本發(fā)明涉及生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是一種沉默t細(xì)胞抗原受體的t淋巴細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)：

t淋巴細(xì)胞是在胸腺中分化成熟的淋巴細(xì)胞，故稱(chēng)胸腺依賴(lài)性淋巴細(xì)胞(thymus-dependentlymphocyte)，簡(jiǎn)稱(chēng)t細(xì)胞。t細(xì)胞是由胸腺內(nèi)的淋巴干細(xì)胞分化而成，是淋巴細(xì)胞中數(shù)量最多，功能最復(fù)雜的一類(lèi)細(xì)胞。t細(xì)胞膜表面分子與t細(xì)胞的功能相關(guān)，也是t細(xì)胞的表面標(biāo)志，可以用以分離、鑒定不同亞群的t細(xì)胞。tcr為所有t細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，以非共價(jià)鍵與cd3結(jié)合，形成tcr-cd3復(fù)合物。tcr的作用是識(shí)別抗原。tcr是由兩條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，由α、β兩條肽鏈組成，每條肽鏈又可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其特點(diǎn)是胞質(zhì)區(qū)很短。tcr分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于胞外區(qū)。

rna干擾(rnainterference,rnai)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)誘發(fā)的、同源mrna高效特異性降解的現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mrna編碼區(qū)同源的雙鏈rna時(shí)，該mrna發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)。由于rnai具有高度的序列專(zhuān)一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達(dá)量的降低，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。rnai技術(shù)可廣泛應(yīng)用到包括功能學(xué)，藥物靶點(diǎn)篩選，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路分析，疾病治療等等。

機(jī)體對(duì)內(nèi)外的各種致病因子有著非常完善的防御機(jī)制，其中對(duì)外來(lái)物如細(xì)菌、病毒、異物等“異己成分”的重要作用，就是攻擊、破壞、清除。這主要是由于t細(xì)胞抗原受體的識(shí)別作用。每個(gè)機(jī)體內(nèi)的t細(xì)胞抗原受體都是特異的，遇到來(lái)源于異體的t細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)。而在細(xì)胞免疫治療技術(shù)的應(yīng)用中，當(dāng)病人因身體虛弱，導(dǎo)致自體外周血中t細(xì)胞數(shù)量比較少，很難在體外誘導(dǎo)成cik細(xì)胞，因此，應(yīng)用異體t細(xì)胞對(duì)病人免疫治療具有潛在優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)以上不足，本發(fā)明提供了一種沉默t細(xì)胞抗原受體的t淋巴細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明為一個(gè)雙靶點(diǎn)的rna干擾技術(shù)，表達(dá)所述雙靶點(diǎn)rnai的t淋巴細(xì)胞，以及所述t淋巴細(xì)胞用于異體回輸降低排斥反應(yīng)的用途。

本發(fā)明的方案是：

一種沉默t細(xì)胞抗原受體的t細(xì)胞制備方法，在tcr的α鏈和β鏈基因中分別選取連續(xù)的21個(gè)核苷酸，并與相應(yīng)的啟動(dòng)子序列依次連接起來(lái)，得到轉(zhuǎn)錄形成tcr-rnai的融合基因片段，將所構(gòu)建的融合基因片段插入慢病毒表達(dá)載體，包裝成攜帶tcr-rnai融合基因的慢病毒，將所述攜帶tcr-rnai融合基因的慢病毒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)t淋巴細(xì)胞，得到沉默t細(xì)胞抗原受體的t淋巴細(xì)胞。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的轉(zhuǎn)錄tcr-rnai的融合基因片段為序列表seq.id.no.1所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)t淋巴細(xì)胞如下制備：取臍帶血，分離單核細(xì)胞，用含有重組干擾素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入重組白細(xì)胞介素、okt-3和5％的患者自體血漿誘導(dǎo)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；每隔三天倍比加液，培養(yǎng)至第17天，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cik細(xì)胞的分子標(biāo)記tcr+的陽(yáng)性表達(dá)率；當(dāng)tcr+陽(yáng)性率>90％，收獲由單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)t淋巴細(xì)胞。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，將所述攜帶tcr-rnai融合基因的慢病毒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)t淋巴細(xì)胞如下制備：所述攜帶tcr-rnai融合基因的慢病毒轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞后，所述293t細(xì)胞釋放慢病毒顆粒，所述慢病毒顆粒感染單核細(xì)胞誘導(dǎo)的異質(zhì)t淋巴細(xì)胞。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述轉(zhuǎn)錄tcr-rnai融合基因片段如下制?。和ㄟ^(guò)基因合成技術(shù)將選取的tcr中的α鏈和β鏈的21個(gè)核苷酸，h1啟動(dòng)子，u6啟動(dòng)子與酶切位點(diǎn)的核苷酸序列構(gòu)成融合基因tcr-rnai。

