專利名稱：對人t淋巴細胞lfa-1抗原上新的抗原決定基特異的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體，特別是涉及對淋巴細胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)上一新的抗原決定基特異的單克隆抗體，它能夠區(qū)分人T8淋巴細胞群體中的殺傷效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞。
雜交瘤技術(shù)的發(fā)展已為更好地了解人類免疫反應(yīng)系統(tǒng)功能作出了貢獻。將抗原導(dǎo)入人體內(nèi)刺激免疫反應(yīng)系統(tǒng)。從而使淋巴細胞合成能與抗原上決定基結(jié)合的抗體分子。在抗血清中產(chǎn)生的抗體組合物，其組成上復(fù)雜可變，而且當給予不同的接受體時能表現(xiàn)出不同的效應(yīng)。雜交瘤技術(shù)使雜交細胞系能再生有預(yù)定之特異性的單克隆抗體(KohlerandMilstein，Nature256，495-597，1975)。已將使用這一技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體用于研究T和B淋巴細胞在調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)中的功能。通過這一研究，已更好地認識了人T淋巴細胞亞群的功能。
人T淋巴細胞能夠識別特異性抗原，發(fā)揮誘導(dǎo)和抑制功能并調(diào)節(jié)實際上所有細胞和體液免疫反應(yīng)的類型和強度?；趥€別細胞所表達的細胞表面糖蛋白，已將具有獨特調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的兩個人類主要T細胞亞類鑒定為T4和T8亞類。T4亞類顯示可提供誘導(dǎo)/輔助功能，而T8亞類顯示有一定抑制功能。另外，還發(fā)展了能夠?qū)細胞劃分為功能上不同的T4和T8群體的單克隆抗體，其也顯示可分別優(yōu)先識別不同類別的抗原(Morimoto等，J.Immunol.134∶1508-1515，1985)。
用單克隆抗體所作研究表明，T4細胞可識別主組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類抗原，而T8細胞則識別Ⅰ類MHC抗原(Meuer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶4395-4399，1982)。已經(jīng)測知，T4和T8細胞亞類內(nèi)存在相當大的功能及表型異質(zhì)性。雖然T8+(CDB+)群體含有前細胞毒性、前抑制和抑制效應(yīng)T細胞，但這些差異仍有待基于使用功能檢測法進行大量檢測。Clement等人(J.Immunol.，133∶2461-2468，1984)試圖使用單克隆抗體來限定免疫系統(tǒng)殺傷細胞的CD8+前體。以前試圖提供一種肯定而精確的區(qū)分表型的工具(即一種單克隆抗體)，以將CD8類細胞辨別為細胞毒性效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞的努力均未獲成功，或都沒有很容易地分辨出來。Takeuchi等人(CellularImmunol.待出版)證明CD8+CD11(T8+Mol-)亞類含有抑制性和細胞毒性效應(yīng)細胞，而T8+Mol+亞類含有NK細胞。因此可見，見于T8+Mol-亞類中的抑制作用具有一般抑制系統(tǒng)的特性，該系統(tǒng)中需要有一種抑制作用誘導(dǎo)物，即T4+2H4+。抑制細胞中的T8+Mol+(CD11)亞類則不需要抑制性誘導(dǎo)細胞，而更象有NK細胞的功能。為此，Takeuchi等人認為T8+CD11-亞類包括抑制和效應(yīng)細胞。這一研究結(jié)果表明還沒有能用于將CD11-亞類確切地分為抑制效應(yīng)細胞和細胞毒性效應(yīng)細胞的單克隆抗體。
