口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146s含量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S含量的測定方法，該方法是利用經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心技術(shù)，將被檢抗原直接加至蔗糖梯度頂部超速離心，再利用連續(xù)紫外檢測器連續(xù)檢測，根據(jù)抗原峰面積計算146S含量，從而達(dá)到快速、穩(wěn)定檢測口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S的含量的目的。本發(fā)明過程簡單，操作性強(qiáng)，周期短，且所需樣品量少，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。為下一步研究疫苗中抗原含量與免疫后動物所獲得的保護(hù)力之間的關(guān)系研究提供了保障，同時解決了疫苗生產(chǎn)中間品檢測和成品口蹄疫疫苗體外檢測方法的技術(shù)瓶頸。
【專利說明】口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S含量的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為口蹄疫滅活疫苗中間或抗原品146S含量的測定方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Food and MouthDisease Virus,FMDV)引起的偶蹄類動物的急性、熱性、接觸性、烈性傳染病。由于該病的發(fā)生會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和政治影響，因此，口蹄疫防治工作始終得到世界各國政府的高度重視。疫苗接種是我國預(yù)防控制口蹄疫的重要戰(zhàn)略，農(nóng)業(yè)部要求強(qiáng)制免疫接種，免疫密度常年維持在90 %以上，其中應(yīng)免畜禽免疫密度要達(dá)到100 %，各口蹄疫生產(chǎn)廠家檢驗用陰性動物(牛、豬)基本無處可選，企業(yè)面臨無檢驗動物可用的局面，因為口蹄疫滅活疫苗效力評價方法是采用OIE標(biāo)準(zhǔn)的本動物(牛、豬)半數(shù)保護(hù)量(PD50)檢測方法，即用健康易感牛或豬(乳鼠中和抗體滴度≤1:4或細(xì)胞中和抗體滴度≤1:8或ELISA抗體效價≤1:16)30頭，將待檢疫苗按3組(I頭份、1/3頭份、1/9頭份)各接種10頭牛。21~28日后連同對照牛非別攻擊O型、亞洲I型口蹄疫病毒強(qiáng)毒104ID50，根據(jù)免疫牛保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的TO50。而初步估計國內(nèi)6個口蹄疫定點生產(chǎn)廠每年口蹄疫陰性牛使用量最少應(yīng)該在10000頭左右，豬至少在20000頭，要想保證這個數(shù)量非常困難。所以口蹄疫滅活疫苗效力評價篩選檢驗用陰性動物非常困難，同時各企業(yè)動物來源、動物品系均不同，動物來源復(fù)雜、背景不清，不易標(biāo)準(zhǔn)化等問題嚴(yán)重困擾著我國口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)。同時這種方法需要大面積負(fù)壓強(qiáng)毒動物舍，感染動物體外排毒造成活病毒逃逸是一直困擾專家的難題。
[0003]為了解決口蹄疫疫苗檢驗用本動物來源困難這一現(xiàn)實問題，2005年，對牛的口蹄疫疫苗農(nóng)業(yè)部提出并批準(zhǔn)生產(chǎn)企業(yè)每連續(xù)生產(chǎn)五批疫苗選擇進(jìn)行一批效力評價的策略，雖然稍稍緩解動物來源的困難，但是又為市場疫苗質(zhì)量、口蹄疫的發(fā)生埋下了隱患，因為未進(jìn)行效力評價的疫苗進(jìn)入市場后效力一旦存在問題，就會出現(xiàn)不可估量的損失。所以2006年農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局責(zé)成各生產(chǎn)企業(yè)及研究單位要盡快尋找替代本動物進(jìn)行效力評價的方法?？梢娊⒁环N新型、有效、穩(wěn)定、科學(xué)評價口蹄疫滅活疫苗效價體系迫在眉睫。