本發(fā)明還提供了一種治療腫瘤可以異體回輸?shù)乃幬铮袡?quán)利要求1所述的沉默t細(xì)胞抗原受體的t細(xì)胞。

本發(fā)明設(shè)計(jì)的沉默t細(xì)胞抗原受體的t細(xì)胞，能夠大大降低機(jī)體的排斥反應(yīng)，達(dá)到異體回輸?shù)哪康?，提高沉默效果?/p>

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

由于雙靶點(diǎn)rnai的基因沉默效率要比單靶點(diǎn)rnai高，本發(fā)明利用雙靶點(diǎn)rnai來(lái)沉默tcr基因，通過(guò)磁珠篩選，去除未沉默tcr的t細(xì)胞。在異體回輸時(shí)，不減弱t細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力同時(shí)避免引起嚴(yán)重的排斥反應(yīng)。

本發(fā)明中沉默t細(xì)胞抗原受體的t淋巴細(xì)胞的各模塊

(1)tcr-rnai基因

本發(fā)明中提供了一個(gè)雙靶點(diǎn)rnai載體構(gòu)建方法，雙靶點(diǎn)rnai可以提高基因沉默的效率。rnai基因中使用的是h1啟動(dòng)子和u6啟動(dòng)子，分別連在兩條不同的鏈上，并與酶切位點(diǎn)相連，設(shè)計(jì)圖見(jiàn)圖1。

(2)重組病毒表達(dá)載體

本發(fā)明中使用的載體是慢病毒載體plent-c-gfp，plent-n-gfp表達(dá)基因載體含有一個(gè)原始復(fù)制子(originofreplication)，一個(gè)巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子序列(cmv)，和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(noti，asisi等)，選擇性的抗性基因(抗氨芐青霉素)及標(biāo)簽蛋白(綠色熒光蛋白)。通過(guò)人工合成的tcr-rnai基因，即目標(biāo)dna，在t4連接酶作用下，與載體dna連接，形成轉(zhuǎn)錄rnai的完整載體plent-tcr-rnai見(jiàn)圖2。

(3)宿主細(xì)胞

本發(fā)明所用的宿主細(xì)胞為一種異質(zhì)t淋巴細(xì)胞—cik(多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，cytokine-inducedkiller)。cik是將臍血單核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子(如抗cd3單克隆抗體、il-2和ifn-γ等)共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群細(xì)胞。cik細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞在正常人外周血中極少，僅1％～5％。相對(duì)與普通的t淋巴細(xì)胞，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)細(xì)胞增殖速度快；(2)cik具有識(shí)別腫瘤的機(jī)制，對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)毒性作用；(3)殺瘤譜廣，可用于白血病、肝癌、腎癌、胃癌、直腸癌等多種腫瘤的治療；(4)典型的生物治療模式，通過(guò)沉默t細(xì)胞受體基因工程方法改良cik細(xì)胞，可對(duì)腫瘤進(jìn)行異體殺傷，開(kāi)啟普遍性。

本發(fā)明中沉默掉t細(xì)胞受體的t細(xì)胞，可以是自體的t細(xì)胞，也可以是異體的t細(xì)胞。所用t細(xì)胞的數(shù)量為0.5×10⁶～1×10⁹/kg。通常所用的t細(xì)胞的劑量為0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

附圖說(shuō)明

圖1為雙靶點(diǎn)rnai的基因片段的設(shè)計(jì)圖；

圖2為本發(fā)明所述的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(plent-tcr-rnai)的示意圖，其中，順時(shí)針序列為正向基因片段，逆時(shí)針為反向基因片段；

圖3是本發(fā)明臍血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的cik倒置顯微鏡下視野圖；

圖4是本發(fā)明臍血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的cik的表面分子標(biāo)記tcr+表達(dá)的流式圖(tcr表達(dá)率為97.9％)；

圖5是本發(fā)明所述的293t細(xì)胞明視野圖；

圖6是顯微鏡下觀察慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(plent-tcr-rnai)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖；

圖7是本發(fā)明所述病毒感染t細(xì)胞倒置顯微鏡下視野圖；

圖8是流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng)過(guò)磁珠分離后的t細(xì)胞的tcr+的效率為4.5％。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：將基因片段tcr-rnai插入慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp

(1)tcr-rnai人工序列(seqidno.1)

將tcr-rnai的核酸人工序列，委托維真生物(山東)科技有限公司合成，插入plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點(diǎn)(見(jiàn)圖2)，轉(zhuǎn)化到e.coli(dh5α)，經(jīng)測(cè)序正確后，使用qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，獲得各重組表達(dá)載體的高品質(zhì)質(zhì)粒。