在研究細胞毒性T淋巴細胞介導(dǎo)的殺傷時，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)是很重要的(Sanchez-Madrid等，J.Exp.Med.158∶1758-1803，1983)。人LFA-1是一種含有非共價連接之α和β多肽鏈的高分子量表面抗體。已測知α亞單位的分子量為177，000道爾頓，β亞單位的分子量為95，000道爾頓。
LFA-1是一種功能上加強效應(yīng)細胞和靶細胞之間粘附作用的分子。發(fā)現(xiàn)其可與人細胞毒性T淋巴細胞(CTL)中的抗原受體一起發(fā)揮殺傷作用。LFA-1分子存在于B和T淋巴細胞上并標記以不同定量表達的亞群。已發(fā)展了可識別與人T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒性有關(guān)之三種不同抗原的單克隆抗體，從而揭示了了解有關(guān)抗原識別、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)與靶細胞的粘附以及中靶細胞的溶解等過程的復(fù)雜性。這些抗原被鑒定為LFA-1、LFA-2和LFA-3(Sanchez-Madrid等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶7498-7493，1982)。Hildreth等(Eur.J.Immunol.，13∶202-208，1982)還討論了人LFA-1參予細胞介導(dǎo)的淋巴細胞溶解問題?？梢?，CD8+細胞內(nèi)功能性群體之間存在著更為精細的表型差異。
雖然現(xiàn)階段生產(chǎn)雜交瘤和單克隆抗體的一般程序是已知的，但在分離和維持培養(yǎng)的雜交瘤細胞時尚須特別小心。因為由不同細胞產(chǎn)生的抗體可與同一分子上不同的抗原決定基反應(yīng)，所以可知產(chǎn)生抗主題抗原之抗體的、分離的克隆彼此之間也是不同的。為此有必要對所得抗體或含抗體的培養(yǎng)基、血清或腹水液進行足夠的試驗，對每個克隆產(chǎn)生的抗體進行定性，以確切了解由其產(chǎn)生的、用于診斷和治療目的的各種單克隆抗體的復(fù)雜性質(zhì)。
在開發(fā)一種所需的單克隆抗體時，必須鑒定和定位將誘導(dǎo)一與之結(jié)合之特異性抗體的抗原決定基。反過來則要在所完成的融合中建立幾百個雜交瘤克隆并徹底地篩選抗正常和異常組織及不同抗原的克隆，從而鑒別和限定產(chǎn)生有預(yù)期結(jié)合特異性之抗體的克隆。本發(fā)明的目的在于生產(chǎn)一種可與人T8(CD8)細胞表面上表達的特定抗原決定基結(jié)合的單克隆抗體，從而使該T細胞群體內(nèi)這樣的功能亞群能被檢測出來。所提供的單克隆抗體可以更為精確地鑒定CD8類細胞的表型，以致于能夠明確地區(qū)分該類細胞內(nèi)的細胞毒性效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞。
因此，本發(fā)明將提供一種能區(qū)分CD8淋巴細胞群體中殺傷效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞的單克隆抗體。對單克隆抗體特異的表面抗原或決定基是由180，000道爾頓和95，000道爾頓糖蛋白組成的。該抗原被定名為“S6F1”，而且單克隆抗體似乎亦可識別LFA-1抗原上的一個新的抗原決定基。
S6F1抗原優(yōu)先在淋巴細胞的T8+亞群上表達，但在一次對未篩分T細胞和T4+淋巴細胞所作的研究中，其只在很小程度上被單克隆抗體識別?；赟6F1抗原的這種特異性，使單克隆抗體能夠用于再細分人外周血淋巴細胞樣品中的T8+群體，從而確定這些細胞的功能異質(zhì)性。利用單克隆抗體限定LFA-1抗原及其在產(chǎn)生細胞毒性過程中的功能是以前不知道的。


圖1A和1B顯示本發(fā)明的單克隆抗體與某些T淋巴細胞之反應(yīng)活性的熒光掃描圖。
圖2A和2B為涉及鑒定淋巴細胞亞群的實驗的圖群說明，其中分出細胞毒性效應(yīng)細胞類。
圖3A和3B顯示抑制效應(yīng)活性與攜帶S6F1抗原之T8細胞群之間的關(guān)系。
圖4顯示對S6F1和LFA-1抗原免疫沉淀分析結(jié)果。