[0004]國際上主要采用密度梯度離心法檢測有效抗原含量，我國采取本動物效力實驗檢測終端產(chǎn)品的方法對疫苗質(zhì)量進(jìn)行控制，但此方法存在成本較高和因動物個體差異導(dǎo)致的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確等問題，且不能用于疫苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)的中間品檢驗，因此建立快速有效的口蹄疫滅活疫苗抗原檢測和定量方法極為重要。國際上采用的密度梯度離心法檢測有效抗原含量的方法樣品必須濃縮，過程比較復(fù)雜，最終導(dǎo)致的結(jié)果是檢測結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性差，而且周期長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是利用經(jīng)典的蔗糖密度梯度離心技術(shù)，將被檢抗原直接加至蔗糖梯度頂部超速離心，再利用連續(xù)紫外檢測器連續(xù)檢測，根據(jù)抗原峰面積計算146S含量，從而達(dá)到快速、穩(wěn)定檢測口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S的含量，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S含量的測定方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理，步驟如下:
1)在無菌條件下將中間品或抗原樣品分裝于已滅菌管；
2)將分裝后的中間品平衡后置于高速臺式離心機(jī)內(nèi)，在4°C條件下離心5min;
3)吸取上清液即為試驗用樣品；
(2)將實驗用樣品直接用于蔗糖密度梯度離心，步驟如下:
1)蔗糖密度梯度制備:使用自動梯度制備儀制備梯度，現(xiàn)制現(xiàn)用；
2)打開離心機(jī)進(jìn)行自檢測試，確保離心機(jī)可以正常運轉(zhuǎn)；
3)測試完成后，打開艙門，將樣品加入蔗糖梯度上層，用配制好的TNE緩沖液兩兩平衡，放入離心管內(nèi)，擰緊離心管蓋子，再將相應(yīng)數(shù)字的離心管掛到水平離心管架上，放入離心機(jī)內(nèi)，并記錄樣品號與相對應(yīng)的離心管號后蓋上離心蓋，關(guān)閉艙門；
4)開始離心 離心參數(shù)如下:
轉(zhuǎn)速為 35000rpm/min 溫度為10 °C 時間為3h
5)離心結(jié)束后，取出離心管，擰開離心管蓋子，取出蔗糖梯度，棄掉1.5mL上層液體，將尚心后的樣品放直4 C待檢；
(3)通過使用連續(xù)紫外檢測儀器，對離心后的樣品進(jìn)行連續(xù)檢測:在259nm波長下測定紫外吸光度，并根據(jù)紫外吸光度記錄并保存檢測曲線；
(4)根據(jù)檢測出的曲線，對146S抗原峰手動積分，結(jié)合IPg口蹄疫146S抗原的峰面積(321.4mAU.s)，計算樣品146S抗原含量，從而得到所需數(shù)據(jù)。
[0007]綜上所述，本發(fā)明與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢:
1、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，同一樣品檢測結(jié)果偏差基本在5%以內(nèi)；而傳統(tǒng)方法同一樣品檢測結(jié)果偏差較大，基本在20%左右，有時達(dá)到100% ；
2、過程簡單，操作性強(qiáng)，樣品不經(jīng)任何處理即可上樣檢測，檢測結(jié)果更接近真實值，而傳統(tǒng)方法必須經(jīng)過濃縮步驟(沉淀、懸浮等過程)，抗原損失多，檢測結(jié)果不能反映真實值；
3、所需樣品量少,僅需1.5mL便可檢測，而傳統(tǒng)方法至少需10 mL ；
4、周期短，僅需3-5個小時便能完成，而傳統(tǒng)方法需過夜分散，兩天才能完成整個檢測過程。
[0008]本發(fā)明為下一步研究疫苗中抗原含量與免疫后動物所獲得的保護(hù)力之間的關(guān)系研究提供了保障，同時解決了疫苗生產(chǎn)中間品檢測和成品口蹄疫疫苗體外檢測方法的技術(shù)瓶頸。
【具體實施方式】[0009]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0010]實施例1
口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S含量的測定方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理，步驟如下:
1)在無菌條件下將中間品或抗原樣品分裝于已滅菌的2mLEppendorf管；
2)將分裝后的中間品平衡后置于高速臺式離心機(jī)內(nèi)，在4°C條件下離心5min;
3)輕輕吸取1.5mL上清液即為試驗用樣品；
(2)將實驗用樣品直接用于蔗糖密度梯度離心，步驟如下:
1)蔗糖密度梯度制備:使用自動梯度制備儀制備梯度，現(xiàn)制現(xiàn)用；
2)打開離心機(jī)進(jìn)行自檢測試，確保離心機(jī)可以正常運轉(zhuǎn)；
3)測試完成后，打開艙門，將1.5mL樣品加入蔗糖梯度上層，用配制好的TNE緩沖液兩兩平衡，放入離心管內(nèi)，擰緊離心管蓋子，再將相應(yīng)數(shù)字的離心管掛到水平離心管架上，放入離心機(jī)內(nèi)，并記錄樣品號與相對應(yīng)的離心管號后蓋上離心蓋，關(guān)閉艙門；
