至cscs，但不與(一般)癌細(xì)胞結(jié)合或非常弱地結(jié)合至(一般)癌細(xì)胞。所述癌干細(xì)胞包括但不限于以下癌癥的癌干細(xì)胞：乳癌、肝癌、胰臟癌及結(jié)腸癌(大腸癌)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列sqptwmf(seqidno:1)所組成(亦稱為“cschp-1”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-1歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-1歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列g(shù)mmsspp(seqidno:2)所組成(亦稱為“cschp-2”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-2歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-2歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列fsgggnh(seqidno:3)所組成(亦稱為“cschp-3”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-3歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-3歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-3歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至肝癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列fpftknl(seqidno:4)所組成(亦稱為“cschp-4”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-4歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列atygnlw(seqidno:5)所組成(亦稱為“cschp-5”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-5歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-5歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列yhmpalm(seqidno:6)所組成(亦稱為“cschp-6”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-6歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-6歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列hggvrly(seqidno:7)所組成(亦稱為“cschp-7”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-7歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-7歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列eltpltl(seqidno:8)所組成(亦稱為“cschp-8”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-8歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。在另一具體實(shí)施例中，cschp-8歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至結(jié)腸癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列g(shù)psasrn(seqidno:9)所組成(亦稱為“cschp-10”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-10歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列g(shù)lapfna(seqidno:10)所組成(亦稱為“cschp-11”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-6歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至乳癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列kiyttld(seqidno:11)所組成(亦稱為“cschp-9”)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列nlqppay(seqidno:12)所組成(亦稱為“cschp-12”)。