單克隆抗體制備使用標準的雜交瘤制備方法用細胞系1670免疫Balb/c小鼠(該細胞系是得自用Herpesvirus Saimiri感染之白唇 的持久生存的脾細胞群體)。收獲小鼠脾細胞并在聚乙二醇中與P3/NS1/1-AG4-1骨髓瘤細胞融合。在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細胞群體以得到克隆化的雜交瘤細胞，檢測單克隆抗體產(chǎn)生，并就所產(chǎn)生的單克隆抗體進行篩選和特異性選擇。
使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法由健康供血者的血液樣品中分離外周血淋巴細胞。按照Meuer等人(前述文獻)所述的方法，使用羊紅血球以E玫瑰花形成法將淋巴細胞分離成T和非T細胞群。首先根據(jù)與T細胞的反應(yīng)活性篩選單克隆抗體，以辨別任何特異性細胞結(jié)合特征。分別用T4單隆抗體和T8抗體，通過補體介導(dǎo)的細胞溶解得到T4和T8淋巴細胞，然后使用購自Coulter公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的EPICS
裝置，以細胞分類方法(cell sorting procedures)分析與單克隆抗體的反應(yīng)活性。分析之后檢測本發(fā)明的單克隆抗體與未篩分的T、T4和T8細胞的反應(yīng)活性，并根據(jù)與T8細胞反應(yīng)及對“S6 F1”抗原的特異性結(jié)合來對其進行定性。單克隆抗體，即抗-S6 F1，可以區(qū)分T8淋巴細胞群體中的殺傷效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞。其限定了由180，000道爾頓和95，000道爾頓分子量糖蛋白組成的細胞表面結(jié)構(gòu)。正如將要進一步討論的，經(jīng)過連續(xù)的免疫沉淀研究和雙向凝膠電泳分析，結(jié)果表明S6 F1單克隆抗體可識別LEA-1抗原上的一個新的抗原決定基。
參見圖1A和1B，數(shù)據(jù)進一步證實了S6 F1單克隆抗體與某些T淋巴細胞的反應(yīng)活性。圖1A代表了對得自10個正常供血者血液的未篩分的T淋巴細胞、CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞的一次細胞熒光掃描圖象分析。在購自Coulter公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)EPICS
C流式細胞計算器上以間接免疫熒光法對每個T淋巴細胞群的各1×106個細胞進行它們與S6 F1單克隆抗體之反應(yīng)活性的分析(以1∶1000的比例)。細胞制備和染色方法均為本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)方法。各柱形圖中縱座標或Y軸顯示細胞的數(shù)目，相對橫座標或其X軸顯示熒光強度。
在這個有代表性的研究中，顯示了在所標明的T淋巴細胞上表達S6F1抗原的熒光掃描圖，結(jié)果表明17%未篩分的T細胞、14%CD4+淋巴細胞和58%CD+8細胞與S6F1抗體有反應(yīng)性。因此，在CD8+淋巴細胞群體上優(yōu)先表達S6F1抗原。S6F1抗體與被檢的70%以上的無表面標志細胞、粒性白細胞和T細胞系HSB反應(yīng)。然而它只與得自其他試驗的巨噬細胞、B細胞、B細胞系即Raji、Ramos、Nalms-1、EB病毒轉(zhuǎn)化的細胞系、血生成細胞系U-937、K-562、KG-1或T細胞系Molt4、CEM和JM群體中之10%的細胞反應(yīng)。
圖1B代表了正常供體之CD4和CD8淋巴細胞與各種不同稀釋度識別LFA-1抗原之已知單克隆抗體2 F12的反應(yīng)活性。使用EPICS C細胞分類器(cell sorter)以間接免疫熒光法進行分析。各柱形圖展示了細胞數(shù)-熒光強度關(guān)系曲線。在使用抗LFA-1抗體(1∶100稀釋)的柱形圖a和d中，得到98%的細胞反應(yīng)活性。在使用單克隆抗體(1∶1000稀釋)的柱形圖b和e中，得到98%的細胞反應(yīng)活性。在使用抗體(1∶1000稀釋)的柱形圖c和f中，得到52%的CD4細胞反應(yīng)活性和58%的CD8細胞反應(yīng)活性。這一分析反映了CD4和CD8淋巴細胞群對LFA-1抗原特異性單克隆抗體2 F12之染色圖形的變異，而S6 F1單克隆抗體則顯示可優(yōu)先與CD8+淋巴細胞結(jié)合。
