專利名稱：一種粒細(xì)胞分離液及其粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種粒細(xì)胞的分離及活性測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害人類生命和健康的一大疾病，目前已列人群疾病死亡病因的第二位。 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有900萬新發(fā)癌癥，500萬人死亡。目前腫瘤的治療方法主要是手術(shù)、放療和化療。其中，外科手術(shù)治療只適用于早期腫瘤，而放化療毒副作用較大。因此，開發(fā)安全有效的新一代抗腫瘤生物療法將有著極其重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 異體人粒細(xì)胞輸注治療技術(shù)即通過向癌癥患者注射來自健康捐贈(zèng)者“超強(qiáng)生命力”的腫瘤殺傷活性(cancer killer activity, CKA)粒細(xì)胞，幫助治療甚至治愈惡性腫瘤。而選擇高效的粒細(xì)胞是異體人粒細(xì)胞輸注治療技術(shù)治療腫瘤的關(guān)鍵，但是現(xiàn)有技術(shù)中并沒有關(guān)于通過分離粒細(xì)胞并測(cè)定其活性就能篩選出高效的粒細(xì)胞的方法。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種粒細(xì)胞分離液及其粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，旨在解決如何分離并篩選出高效的粒細(xì)胞的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種粒細(xì)胞分離液，其中，所述粒細(xì)胞分離液是由percoll、10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水配制成，所述percoll、10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水體積比為;Γ8:1:廣5。所述的粒細(xì)胞分離液，其中，所述的粒細(xì)胞分離液的配制方法為
先加入10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水，搖勻，再加入percoll，混勻；所述percoll、 10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水體積比為3 8:1 廣5。一種使用上述的粒細(xì)胞分離液進(jìn)行粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，包括以下步驟
5100、從采集到的血液樣本中分離粒細(xì)胞； S200、對(duì)分離得到的粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定活性；
所述粒細(xì)胞分離的過程，是用所述粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，將配制好的多個(gè)密度的粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度加入到離心管中，將血液樣本平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上，進(jìn)行室溫離心。所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，所述步驟S100具體包括以下步驟
5101、在血液樣本中加入紅細(xì)胞沉淀液，使紅細(xì)胞沉淀，取上清白膜層；
5102、將配置好的所述粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度，將不同密度的粒細(xì)胞分離液加入到離心管中，然后把所述上清白膜層平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上；
5103、室溫500g離心30分鐘；
5104、用吸管吸出上層血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞，和吸出管底第1層至第2層粒細(xì)胞分離液的液面之間的粒細(xì)胞。所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，所述步驟S102中，所述粒細(xì)胞分離液設(shè)置5個(gè)密度梯度。所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，所述步驟S102中，所述粒細(xì)胞分離液設(shè)置的5個(gè)密度梯度，按Percoll比重為:1·208、1· 195,1. 179,1. 167和1. 155。所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，所述步驟S200具體包括以下步驟
5201、在培養(yǎng)板上，設(shè)置只加粒細(xì)胞的粒細(xì)胞對(duì)照孔、只加靶細(xì)胞的靶細(xì)胞對(duì)照孔和只加CM的空白對(duì)照孔，還有加有粒細(xì)胞和靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)孔，在所述靶細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔中分別加入腫瘤靶細(xì)胞；