實(shí)施例2：plent-tcr-rnai沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞的制備

(一)異質(zhì)t淋巴細(xì)胞—cik的制備

取60ml臍帶血，用tbd樣本密度分離液(購(gòu)自天津?yàn)笕A科生物)，分離出單核細(xì)胞。用含有1000iu/ml的重組干擾素γ(購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥)的corning培養(yǎng)基(購(gòu)自corning公司)誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入1000iu/ml的重組白細(xì)胞介素2(購(gòu)自沈陽(yáng)三生制藥)和50ng/ml的okt-3繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。每隔三天倍比加液，同時(shí)加入5％的自體血漿，培養(yǎng)至第17天，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cik細(xì)胞中的tcr的陽(yáng)性表達(dá)率(tcr-fitc抗體購(gòu)自miltenyi公司)。tcr+陽(yáng)性率>90％，視為cik誘導(dǎo)成功(見(jiàn)圖3，圖4)，并留取該cik待病毒感染。

(二)慢病毒包裝質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞

復(fù)蘇293t細(xì)胞，培養(yǎng)2天，使其細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到最佳(見(jiàn)圖5)。取6×10⁵個(gè)細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)，為第二天的轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備。轉(zhuǎn)染前將六孔板換成新鮮dmem培養(yǎng)液(購(gòu)自gibco公司)，37℃溫箱中培養(yǎng)1h。將lipofiter^tm脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自漢恒生物)混勻，tcr-rnai和輔助質(zhì)粒pspax2、pmdna2g三種質(zhì)粒以4:3:1的比例將4.0μg的dna溶解于100μl的dmem培養(yǎng)基中，同時(shí)12μl的lipofiter^tm溶于88μl的dmem培養(yǎng)基中，各自室溫靜置20分鐘。將以上兩步中的dna和lipofiter^tm混勻，室溫孵育20分鐘。將lipofiter^tm-dna混合物加入六孔板的一個(gè)孔中，培養(yǎng)6小時(shí)后，去除lipofiter^tm-dna培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48小時(shí)后，顯微鏡下觀察293t細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化(見(jiàn)圖6)。將含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清吸入ep管中，4℃，2000g離心10min，轉(zhuǎn)移至新的ep管中，測(cè)定病毒滴度，4.5μm濾器過(guò)濾后-80℃保存。

(三)慢病毒感染cik細(xì)胞及感染后cik細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)

從-80℃拿出2ml病毒液，加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺(購(gòu)自sigma公司)，用該病毒液重懸1×10⁶個(gè)上述誘導(dǎo)的cik細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入到6孔板的1個(gè)孔中，使病毒顆粒數(shù)與cik細(xì)胞數(shù)比例約為3:1，1000g，32℃，離心90分鐘。37℃，5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)后，收集細(xì)胞，重新加入病毒液和聚凝胺，1000g，32℃，再次離心90分鐘后，37℃，5％的co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)進(jìn)行多重感染，提高cik細(xì)胞的感染效率。吸棄2ml培養(yǎng)上清，加入2ml的新鮮corning培養(yǎng)基，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)17天至細(xì)胞擴(kuò)增至足夠的用量(見(jiàn)圖7)。

(四)免疫磁珠分離已沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞

用ph為7.2的pbs(購(gòu)自beckman公司)配置0.5％的bsa(購(gòu)自gibco公司)和2mm的edta(購(gòu)自beckman公司)，1:10稀釋分離緩沖液。用緩沖液重懸2×10⁷個(gè)病毒感染的t細(xì)胞，用30um的尼龍網(wǎng)(購(gòu)自bd公司)過(guò)濾，300g離心10min。加入緩沖液重懸細(xì)胞，重復(fù)上述操作一次，離心后棄掉上清，加入160ul的緩沖液，加入40ul的單克隆抗體tcr(抗體購(gòu)自miltenyi公司)，混勻，4℃靜置15min。加入2ml的細(xì)胞緩沖液清洗，300g離心10min，加入100ul的緩沖液重懸細(xì)胞。準(zhǔn)備好分離柱(購(gòu)自德國(guó)miltenyi公司)，并用500ul的緩沖液清洗ms，把細(xì)胞懸液倒入柱子中，用500ul的緩沖液沖洗柱子，重復(fù)三次，收集流出的液體。

(五)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)tcr-rnai在t細(xì)胞中的表達(dá)效率

取出1×10⁵個(gè)磁珠分離后的t細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離后的t細(xì)胞fitc(異硫氰酸鹽)通道中t細(xì)胞的tcr陽(yáng)性表達(dá)率。

(六)qrt-pcr檢測(cè)tcr-rnai在t細(xì)胞中的表達(dá)