因為發(fā)現(xiàn)S6F1抗體可與CD8+淋巴細胞的一相當大的群體反應(yīng)，故可利用該抗體進一步區(qū)分外周血淋巴細胞的CD8+群體，以確定這些細胞的功能異質(zhì)性。提供一種方法以研究是否可用S6F1單克隆抗體從CD8+抑制細胞中分離出呈同種反應(yīng)性的細胞毒性T淋巴細胞，即前體或效應(yīng)細胞。為了確定是否同種抗原特異性細胞毒性T細胞的前體屬于CD8+細胞的S6F1+或S6F1-群體，檢測了由CD8+細胞亞類的特異性細胞介導(dǎo)的淋巴細胞溶胞作用(CML)。
使用已知方法分離新鮮的CD8+細胞，用S6 F1抗體標記并用結(jié)合了熒光素的F(ab′)2羊抗小鼠F(ab′)2(Tago)顯色。依照Morimoto等人(J.Immunol.134∶1508-1515，1985)的方法使用EPICS C細胞分類器將標記的CD8細胞分為CD8+S6 F1+和CD8+S6 F1-細胞群。然后加入經(jīng)過補體介導(dǎo)的溶胞作用所得到的1×106/mlCD4+細胞，以在該系統(tǒng)中產(chǎn)生殺傷誘導(dǎo)功能;37℃下于含5%CO2的濕空氣環(huán)境中，在等數(shù)目經(jīng)照射的同種刺激細胞即E-細胞存在下在多小井培養(yǎng)板內(nèi)與1×106/ml未篩分的CD8+、篩分的CD8+S6 F1+或CD8+S6 F1-細胞一起培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，通過補體介導(dǎo)的CD4+細胞溶解由培養(yǎng)物中除去CD4細胞。細胞培養(yǎng)4小時后，按Meuer等人(Proc.Natl.Acad，Sci，USA79∶4395-4399，1982)所述的方法，檢測CD8細胞亞類的51Cr標記釋放細胞介導(dǎo)的淋巴細胞溶解。
參見圖2A，圖中縱座標顯示%比溶胞作用，橫座標為效/靶比例。圖2A中顯示一成對實驗的結(jié)果。其表明抗特異性靶細胞的大多數(shù)細胞毒性T細胞存在于CD8+S6F1-亞類中，而只有小部分見于CD8+S6F1+亞類中。
參見圖2B，所給數(shù)據(jù)進一步證實細胞毒性效應(yīng)T細胞屬于混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)激活的CD8+S6 F1+細胞，而不是CD8+S6 F1-細胞。進行這一檢測的方法如下在25cm2培養(yǎng)瓶中，含有4mML-谷氨酰胺、25mM Hepes緩沖液(Microbiological Associates)、0.5%碳酸氫鈉和10%青霉素-鏈霉素的最終RPMI1640培養(yǎng)基(10%儲備的人AB型血清-Pel Freeze)內(nèi)，于含5%CO2的濕空氣環(huán)境下用等數(shù)目經(jīng)照射的(5000 Rad)同種(E-)刺激細胞致敏1×106個/ml未篩分的T細胞6天。借助EPICS
C細胞分類器將用同種E細胞致敏的未篩分T細胞分成CD8+S6 F1+和CD8+S6 F1-亞類。用對51Cr標記的靶細胞的細胞介導(dǎo)的淋巴溶胞試驗分析未篩分的和篩分的CD8+細胞，方法包括融溶冷凍保存的同種(E-)細胞，培養(yǎng)約10-12小時并在0.2ml鉻酸鈉(溶于鹽溶液，1m Ci/ml，Eew England Nuclear)中37℃保溫1小時。洗滌靶細胞(即51Cr標記的細胞)并重新懸浮謐鈧張嘌校 05個/ml)。使用有V形底小井的培養(yǎng)板進行標準4細胞毒性試驗。圖2B中給出了一對實驗的結(jié)果。