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列g(shù)pkvtiw(seqidno:13)所組成(亦稱為“cschp-hp1”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-hp1歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至胰臟癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列g(shù)spvmsw(seqidno:14)所組成(亦稱為“cschp-hp2”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-hp2歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至胰臟癌的cscs。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施例，所述合成的勝肽由氨基酸序列yhqvkph(seqidno:15)所組成(亦稱為“cschp-hp3”)。在一具體實(shí)施例中，cschp-hp3歸巢至、靶向至或特異性地結(jié)合至胰臟癌的cscs。本發(fā)明的合成的勝肽可透過常規(guī)方法(例如，化學(xué)合成)來制備或合成。根據(jù)本發(fā)明的部分具體實(shí)施例，所述合成的勝肽用于癌癥的診斷。根據(jù)本發(fā)明的一些其他具體實(shí)施例，所述合成的勝肽用于將治療劑靶向癌干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述合成的勝肽接合至(fusedto)一可偵測(cè)部分(detectablemoiety)。在本發(fā)明的部分具體實(shí)施例中，所述可偵測(cè)部分為一放射性標(biāo)記、一熒光團(tuán)或一磁性成像造影劑。根據(jù)本發(fā)明，所述的合成的勝肽可接合至一治療劑。在本發(fā)明的部分較佳具體實(shí)施例中，所述治療劑為一抗癌劑。所述抗癌劑包括但不限于一化療劑、一放射治療劑或一免疫治療劑。本文中所使用的術(shù)語“免疫治療劑(immunotherapeuticagent)”是指一藥劑，其能夠在治療上增進(jìn)或抑制以該藥劑處理的個(gè)體的免疫系統(tǒng)。上述的可偵測(cè)部分或治療劑可直接地或間接地結(jié)合至或接合至一本發(fā)明的合成的勝肽，例如，透過共價(jià)鍵或離子鍵結(jié)合。另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含所述的合成的勝肽以及一醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑。較佳地，所述的合成的勝肽結(jié)合至一治療劑。所述組合物可作為一醫(yī)藥組合物使用。所述組合物可透過混合所述合成的勝肽和一醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑來制備，或透過將一醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑化學(xué)地結(jié)合至所述合成的勝肽來制備。本發(fā)明的合成的勝肽或組合物可透過靜脈內(nèi)給藥來投藥給有需要的個(gè)體。又另一方面，本發(fā)明提供一種篩選特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽的方法，其包含：藉由使用一噬菌體表達(dá)系統(tǒng)來建立一寡勝肽庫；使該寡勝肽庫中的噬菌體與一癌細(xì)胞系的一般癌細(xì)胞的培養(yǎng)物接觸；使未與所述一般癌細(xì)胞結(jié)合的噬菌體與該癌細(xì)胞系的癌干細(xì)胞或癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancerstemcelllikecells)的培養(yǎng)物接觸；以及從與所述癌干細(xì)胞結(jié)合的噬菌體中篩選出特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽。根據(jù)本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例，所述癌干細(xì)胞或癌干細(xì)胞樣細(xì)胞源自或得自一瘤球(tumorosphere)(weiswaldetal.,neoplasia,17(1):1-15(2015))，該瘤球制備自一般的癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。所述瘤球可透過一無血清培養(yǎng)方法來制備。例如，eramoetal.,celldeathdifferentiation,15:504-514(2008)、cioceetal.,cellcycle,9:2878-2887(2010)；caoetal.,bmcgastroenterol.,11:71(2011)或chenetal.,clin.exp.metastasis,28(8):751-763(2011))中所公開的方法。