4)開始離心
離心參數(shù)如下:
轉(zhuǎn)速為 35000rpm/min
溫度為10 °C
時間為3h
5)離心結(jié)束后，取出離心管，擰開離心管蓋子，取出蔗糖梯度，棄掉1.5mL上層液體，將尚心后的樣品放直4 C待檢；
(3)通過使用連續(xù)紫外檢測儀器，對離心后的樣品進(jìn)行連續(xù)檢測，步驟如下；
1)將連續(xù)紫外檢測儀器與電腦聯(lián)機(jī)，打開電腦主機(jī)各模塊電源(從上至下)，待各模塊完成自檢后，再雙擊桌面“儀器I聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，進(jìn)入化學(xué)工作站，從“視圖”菜單中選擇“方法和運行控制”畫面；
2)把各流動相放入溶劑瓶中；
3)旋開排氣閥(逆時針)，點擊“方法”選項進(jìn)入泵編輯畫面。將泵流量設(shè)到5mL/min，打開泵，排出管線中的氣體2 — 3min，直到管線內(nèi)由溶劑瓶到泵入口無氣泡為止，查看柱前壓力(若大于lbar，則應(yīng)更換排氣閥內(nèi)過濾白頭)；
4)設(shè)定泵的流速為2mL/min，關(guān)閉排氣閥(順時針)，沖洗系統(tǒng)30—60min；
5)將水換成蔗糖溶液，流速設(shè)為lmL/min，當(dāng)柱前壓力穩(wěn)定后，打開檢測器氘燈，待基線平衡后，換待檢的密度梯度離心后的樣品，在259nm波長下測定紫外吸光度，電腦自動記錄檢測曲線，檢測結(jié)束時，按中斷鍵，檢測曲線即保存；
6)檢測下一樣品時，先將流速設(shè)為0，移豎直金屬桿至45%蔗糖溶液，然后流速設(shè)為lmL/min重新平衡。待基線平衡后流速設(shè)為0，將豎直金屬桿移至樣品接著檢測
7)雙擊桌面“儀器I脫機(jī)”圖標(biāo)，進(jìn)入化學(xué)工作站；
8)從“文件”菜單選擇“調(diào)用信號”選中您的數(shù)據(jù)文件名，單擊“確定”； 9)積分:從“積分”中選擇“自動積分”，積分結(jié)果不理想，再從菜單中選“積分選項”，選擇合適的“斜率靈敏度，峰寬，最小峰面積，最小峰高”，從“積分”菜單中選擇“積分”則數(shù)據(jù)自動被積分，如果積分不理想則用手動積分；
10)打開排氣閥，泵流量5mL/min，用水沖洗柱子和系統(tǒng)7-15min ;然后關(guān)閉排氣閥，將泵流速設(shè)為2mL/min用水沖洗系統(tǒng)0.5_lh,再用已過濾的色譜甲醇沖洗IOmin,然后關(guān)泵，退出化學(xué)工作站和其它窗口 ；
(4)根據(jù)檢測出的曲線，對146S抗原峰手動積分，結(jié)合IPg 口蹄疫146S抗原的峰面積(321.4mAU.s)，計算樣品146S抗原含量，從而得到所需數(shù)據(jù)。
[0011]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0012]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。
【權(quán)利要求】
1.口蹄疫滅活疫苗中間品或抗原146S含量的測定方法，其特征是，包括以下步驟: (1)樣品前處理，步驟如下: 1)在無菌條件下將中間品或抗原樣品分裝于滅菌管； 2)將分裝后的中間品平衡后置于高速臺式離心機(jī)內(nèi)，在4°C條件下離心5min; 3)吸取上清液即為試驗用樣品； (2)將實驗用樣品直接用于蔗糖密度梯度離心，步驟如下: 1)使用自動梯度制備儀制備梯度； 2)打開離心機(jī)進(jìn)行自檢測試，確保離心機(jī)可以正常運轉(zhuǎn)； 3)測試完成后，打開艙門，將樣品加入蔗糖梯度上層，用配制好的TNE緩沖液兩兩平衡，放入離心管內(nèi)，擰緊離心管蓋子，再將相應(yīng)數(shù)字的離心管掛到水平離心管架上，放入離心機(jī)內(nèi)，并記錄樣品號與相對應(yīng)的離心管號后蓋上離心蓋，關(guān)閉艙門； 4)開始離心 離心參數(shù)如下: 轉(zhuǎn)速為 35000rpm/min 溫度為10 °C 時間為3h 5)離心結(jié)束后，取出離心管，擰開離心管蓋子，取出蔗糖梯度，棄掉上層液體，將離心后的樣品放直4 C待檢； (3)通過使用連續(xù)紫外檢測儀器，對離心后的樣品進(jìn)行連續(xù)檢測:在259nm波長下測定紫外吸光度，并根據(jù)紫外吸光度記錄并保存檢測曲線； (4)根據(jù)檢測出的曲線，對146S抗原峰手動積分，結(jié)合IPg口蹄疫146S抗原的峰面積(321.4mAU.s)，計算樣品146S抗原含量，從而得到所需數(shù)據(jù)。
【文檔編號】G01N21/33GK103698290SQ201310717661
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】董金杰, 王凡, 智曉瑩, 常艷燕, 喬莉萍, 劉學(xué)榮, 牟克斌, 王超英, 黃銀君, 張云德, 殷宏 申請人:中農(nóng)威特生物科技股份有限公司