與圖2A中所示的數(shù)據(jù)相反，該實驗證明CD8+S6F1+淋巴細胞群與未分選的CD8+群體有更大的同種特異性殺傷效應(yīng)活性。在CD8+S6F1-淋巴細胞群中實際上未觀察到殺傷效應(yīng)活性。由這些實驗得到的其他數(shù)據(jù)(未示出)表明S6F1單克隆抗體并不阻斷效應(yīng)功能，但抗MHCⅠ類和抗LFA-1單克隆抗體可阻斷殺傷效應(yīng)功能(參見Meuer等，上述文獻;Sanchez-Madrid等，J.Exp.Med.158∶1785-1803，1983;SanchezMadrid等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79∶7489-7493，1982)。這一資料表明殺傷前體T細胞是見于細胞的CD8+S6F1-亞類中，但殺傷效應(yīng)活性卻屬于CD8+S6F1+亞類。
由這些試驗所獲得的數(shù)據(jù)表明，在初級MLR反應(yīng)期間S6F1抗原可不斷地在S6F1陰性CD8+細胞群體上得以表達。初級MLR是使用CD8+S6F1-淋巴細胞聯(lián)合CD4+細胞一起發(fā)動的，以估計T淋巴細胞對S6F1抗原的表達。根據(jù)三次實驗的結(jié)果，可見在MLR活化后有45-55%CD8+S6F1-細胞的表面上表達了S6F1抗原。這些結(jié)果表明在CD8+細胞的S6F1陰性群體上誘導(dǎo)了S6F1抗原表達。
圖3A中所示的數(shù)據(jù)，旨在確定CD8+細胞的哪一個亞類被激活而變?yōu)橐种菩?yīng)細胞。使用前面已討論過的技術(shù)和EPICS
C細胞分類器將所制備的末篩分T細胞分成CD8+S6 F1+和CD8+S6 F1-亞類。在圓底、多小井微量培養(yǎng)板中，向用Pockweed促分裂素(PWM)刺激的5×104個B細胞和2×104個CD4+細胞內(nèi)加入不同數(shù)目的CD8細胞，并于培養(yǎng)7天后測定培養(yǎng)物中的總IgG免疫球蛋白產(chǎn)量。按Meuer等人(前述文獻)所述的放射免疫檢測法檢測培養(yǎng)物上清液中的IgG分泌量。
如圖3A中所示，當增加所加入之未篩分CD8+細胞的數(shù)目時，將以一種劑量依賴方式抑制PWM刺激的B細胞IgG分泌。當增加加入到CD4+和B細胞中的CD8+S6F1-細胞數(shù)目時，可觀察到對IgG分泌的更大程度的抑制。相反，向B和CD4+細胞的混合物內(nèi)加入CD8+S6F1+細胞，則IgG分泌只稍有降低。這些結(jié)果表明CD8抑制細胞的前體屬于CD8+S6F1-亞類。
在一同種抗原刺激的IgG合成系統(tǒng)中，于MLR激活后檢測CD8+細胞各亞類的抑制功能，以根據(jù)結(jié)果確定CD8+S6 F1+群體中是否可見有T細胞抑制活性。在抗同種抗原的MLR中使已制備的T細胞被激活6天，并在EPICS
C細胞分類器上將同種激活的T細胞分為CD8+S6 F1+和CD8+S6 F1-細胞。在用于MLR的經(jīng)照射的同種抗原存在下，向自體外周血淋巴細胞(PBL)內(nèi)加入未分離的CD8和CD8+細胞的亞類，并估計同種抗原驅(qū)動IgG合成的效果。按下列公式計算IgG合成的百分抑制%抑制＝1- (檢測到的IgG)/(非調(diào)節(jié)細胞中的IgG) ×100如圖3B中所示，同種激活的未篩分CD8+細胞以一種劑量依賴方式抑制了同種抗原驅(qū)動的IgG合成。用同種抗原激活的CD8+S6F1細胞群在該系統(tǒng)中顯示比未篩分的CD8+細胞有更大的抑制活性。但同種抗原激活的CD8+S6F1+淋巴細胞只有當以很大數(shù)目加入到這些培養(yǎng)物中時才表現(xiàn)出很小的抑制活性。這些結(jié)果表明，抑制性前體細胞和抑制效應(yīng)細胞均屬于CD8+S6F1-淋巴細胞群體。特別重要的是，上述結(jié)果暗示抑制作用大概不是細胞毒性的唯一表現(xiàn)。
考慮到S6F1抗原在鑒定細胞毒性效應(yīng)T細胞中的效能，使用抗2F12對S6F1和LFA-1抗原的免疫沉淀分析了抗原結(jié)構(gòu)。分析數(shù)據(jù)示于圖4A、4B和4C中。