5202、分別向粒細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔的培養(yǎng)孔中加入粒細(xì)胞；
5203、混勻，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5204、每孔加入CCK-8試劑；
5205、在飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
5206、在酶標(biāo)儀上用450-490nm波長測(cè)各孔吸光度，計(jì)算粒細(xì)胞的殺傷率。所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其中，所述步驟S203和S205中，都是在37°C、 5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。有益效果本發(fā)明主要利用特殊的粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，進(jìn)而測(cè)定粒細(xì)胞的活性，達(dá)到篩選出高效的粒細(xì)胞的目的，提高粒細(xì)胞治療腫瘤的效果，有利于針對(duì)性選擇供體。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例中96孔培養(yǎng)板上的布局圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例中使用粒細(xì)胞分離液分離粒細(xì)胞的示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例中A值曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種粒細(xì)胞分離液及其粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明所提供的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定的方法，主要包括以下兩個(gè)步驟
5100、從采集到的血液樣本中分離粒細(xì)胞； S200、對(duì)分離得到的粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定活性。所述步驟SlOO粒細(xì)胞的分離過程，主要是利用特殊的粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，進(jìn)而測(cè)定粒細(xì)胞的活性。所述步驟SlOO粒細(xì)胞的分離過程主要包括以下步驟
5101、將血液樣本進(jìn)行必要的消毒處理；
5102、用細(xì)胞儀對(duì)血液樣本進(jìn)行白細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)；
5103、加入紅細(xì)胞沉淀液，使紅細(xì)胞沉淀，取上清白膜層；
5104、將配置好的所述粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度，將不同密度的粒細(xì)胞分離液加入到離心管中，然后把上清白膜層平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上；
5105、室溫500g離心30分鐘；
5106、用巴斯德吸管吸出管底第1層至第2層粒細(xì)胞分離液的液面之間的粒細(xì)胞，即為效應(yīng)細(xì)胞。所述粒細(xì)胞分離液的由三種組分組成，分別為
母液A: percoll (珀可，是聚乙烯吡咯酮包被的二氧化硅殼粒的無菌膠體懸液)； 母液B: 10倍PBS (磷酸鹽緩沖溶液)； 母液C:生理鹽水。所述percoll 密度是 1. 23g/L。應(yīng)用所述母液Α、母液B、母液C的配置不同密度的粒細(xì)胞分離液時(shí)，所述母液Α、母液B、母液C的體積比為3 8:1 廣5。所述不同濃度梯度的粒細(xì)胞分離液的制備方法如下
Si、取η (η為大于1的自然數(shù))支50mL無菌離心管，分別標(biāo)為1、· · 、！1，對(duì)應(yīng)粒細(xì)胞分離液1-n。S2、將各離心管放在天平上分別稱重，記錄各管的重量。S3、按照比例和所需密度，分別往1-n號(hào)離心管中加入粒細(xì)胞分離母液C和B，輕輕搖勻；然后再分別加入粒細(xì)胞分離母液A，用吸管混勻。S4、再將各離心管放在天平上分別稱重，分別減去各自空管的重量，與表中對(duì)應(yīng)的重量進(jìn)行對(duì)比，如有誤差，分別添加母液A或C進(jìn)行調(diào)整，直到重量相符為止。S5、用0.45 μ m無菌過濾器負(fù)壓吸引過濾除菌，分裝與50mL無菌離心管中，20mL/ 管，標(biāo)簽注明分離液名稱，配制日期。使用所述粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，是將配制好的粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度加入到離心管中，然后把血液樣本沉淀后的上清白膜層平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上，然后進(jìn)行室溫離心。如圖2所示，在從管底算起，第1層粒細(xì)胞分離液(即粒細(xì)胞分離液1)和第2層粒細(xì)胞分離液的液面之間即為粒細(xì)胞。紅細(xì)胞在第一層粒細(xì)胞分離液之中，單個(gè)核細(xì)胞在第5層細(xì)胞分離液的液面之上。使用所述粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，粒細(xì)胞分離液的密度越精細(xì)，粒細(xì)胞分離的純度越高。應(yīng)用上述密度梯度的粒細(xì)胞分離液分離粒細(xì)胞，純度可以達(dá)到90%。經(jīng)過SlOO分離得到的粒細(xì)胞即為效應(yīng)細(xì)胞，所述S200的粒細(xì)胞活性測(cè)定過程，主要包括以下步驟