在現(xiàn)有技術(shù)中，大部分的注意力放在靶向(一般)癌細(xì)胞的勝肽或其他實(shí)體，部分是因?yàn)橥高^細(xì)胞培養(yǎng)得到的癌干細(xì)胞的量很低。此外，就發(fā)明人所知，從未有人提出篩選不結(jié)合至一般癌細(xì)胞但結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽，這樣的篩選策略。然而，發(fā)明人非預(yù)期性地發(fā)現(xiàn)，透過上述的方法以及使用源自瘤球的癌干細(xì)胞或癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，能夠有效地篩選出特異性結(jié)合至癌干細(xì)胞的勝肽。透過以下的非限制性實(shí)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)例材料及方法1.癌細(xì)胞和癌干細(xì)胞的培養(yǎng)養(yǎng)雖然cscs可以透過諸如cd44和cd133的表面標(biāo)志來富集，能夠選擇性地增殖cscs的實(shí)用且簡(jiǎn)單的方法，對(duì)研究而言非常關(guān)鍵。在2008年發(fā)展出能夠選擇性地增殖人類肺cscs的開創(chuàng)性的無血清培養(yǎng)方法(eramoetal.,celldeathdifferentiation,15:504-514(2008))。自那時(shí)候起，乳癌(cioceetal.,cellcycle,9:2878-2887(2010))、肝癌(caoetal.,bmcgastroenterol.,11:71(2011))和結(jié)腸癌(chenetal.,clin.exp.metastasis,28(8):751-763(2011))的cscs亦被報(bào)導(dǎo)。cscs以球形的聚合形狀生長(zhǎng)，研究者將其命名為瘤球(weiswaldetal.,neoplasia,17(1):1-15(2015))。重組的生長(zhǎng)因子購自peprotech。小鼠的乳癌emt6細(xì)胞系、肝癌hepa1-6細(xì)胞系和人類胰腺導(dǎo)管腺瘤(pancreaticductaladenoma)細(xì)胞系于補(bǔ)充有10％fcs的dmem中維持。小鼠的結(jié)腸癌themousecoloncancerct26細(xì)胞系于補(bǔ)充有10％fcs的rpmi1640中培養(yǎng)。用于cscs的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有2mm谷氨酰胺的dmem/f12，emt6cscs的補(bǔ)充物為25ng/ml的rmegf、25ng/ml的rmfgf2、5μg/ml的胰島素、4μg/ml的肝素、0.5μg/ml的氫化可的松和1％的bsa；ct26的補(bǔ)充物為20ng/mlrmegf、5μg/ml的胰島素、2％的b27和0.4％bsa；hepa1-6cscs的補(bǔ)充物為20ng/ml的megf、10ng/ml的rmfgf2、2％的b27和1％的n2；panc-1cscs的補(bǔ)充物為2％的b27和20ng/ml的rhfgf2。為了制備瘤球，在無血清培養(yǎng)基中以低密度(例如，小于104細(xì)胞/ml)。培養(yǎng)7天后，以40μm細(xì)胞過濾器收獲瘤球，并于室溫以900×g離心5分鐘。透過胰蛋白酶將瘤球的團(tuán)粒分離為多個(gè)單一細(xì)胞，然后將所得到的細(xì)胞再次擴(kuò)增為瘤球，為期7天。每隔一天補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，分離自第三至五輪擴(kuò)增的瘤球用于實(shí)驗(yàn)。2.m13噬菌體展示含有109獨(dú)立克隆的m13phd-7庫(neb,e8100)購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(newenglandbiolabsinc)。在t75燒瓶中，10mldmem中的1013斑塊固結(jié)單位(pfus)的m13phd-7噬菌體以癌細(xì)胞預(yù)吸附2次，每次1小時(shí)。接著，將上清液移至含有5×106cscs的t25燒瓶中，培養(yǎng)1小時(shí)。透過在dmem/0/2％bsa中離心和懸浮3次，以去除未結(jié)合或弱聯(lián)結(jié)的噬菌體。將細(xì)胞團(tuán)粒懸浮于含有109e.colier2738的1mlpbs中，并在振蕩器中培養(yǎng)1小時(shí)。之后加入10mllb/5mmmgcl2。于37℃過夜培養(yǎng)后，透過離心去除細(xì)胞，并滴定上清液中的噬菌體。針對(duì)emt6和panc-1，進(jìn)行上述的篩選程序三輪，來分別獲得第一級(jí)emt6cschp庫和panc-1cschp庫。然后，挑出m13斑塊以制備用于定序的dna。所述級(jí)emt6cschp庫和panc-1cschp庫進(jìn)一步以ct26cscs、hepa1-6cscs和小鼠胚胎干細(xì)胞(mesc)篩選，來制備第二級(jí)ct26cschp庫、hepa1-6cschp庫和csc/eshp庫。收集mesc吸附后未結(jié)合的部分，命名為cscph庫。參見圖4a和圖4b。