用伴刀豆球蛋白A(ConA)(20μg/ml)激活富集T細胞后得到的細胞(95%E+細胞)，3天后借助乳過氧化物酶催化的碘化作用(Per Hubbard等，Biochemical Analysis of Membrane，Ed.Maddy，AH，p427-501，Chapman and Hall，1976)用125I標記、洗滌、然后溶解在溶胞緩沖液(1%W/V Nonidet p-40，溶于含150mM Nacl、1mM EDTA和1mM苯基甲基(sulphony)氟的20mM Tris-HCl緩沖液pH8.0)中。使溶胞產(chǎn)物(相當5×107個細胞)與5μl個別抗體的腹水液于4℃保溫過夜，然后用50μl的10%(W/V)蛋白ASepharose沉淀之。將免疫沉淀物在含0.1%(W/V)SDS的溶胞緩沖液中洗滌一次并單用溶胞緩沖液洗兩次。然后按Laemmli(Nature London)227∶680-684，1970)所述的SDS-PAGE電泳法進行分析。用TSI/18抗體經(jīng)四次免疫沉淀預(yù)清凈得自標記之外周血淋巴細胞的溶胞產(chǎn)物，然后用S6 F1抗體沉淀。按已述方法標記并制備溶胞產(chǎn)物，然后于50℃下在等電聚焦樣品緩沖液(9.2M尿素、2%Nanidet p-40、2%兩性電解質(zhì)pH2-11)(Serva)中保溫30分鐘而由小珠上洗脫免疫復(fù)合物。按前面已述及的方法(O′Farrell等，Cell 12∶1133-1142，1977;Rudd等，J.Biol.Chem.200∶1927-1936，1985)進行雙向NEGPHE/SDS-PAGE電泳分析。
圖4顯示了用S6F1單克隆抗體和2F12單克隆抗體(其可識別來自ConA激活之T細胞的LFA-1抗原)沉淀后之多肽的電泳分析圖形。圖4A部分中所示的泳道1和2分別與S6F1和2F12單克隆抗體有關(guān)。泳道1顯示用S6F1抗體沉淀后分離的分子量分別為180，000道爾頓和95，000道爾頓的兩條主要帶。泳道2顯示用2F12沉淀后得到的似乎分別相當于LFA-1抗原之α和β亞單位的電泳圖形。
圖4B部分顯示經(jīng)連續(xù)免疫耗竭(immuno-depletion)和雙向不平衡凝膠電泳分析(NEPHGE/SDS-PAGE)以直接證明S6F1抗原之特性而得到的數(shù)據(jù)。泳道1與S6F1抗體有關(guān)，泳道2與2F12抗體有關(guān)。部分B顯示抗LFA-1抗原的2F12抗體完全除掉了可與S6F1反應(yīng)的材料。應(yīng)注意的是，已顯示單克隆抗體TS1/18可與LFA-1抗原的β亞單位反應(yīng)(見Sanchez-Madrid等，前述文獻)。
C欄給出了對S6F1和LFA-1抗體作2-DNEPHGE/SDS-PAGE分析所獲得的結(jié)果。結(jié)果顯示抗S6F1和LFA-1抗原的抗體沉淀分子量分別為180，000道爾頓和95，000道爾頓、等電點分別為pH5.3和5.7的兩種多肽。C欄內(nèi)的電泳數(shù)據(jù)支持S6F1單克隆抗體結(jié)合LFA-1抗原這一觀察結(jié)果。
雖然S6F1和2F12單克隆抗體免疫沉淀同樣結(jié)構(gòu)的抗原，但它們與功能上不同之細胞亞類的反應(yīng)性似乎是不同的。圖1A和1B中圖解顯示的數(shù)據(jù)表明，S6F1單克隆抗體優(yōu)先著染CD8+淋巴細胞，而2F12抗體則表現(xiàn)還可與CD4+淋巴細胞反應(yīng)。據(jù)信CD8+淋巴細胞與S6F1抗體的反應(yīng)性并不能簡單地反映抗體對LFA-1抗原結(jié)構(gòu)本身的低親和力。
我們根據(jù)用S6F1單克隆抗體所作分析確定，該抗體識別的真正抗原決定基似乎不參予細胞毒性過程，因為抗體不能夠阻斷這一功能。然而其他抗LFA-1抗原的已知單克隆抗體卻能有效地阻斷這一細胞毒性過程(見Sanchez-Madrid等，上述文獻)。另外還確定了S6F1抗原主要是在CD8+細胞、無表面標志細胞和小部分巨噬細胞以及B細胞上表達。這些資料表明，由S6F1抗體識別的LFA-1抗原上的抗原決定基，可能是通過在參予對靶細胞之粘附功能的LFA-1抗原上發(fā)展結(jié)合位點而在抗原分子上形成的。
因此，S6F1單克隆抗體可通過識別LFA-1抗原上一新的抗原決定基而將細胞毒性效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞區(qū)分開。S6F1抗原的這一獨有的特征可用于診斷和限定CD8細胞毒性效應(yīng)細胞，以主要借助流式細胞計數(shù)技術(shù)及其他已知的檢測技術(shù)將其與抑制效應(yīng)細胞區(qū)分開。例如，已知CD8細胞毒性效應(yīng)細胞在人類移植物排斥(如對腎和其他移植物的排斥)中起著重要作用。抗CD8+S6F1細胞毒性效應(yīng)細胞的S6F1抗體能夠選擇性地鑒別這些效應(yīng)細胞，從而在逆轉(zhuǎn)同種異體移植物排斥作用中使抑制細胞群發(fā)揮功能而起到治療作用。因此S6F1單克隆抗體的特異性可能在治療不斷發(fā)展的移植物排斥中是有用的。