5201、在96孔培養(yǎng)板上，設(shè)置只加效應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔、只加靶細(xì)胞的靶細(xì)胞對(duì)照孔和只加CM的空白對(duì)照孔，還有加有效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)孔，在靶細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔中分別加入Hela細(xì)胞(腫瘤靶細(xì)胞)；
5202、根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞20:1、10:1、3:1的比例，分別向效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔的培養(yǎng)孔中加入相應(yīng)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞；
5203、混勻，在37°C，5%CO2的條件下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh ；
5204、每孔加入CCK-8 (Cell Counting Kit_8)試劑；
5205、在37°C，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)濁；
5206、在酶標(biāo)儀上用450-490nm波長測(cè)各孔吸光度(A值)，計(jì)算出3_5個(gè)復(fù)孔的平均值，計(jì)算殺傷率。所述效應(yīng)細(xì)胞的殺傷率的計(jì)算公式為Κ=1-〔Α (效應(yīng)細(xì)胞+ IG細(xì)胞)-A效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照/Aig細(xì)胞對(duì)
照一Λ空白對(duì)照〕氺100%。下面詳細(xì)說明一下結(jié)合具體實(shí)施例說明本發(fā)明的效應(yīng)細(xì)胞分離及活性測(cè)定的方法詳細(xì)步驟
將采集到的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行分離前，需要先做以下準(zhǔn)備 Day (-2) Hela細(xì)胞(腫瘤靶細(xì)胞)培養(yǎng)接種
1)將2. 5X105或3X105個(gè)Hela細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，每瓶5mL CM (完全培養(yǎng)
基)ο2)在37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Day (_1)
Hela細(xì)胞培養(yǎng)的觀察
3) Hela細(xì)胞經(jīng)24h培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)可翻倍，形態(tài)良好。4)培養(yǎng)基顏色未明顯變黃(培養(yǎng)基顏色明顯變黃說明細(xì)胞長過了)。Day (0) Hela細(xì)胞接種平底96孔培養(yǎng)板
5)棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加5-10毫升PBS (磷酸鹽緩沖溶液)清洗細(xì)胞，吸棄PBS， 加3-5毫升0. 25%的胰酶消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓，加入5mL CM(完全培養(yǎng)基)終止胰酶消化，用吸管將細(xì)胞移入15mL離心管，取0. 1毫升做臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)細(xì)胞。6)調(diào)細(xì)胞濃度為50000/mL，充分混勻，將細(xì)胞加到加樣槽中，充分混勻，用排槍將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板相應(yīng)孔中(加細(xì)胞時(shí)要輕)，96孔培養(yǎng)板布局見圖1，100 μ L/孔(5000 個(gè)細(xì)胞/孔)，50 μ L/孔(2500個(gè)細(xì)胞/孔)+50 μ L/孔CM, 25 μ L/孔(1750個(gè)細(xì)胞/孔) +75 μ L/孔CM，每加一排輕搖培養(yǎng)板和靶細(xì)胞懸液。注意(1)使每孔細(xì)胞均勻分布于孔底 (避免細(xì)胞聚集于孔的周邊)，(2)混勻靶細(xì)胞懸液，其余各實(shí)驗(yàn)孔(效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔、空白對(duì)照孔)每孔加IOOuL CM,96孔板周邊各孔加滿生理鹽水。7)在37°C，5%C02,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。將采集到的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行分離的步驟主要包括 Day (1)效應(yīng)細(xì)胞的分離及接種