3.cschps對(duì)cscs的結(jié)合20μg/ml的以羅丹明b標(biāo)記的cschp1(rd-cschp-1)和cschp2(rd-cschp-2)，以及以fitc標(biāo)記的cschp11(fitc-cschp-11)被直接用來對(duì)emt6cscs和癌細(xì)胞(ccs)染色。細(xì)胞以dapi復(fù)染。4.聚糖微數(shù)組分析具有下表a中所列序列的n端結(jié)合有生物素的cschps通過genedirex以高于95％的純度合成。將生物素-cschp溶解于dmso中以制備10mg/ml儲(chǔ)備液。表a.以生物素標(biāo)記的cschps聚糖陣列芯片100(cat.#ga-glycan-100)購自raybiotech，并依制造商的指示處理(稍加修飾)。簡(jiǎn)言之，在室溫下用400μl樣品稀釋液(iteme)阻斷30分鐘后，將結(jié)合有生物素的cschps用樣品稀釋劑稀釋至1μg/400μl，并在室溫下進(jìn)行雜交反應(yīng)2小時(shí)。洗滌后，向每個(gè)孔中加入400μl的1×cy3-共軛的鏈霉親和素。培養(yǎng)室用塑料粘合條覆蓋并且用鋁箔覆蓋載玻片以避免在暗室中培養(yǎng)期間受光照。將載玻片與cy3-共軛的鏈霉親和素在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)，伴隨溫和晃動(dòng)或搖動(dòng)。徹底洗滌后，將載玻片完全排干，并用激光掃描儀axongenepix讀取其上的熒光信號(hào)。將聚糖x的相對(duì)強(qiáng)度定義為(x–陰性對(duì)照的平均值)/(陽性對(duì)照–陰性對(duì)照)×100％。5.免疫熒光(if)分析初級(jí)抗體兔多克隆抗cd44(gtx102111)、抗e-鈣粘著蛋白(gtx61823)和抗cdsn(gtx110093)以及小鼠單克隆抗ssea-1(igm，gtx48038)、抗ssea-5(igg，gtx70019)和抗lewisy(igm，gtx75903)購自genetex；小鼠單克隆抗ssea-4(igg，90230)、抗tra-1-60和tra-1-81(igm，在90232中)來自millipore；小鼠單克隆抗gbh(igm，alx-804-550)來自enzo。第二抗體dylight594-共軛的山羊抗兔igg(111-515-144)和dylight488-共軛的驢抗小鼠igg(715-485-151)獲自jacksonlab。dylight594-共軛的山羊抗小鼠igm(gtx76754)獲自genetex。用4％多聚甲醛/pbs固定癌細(xì)胞和瘤球，并用0.5％np-40/1％bsa/pbs(pbsnb)透化(permeabilized)。然后將細(xì)胞與在pbsnb中稀釋50-100倍的一抗培養(yǎng)2小時(shí)。用0.05％np-40/pbs(pbsn)洗滌4次后，將細(xì)胞與二抗(在pbsnb中1/200稀釋)一起培養(yǎng)2小時(shí)。以pbsn洗滌4次和用水短暫洗滌1次后，用dapi固定細(xì)胞。實(shí)例1：小鼠emt6、ct26和hepa1-6cscs的鑒定挑選由m13噬菌體展示的勝肽是否專一于癌干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)取決于cscs和癌細(xì)胞(cc)之間的表面特征的差異。通過檢查特異性干細(xì)胞表面標(biāo)記來鑒定制備為腫瘤球形式中的小鼠emt6、ct26和hepa1-6cscs(數(shù)據(jù)未顯示)。干細(xì)胞表面標(biāo)記tra-1-60高度表達(dá)在所有三株cscs，但其在對(duì)應(yīng)的cc的表達(dá)是低的或檢測(cè)不到的，而組成型表達(dá)的(constitutivelyexpressed)表面蛋白角質(zhì)軟蛋白(cdsn)在cscs和ccs都有檢測(cè)到(數(shù)據(jù)未顯示)。除了顯示在emt6cscs上弱表達(dá)的ssea-4之外，所有的人類csc通用標(biāo)記物：cd44和e-鈣粘蛋白，以及多能干細(xì)胞標(biāo)記物ssea-1、ssea-5、tra-1-60和tra-1-81，都證實(shí)在所有三株小鼠csc上有強(qiáng)的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)例2：第一級(jí)emt6cschp庫為了研究csc特異性歸巢勝肽(hp)，m13phd7七勝肽庫以emt6ccs預(yù)吸附以除去一般的癌癥hp，然后將游離的噬菌體轉(zhuǎn)移到emt6csc用于正選擇。獲取聯(lián)結(jié)在emt6csc上的噬菌體并以大腸桿菌er2738擴(kuò)增。上述篩選程序進(jìn)行三輪，以制備富集的初級(jí)emt6cschp庫。隨機(jī)挑取獨(dú)立的噬菌斑，讀取31個(gè)有效序列并整理于下表1中。表1:在第一級(jí)和第二級(jí)cschp庫中檢測(cè)到cschp序列的次數(shù)勝肽sqptwmf(稱為cschp-1)(seqidno：1)、gmmsspp(稱為cschp-2)(seqidno：2)、fsgggnh(稱為cschp-3)(seqidno：3)、fpftknl(稱為cschp-4)(seqidno：4)和atygnlw(稱為cschp-5)(seqidno：5)分別出現(xiàn)10、6、5、3和2次。