CD8類細胞內(nèi)S6F1單克隆抗體的這種特異性是非常獨特的，并就其作為一種前所未有的抗體它是很有用的，其可為區(qū)分CD8類淋巴細胞內(nèi)的抑制效應(yīng)和細胞毒性效應(yīng)細胞提供一種肯定的而且更為精確的表型檢測工具。Clement等人(J.Immunol.133∶2461-2468，1984)討論了限定人類免疫系統(tǒng)中細胞毒性細胞之CD8前體的單克隆抗體，但并沒有獲得本發(fā)明用S6F1單克隆抗體所得到的結(jié)果。
寄存生產(chǎn)本發(fā)明S6F1單克隆抗體的細胞系已在提交本申請之前，于1987年10月30日寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.20852)。細胞系的ATCC登記號為HB9579。
尚未確定本發(fā)明的單克隆抗體的全部診斷和可能的治療應(yīng)用。鑒于該單克隆抗體的性質(zhì)，其無論單獨使用或與放射性同位素、藥物或毒素偶聯(lián)，在人類器官移植過程中均可能具有治療價值。
權(quán)利要求
1.一種用雜交瘤技術(shù)制得的細胞系，其可產(chǎn)生與LFA-1抗原上S6 F1抗原決定基特異性結(jié)合的單克隆抗體，而且該單克隆抗體能夠區(qū)分人CD8淋巴細胞群體中的細胞毒性效應(yīng)細胞和抑制效應(yīng)細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中小鼠脾細胞是用得自Herpesvirus Samiri感染的白唇
之永久存活的脾細胞群免疫的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細胞系，其可產(chǎn)生抗S6F1抗原的小鼠IgG1同型抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中所說的單克隆抗體生成細胞得自于鼠屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其為與小鼠骨髓瘤細胞融合而衍生的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中S6 F1抗原是在-CD8淋巴細胞亞類的表面上表達的，而且該抗原的進一步特征在于其為由180，000道爾頓和95，000道爾頓分子量糖蛋白組成的細胞表面結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中雜交瘤細胞系完全相同于寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland)寄記號為HB9579的細胞系。
8.一種可與人血中T淋巴細胞群的一個亞類細胞表面上的抗原特異結(jié)合的單克隆抗體，所說的抗原的進一步特征在于其可在CD8細胞毒性效應(yīng)細胞上被檢測到，而在CD8抑制效應(yīng)細胞上基本上不能檢測到。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體，其中所說的抗原之特征在于其為由180，000道爾頓和95，000道爾頓分子量糖蛋白組成的細胞表面結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體，其中所說的單克隆抗體結(jié)合LFA-1抗原上的抗原決定基。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的單克隆抗體，其具有由已寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心之鑒記號為ATCCHB9579的細胞系所產(chǎn)生的小鼠同型IgG1。