8)對(duì)所得血液樣本進(jìn)行必要的消毒處理，經(jīng)傳遞窗送入實(shí)驗(yàn)室。9)將20mL血液樣本移入尖底50mL離心管，確定血液總體積，用吸管將細(xì)胞輕輕混勻，立即吸取細(xì)胞懸液20μ L用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行外周血白細(xì)細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)。10)紅細(xì)胞沉淀液加入等量的3%葡聚糖(Dextran)和0. 9%NaCl沉淀液，蓋緊離心管蓋，輕輕顛倒離心管5次混勻，打開管蓋用棉簽仔細(xì)將管蓋及管口及液面以上的血擦干凈，在室溫靜置45分鐘使紅細(xì)胞沉淀。11)取2-3支15mL離心管，按照粒細(xì)胞分離液1、2、3、4、5的順序，分別依次加入5 種分離液，每種分離液加入lmL，總體積5mL ；
所述粒細(xì)胞分離液1、2、3、4、5按照以下表格的配方配制而成， 所述粒細(xì)胞分離液1-5，其密度分別如下 粒細(xì)胞分離液1: 1. 208 (Percoll比重)； 粒細(xì)胞分離液2: 1.195 (Percoll比重)；粒細(xì)胞分離液3: 1.179 (Percoll比重)； 粒細(xì)胞分離液4: 1.167 (Percoll比重)； 粒細(xì)胞分離液5: 1.155 (Percoll比重)。12)將步驟10)得到的上清白膜層小心加入步驟11)的15 mL離心管分離液的上層界面，每支離心管加不多于5 mL的上清白膜層(主要含有血漿、白細(xì)胞和血小板)。13)室溫500g離心，30分鐘。14)用巴斯德吸管小心吸出上層血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞，移入1支新離
心管待用。15)用巴斯德吸管小心吸出管底(第1層)紅細(xì)胞以上(避免吸出紅細(xì)胞)至第2層分離液液面之間的效應(yīng)細(xì)胞(避免吸出單個(gè)核細(xì)胞)，加入1支15mL離心管，見附圖2。16)加入Iml完全培養(yǎng)基(CM)，計(jì)數(shù)，用CM調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞濃度為lX106/mL，即為效應(yīng)細(xì)胞。Day (1)效應(yīng)細(xì)胞接種96孔板
17)從培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸出各孔培養(yǎng)液。18)根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞為20 1,10 :1、3 1的比例，分別向已加入靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)孔和效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔中加入相應(yīng)數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞(此時(shí)效應(yīng)細(xì)胞的計(jì)算應(yīng)在頭一天的起始數(shù)目加倍，即一天前的5000應(yīng)為10000)，設(shè)只加效應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔、只加靶細(xì)胞的靶細(xì)胞對(duì)照孔和只加CM的空白對(duì)照孔，每孔培養(yǎng)基終體積200 μ L，不足200 μ L的孔補(bǔ)加CM至200 μ L，每組分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔，96孔板布局見附圖1所示
Β2-6 實(shí)驗(yàn)孔(效靶比為20 :1),5000個(gè)靶細(xì)胞/孔，200 μ L/孔效應(yīng)細(xì)胞； Β7-11 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔，200 μ L/孔效應(yīng)細(xì)胞；
C2-6 實(shí)驗(yàn)孔(效靶比為10 :1),5000個(gè)靶細(xì)胞/孔，100 μ L/孔效應(yīng)細(xì)胞，100 μ L/孔
CM ；
C7-11 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔，100 μ L/孔效應(yīng)細(xì)胞，100 μ L/孔CM ；
D2-6 實(shí)驗(yàn)孔(效靶比為3 :1)，5000個(gè)靶細(xì)胞/孔，30yL/孔效應(yīng)細(xì)胞，170yL/孔
CM ；
D7-11 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔，30 μ L/孔效應(yīng)細(xì)胞，170 μ L/孔CM ； Ε2-6 靶細(xì)胞對(duì)照孔，5000個(gè)靶細(xì)胞/孔，200 μ L/孔CM ； E7-11 靶細(xì)胞對(duì)照孔，2500個(gè)靶細(xì)胞/孔，200 μ L/孔CM ； F2-6 靶細(xì)胞對(duì)照孔，1750個(gè)靶細(xì)胞/孔，200 μ L/孔CM ； F7-11 只加CM的空白對(duì)照孔，200 μ L/孔CM。每加一排輕搖培養(yǎng)板和效應(yīng)細(xì)胞懸液，注意(1)使每孔細(xì)胞均勻分布于孔底(避免細(xì)胞聚集于孔的周邊)；(2)邊加細(xì)胞邊混勻效應(yīng)細(xì)胞懸液。19)在37°C，5% CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。Day (2)效應(yīng)細(xì)胞的活性檢測(cè)