勝肽yhmpalm(稱為cschp-6)(seqidno：6)、hggvrly(稱為cschp-7)(seqidno：7)、eltpltl(稱為cschp-8)(seqidno：8)、gpsasrn(稱為cschp-10)(seqidno：9)和glapfna(稱為cschp-11)(seqidno：10)各出現(xiàn)一次。由于m13phd7庫估計(jì)含有109個(gè)獨(dú)立克隆，因此可以得出結(jié)論，篩選方法是高度有效的。實(shí)例3：第二級(jí)ct26cschp庫、hepa1-6cschp庫、csc/eschp庫和cschp庫通過ct26或hepa1-6csc對(duì)第一級(jí)cschp文庫直接篩選擇一次，以測(cè)試cschp對(duì)不同種類癌癥的親和力的偏差。如表1所示，cschp-8和cschp-3分別更特異于ct26和hepa1-6csc。cschp親和力在csc和胚胎干細(xì)胞(esc)之間的偏差是另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)。cschp-1在esc結(jié)合級(jí)分(csc/esc-hp庫)中被進(jìn)一步富集。在esc未結(jié)合級(jí)分(cschp-文庫)中讀取到兩個(gè)新的勝肽序列kiyttld(cschp-9)(seqidno：11)和nlqppay(cschp-12)(seqidno：12)(見表1)。實(shí)例4：cschp和cscs之間的相互作用根據(jù)如上述的結(jié)果，選擇cschp-1、cschp-2、cschp-3、cschp-8、cschp-9、cschp-10和cschp-11與羅丹明b或熒光素共軛(綴合)。所有這些肽都與emt6、ct26和hepa1-6cscs有特異性的關(guān)聯(lián)(結(jié)合)。它們?cè)谄叫衏c實(shí)驗(yàn)中未被檢測(cè)到(圖1a和圖1b)。想要確定的是，這些源自小鼠癌癥的cschp是否可識(shí)別人類csc。發(fā)現(xiàn)從人胰腺癌細(xì)胞系panc-1制備的瘤球確實(shí)會(huì)與上述七個(gè)勝肽關(guān)聯(lián)(結(jié)合)(圖1b)。實(shí)例5：第一級(jí)panc-1cschp庫如果由小鼠csc篩選的cschp可以與人類csc交叉反應(yīng)，人類csc篩選的cschp是否與小鼠csc相關(guān)聯(lián)？按照用于emt6cschp篩選的類似方法，以人胰腺panc-1cc進(jìn)行三輪陰性選擇和用panc-1csc陽性選擇后，建立初級(jí)panc-1cschp庫。隨機(jī)挑取獨(dú)立斑塊，讀取20個(gè)有效序列。勝肽gpkvtiw(稱為cschp-hp1)，gspvmsw(稱為cschp-hp2)和yhqvkph(稱為cschp-hp3)分別出現(xiàn)17、2和1次。參見下表2。表2.在第一級(jí)panc-1cschp庫中檢測(cè)到cschp序列的次數(shù)cschp-hp系列的氨基酸序列與小鼠cschp的氨基酸序列不匹配。除了化學(xué)合成的fitc-cschp-hp1(其可以選擇性地與人和小鼠csc結(jié)合)(數(shù)據(jù)未顯示)之外，制備cschp-hp1-dsred重組蛋白以測(cè)試cschp-hp1和panc-1cscs之間的相互作用是否受到接合至cschp-hp1勝肽c端的大分子載體的影響。證實(shí)cschp-hp1-dsred重組蛋白能夠選擇性地結(jié)合至panc-1cscs，而cc內(nèi)的一些細(xì)胞也被重組蛋白染色，如圖2中的箭頭所示。實(shí)例6：cschp的靶標(biāo)開發(fā)出的cschp可以區(qū)分csc和cc，并且發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象在人和小鼠之間是跨種的。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來找出這些cschp的靶標(biāo)。沒有殘留在硝酸纖維素膜上的fitc-cschp的可檢測(cè)的熒光信號(hào)，所述硝酸纖維素膜已經(jīng)通過sdspage分離的csc膜蛋白印跡(數(shù)據(jù)未顯示)。使用其上點(diǎn)樣4次100種寡糖的聚糖微陣列(聚糖陣列100微芯片)來分析寡糖和cschp之間的相互作用的可能性。表2中列出的生物素-cschp與芯片上的聚糖雜交。用cy3-共軛的鏈霉親和素探測(cè)在芯片上捕獲的生物素-cschp，并通過激光掃描儀讀取其上的熒光信號(hào)。圖3a-3f中顯示兩個(gè)主要的模式。第一個(gè)包括globo系列的聚糖16(gal-β-1,4-glc-β-)、18(gal-α-1,4-gal-β-1,4-glc-β-)和26(galnac-β-1,3-gal-α-1,4-gal-β-1,4-glc-β-)圖3a)。典型的例子是cschp-1和chchp-hp1(圖3c)。除了globo系列的信號(hào)，第二個(gè)主要的模式涉及聚糖19(glcnac-β-1,3-gal-β-1,4-glc-β-,其為lacto/isolacto三糖骨架)，其類似于信號(hào)26的水平(圖3b)。典型的例子是cschp5、cschp6、cschp7和cschp9(圖3c)。