表1qrt-pcr引物表

從培養(yǎng)瓶中取出1×10⁵個(gè)感染細(xì)胞，用rneasyminikit(購(gòu)自qiagen公司)提取總rna，在反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自transgen公司)作用下合成cdna，利用qpcrmastermix試劑盒(購(gòu)自transgen公司)在表1給出的引物下進(jìn)行反應(yīng)，定量檢測(cè)感染細(xì)胞中的rnai效果。

本發(fā)明還提供了沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞的應(yīng)用方法，包括腸外應(yīng)用，例如局部腫瘤注射、口腔、鼻腔、皮下、靜脈、動(dòng)脈、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)，腹腔內(nèi)、胸腔內(nèi)等。在特定的環(huán)境中，并不局限于應(yīng)用一種治療方法，通常選擇合適、有效的治療途徑。但目前通常用于腫瘤病人的治療方法是局部腫瘤注射和靜脈回輸。

本發(fā)明的目的是將一定劑量發(fā)明的沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞給予動(dòng)物或者病人，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，要引起足夠的治療或預(yù)防反應(yīng)。例如，給予本發(fā)明中的t細(xì)胞在異體內(nèi)發(fā)揮作用，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，如兩個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)，可以檢測(cè)到、并達(dá)到預(yù)防或治療作用。從t細(xì)胞異體回輸?shù)膽?yīng)用到達(dá)到預(yù)防或治療目的的時(shí)間可以是12小時(shí)，或24小時(shí)，或更長(zhǎng)。給予t細(xì)胞的劑量可以依據(jù)本發(fā)明中t細(xì)胞的狀態(tài)，病人本身的身體狀況和治療病人的年齡、體重等而定。

本發(fā)明中病人在進(jìn)行t細(xì)胞治療前，一定要進(jìn)行全身身體檢查，尤其是心、肺、肝、腎功能及血液檢測(cè)，以確保病人治療安全，并以此為依據(jù)，確定給予病人t細(xì)胞的劑量。通過(guò)給予病人不同劑量的t細(xì)胞，根據(jù)病人不同的反應(yīng)狀況，來(lái)確定藥物應(yīng)用的起始量和總的有效劑量。

本發(fā)明還包括沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞應(yīng)用前進(jìn)行淋巴細(xì)胞抑制的化學(xué)藥物治療，放射治療等。通常應(yīng)用的化學(xué)藥物為環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱，其常用劑量分別為60mg/kg和每天25mg/m²，但具體應(yīng)用劑量還要依據(jù)治療所要取得的效果及病人的綜合身體狀況及病人的體重決定。

本發(fā)明中病人回輸完成后，要密切觀察病人的生命體征及可能出現(xiàn)的副作用。常見(jiàn)的副作用有：皮膚發(fā)紅、瘙癢；病人出現(xiàn)心慌、胸悶、呼吸困難；腹瀉；皮下出血、皮疹；持續(xù)高熱。如果出現(xiàn)上述癥狀，說(shuō)明病人可能出現(xiàn)了細(xì)胞因子綜合征，應(yīng)給予病人激素及對(duì)應(yīng)治療，這些癥狀一般持續(xù)一周左右后消失。

本發(fā)明中沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞，可以是自體的t細(xì)胞，也可以是異體的t細(xì)胞。本發(fā)明中所用的t細(xì)胞為異體t細(xì)胞，主要就是解決自體t細(xì)胞功能不全的。所用t細(xì)胞的數(shù)量為0.5×10⁶-1×10⁹/kg。通常所用的t細(xì)胞的劑量為0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

由于本發(fā)明中的沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞是針對(duì)異體回輸避免排斥反應(yīng)的，由于t細(xì)胞在許多癌癥中發(fā)揮作用，所以本發(fā)明的方法可以用到許多癌癥。包括卵巢癌、胰腺癌、肺癌(肺腺癌)、食管癌，胃癌、滑膜肉瘤及間皮瘤等。

本發(fā)明中所提及的治療和預(yù)防，不是指100％或完全的治療或預(yù)防，而是指不同的程度的治療或預(yù)防，即藥物應(yīng)用后，可以有潛在的治療或預(yù)防效果。

總之，本發(fā)明提供了沉默t細(xì)胞受體的t細(xì)胞、核苷酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、及其在治療和預(yù)防過(guò)程中的應(yīng)用。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種沉默t細(xì)胞抗原受體的t細(xì)胞制備方法

<130>2016

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>154

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgatcgcaaaaagggagtgtctttggtgattctcgaaagaatcaccaaagacactccct60

atgggaaagagtggtctggaaaggacgaaacaccgggagattcggcagcttatttcttcg120

gaaataagctgccgaatctcctttttgcggccgc154