12.一種可與人外周血中T淋巴細胞之LFA-1抗原上的抗原決定基結(jié)合的單克隆抗體，且其進一步的特征在于可優(yōu)先與外周血淋巴細胞中T8細胞毒性效應(yīng)和T8細胞毒性抑制細胞群體內(nèi)的T8細胞毒性效應(yīng)細胞結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的單克隆抗體，其可結(jié)合SF61抗原。
14.一種區(qū)分人CD8淋巴細胞群體的樣品中細胞毒性效應(yīng)細胞和抑制效應(yīng)細胞的方法，其包括使所說的樣品與S6 F1單克隆抗體在足以使所說的S6 F1單克隆抗體與CD8細胞毒性效應(yīng)細胞之間形成免疫復(fù)合物的條件下接觸一定時間，然后檢測由所說的單克隆抗體和所說的樣品中的細胞相接觸而產(chǎn)生的免疫復(fù)合物，其中與所說的單克隆抗體相復(fù)合的細胞是CD8細胞毒性效應(yīng)細胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其包括用一種可檢測的化合物標記所說的單克隆抗體這一步驟，從而用所說可檢測的化合物標記所說的復(fù)合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其包括用細胞分類流式細胞計數(shù)方法分離被檢測到的免疫復(fù)合物這一步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的可檢測化合物是一種熒光化合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所說的可檢測化合物是產(chǎn)生所說化合物的酶。
19.一種小鼠IgG1同型的鼠單克隆抗體，其為對S6 F1抗原特異的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的單克隆抗體，其中S6 F1是由外周血淋巴細胞中CD8細胞毒性效應(yīng)細胞之表面上篩選的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的單克隆抗體，其為可檢測之標記形式的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的單克隆抗體，其中所說的標記選自于染料、熒光化合物、放射活性或電子密集元素。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的單克隆抗體，其中所說的標記是一種化學(xué)治療劑、光活性的毒性劑或放射活性劑。
24.一種檢驗和測定CD8細胞毒性淋巴細胞亞類之液體生物樣品中S6 F1抗原的方法，其包括使用與選自熒光化合物、放射活性元素或能產(chǎn)生底物反應(yīng)可檢測化合物之酶的檢測基團結(jié)合的S6 F1單克隆抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其包括對被所說的單克隆抗體結(jié)合的CD8細胞毒性淋巴細胞進行流式細胞計數(shù)分類這一步驟。
26.一種治療人體內(nèi)正在發(fā)展中的對同種異體移植物排斥的方法，其包括使用S6 F1單克隆抗體選擇性地鑒別外周血淋巴細胞中CD8細胞毒性效應(yīng)細胞，然后排除所說效應(yīng)細胞的供應(yīng)，從而能使CD8抑制細胞群體發(fā)揮功能以逆轉(zhuǎn)對同種異體移植物的排斥。
全文摘要
一種優(yōu)先與人CD8淋巴細胞群體的一個亞類結(jié)合的單克隆抗體，其可用于肯定而精確地區(qū)分CD8細胞群體中細胞毒性效應(yīng)和抑制效應(yīng)細胞。該單克隆抗體可借助它能與表達其表面抗原上一新的抗原決定基的CD8細胞結(jié)合而識別LFA-1抗原的該抗原決定基。該抗體優(yōu)先結(jié)合的CD8亞類細胞群體是CD8細胞毒性效應(yīng)細胞群。單克隆抗體的這一選擇性可使其用于進行細胞分選，診斷和積極的治療。
文檔編號G03G21/00GK1033074SQ8810750
公開日1989年5月24日 申請日期1988年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月2日
發(fā)明者斯圖爾特·F·施洛斯曼, ?？肌つ侄嗵?申請人:達娜-法勃腫瘤研究所