還偵測(cè)到兩個(gè)與腫瘤惡性和轉(zhuǎn)移有關(guān)的聚糖標(biāo)記：聚糖63(fuc-α-1,2-gal-β-1,4-(fuc-α-1,3)-glcnac-β-,亦稱為lewisy表位)和聚糖69(neu5ac-α-2,6-gal-β-1,3-(neu5ac-α-2,6)-galnac-β-)。cschp-1和cschp-hp1在聚糖63上展現(xiàn)較高的信號(hào)，而cschp-9、cschp-10、cschp-11、cschp-hp2和cschp-hp3在聚糖69上展現(xiàn)較高的信號(hào)(圖3d)。兩個(gè)neu5ac-α-2,6-殘基都是cschp結(jié)合所必需的(圖3e)。根據(jù)上述結(jié)果，制備人胰腺癌細(xì)胞panc-1的cscs，并且通過if測(cè)定證實(shí)了在panc-1csc上有g(shù)lobo系列的ssea-4和gbh、lacto/isolacto系列的ssea-1和ssea-5以及l(fā)ewisy等csc聚糖標(biāo)記(圖3f)。根據(jù)聚糖微陣列數(shù)據(jù)，cschp-1和cschp-hp1強(qiáng)且特異性地結(jié)合至聚糖26，其為四糖的globo根結(jié)構(gòu)。另一方面，cschp5、cschp6、cschp7和cschp9與聚糖19強(qiáng)烈結(jié)合，聚糖19是lacto和neolacto根結(jié)構(gòu)四糖的核心三糖。發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為分別對(duì)肝和結(jié)腸csc具有特異性的cschp-3和cschp-8與聚糖26弱結(jié)合。cschp-1和cschp-hp1與聚糖63(lewisy表位)有較強(qiáng)的結(jié)合。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：中具有通常知識(shí)者，基于本文所描述，在不需要進(jìn)一步說明之下能夠運(yùn)用本發(fā)明至最廣的程度。因此，應(yīng)了解所提供的說明與權(quán)利要求范圍僅為例示的目的，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。序列表<110>財(cái)團(tuán)法人農(nóng)業(yè)科技研究院<120>靶向癌干細(xì)胞的勝肽和其應(yīng)用<130>960183cg<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>1serglnprothrtrpmetphe15<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>2glymetmetserserpropro15<210>3<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>3pheserglyglyglyasnhis15<210>4<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>4pheprophethrlysasnleu15<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>5alathrtyrglyasnleutrp15<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>6tyrhismetproalaleumet15<210>7<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>7hisglyglyvalargleutyr15<210>8<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>8gluleuthrproleuthrleu15<210>9<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>9glyproseralaserargasn15<210>10<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>10glyleualapropheasnala15<210>11<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>11lysiletyrthrthrleuasp15<210>12<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>12asnleuglnproproalatyr15<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>13glyprolysvalthriletrp15<210>14<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>14glyserprovalmetsertrp15<210>15<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>靶向癌干細(xì)胞的勝肽<400>15tyrhisglnvallysprohis15當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12