20)在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取出96孔培養(yǎng)板，用力用手掌敲打培養(yǎng)板的側(cè)面，將未貼壁的效應(yīng)細(xì)胞搖起，立即用真空泵或排槍將未貼壁細(xì)胞吸棄。吸棄時(shí)，將培養(yǎng)板傾斜45度角，將排槍頭一直插到孔角的最低點(diǎn)。此過程可重復(fù)數(shù)次。將未貼壁的效應(yīng)細(xì)胞搖起后，也可以試著將培養(yǎng)板翻過來用手用力甩干。21)每孔加入200 μ 1生理鹽水，重復(fù)步驟20)。22)每孔加入 100 μ 1 CM 和 10 μ 1 CCK-8 (Cell Counting Kit_8)試劑。23 )在37 °C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h。24)在酶標(biāo)儀上用450-490 nm波長測(cè)各孔吸光度(A值)，計(jì)算出3_5個(gè)復(fù)孔的平均值。25)計(jì)算殺傷率K=I-〔A (效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞)-A效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照/A靶細(xì)胞對(duì)照-A 空白對(duì)照〕*100%。將1-5組的平均A值做曲線圖縱坐標(biāo)為平均A值，橫坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)， 在曲線上找出6-10組平均A值的位置，并推算出相對(duì)細(xì)胞數(shù)(X)。用10，000被6-10組推算出的細(xì)胞數(shù)除，再乘上100%，即得出在一定效靶比時(shí)的CKA值(殺傷率)。殺傷率> 50% 的供體為陽性，所篩選出來的粒細(xì)胞可用于腫瘤治療。在酶標(biāo)儀上用450-490 nm波長測(cè)各孔吸光度(A值)如下下表所示，
234567891011B1. 5891. 7431. 2791. 3741. 5440. 7120. 7240. 7250. 7350. 731C2. 0132. 1542. 1542. 2312. 5330. 7190. 720. 7520. 7430. 741D2. 8162. 9412. 7792. 7882. 9280. 70. 7280. 7280. 7370. 71E2. 9982. 8773. 0653. 3313. 1662. 6322. 6822. 8022. 8892. 764F2. 1051. 921. 9771. 8952. 1820. 7230. 7420. 740. 7510. 745
如表中數(shù)據(jù)所示，單數(shù)據(jù)趨勢(shì)符合理論值，較符合期望值，如5個(gè)復(fù)孔值較均一；效應(yīng)細(xì)胞越多，則殺傷后所剩腫瘤細(xì)胞越少，吸光度值越小。根據(jù)吸光度值的結(jié)果，效靶比為20:1的殺傷率即活性為92%，效靶比為10:1 的殺傷率是74%，效靶比為3:1的殺傷率是58%。根據(jù)接種不同數(shù)量細(xì)胞所測(cè)細(xì)胞吸光度值作圖，如圖3所示，所作曲線也呈正相關(guān)性，符合趨勢(shì)。(接中細(xì)胞為0，1250，2500，5000)
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種粒細(xì)胞分離液，其特征在于，所述粒細(xì)胞分離液是由percollUO倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水配制成，所述percoll、10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水體積比為 3 8:1:1 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粒細(xì)胞分離液，其特征在于，所述的粒細(xì)胞分離液的配制方法為先加入10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水，搖勻，再加入percoll，混勻；所述percoll、 10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水體積比為3 8:1 廣5。
3.一種使用權(quán)利要求所述的粒細(xì)胞分離液進(jìn)行粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟5100、從采集到的血液樣本中分離粒細(xì)胞；5200、對(duì)分離得到的粒細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定活性；所述粒細(xì)胞分離的過程，是用所述粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，將配制好的多個(gè)密度的粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度加入到離心管中，將血液樣本平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上，進(jìn)行室溫離心。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟SlOO具體包括以下步驟5101、在血液樣本中加入紅細(xì)胞沉淀液，使紅細(xì)胞沉淀，取上清白膜層；5102、將配置好的所述粒細(xì)胞分離液按照管底濃管頂稀的密度梯度，將不同密度的粒細(xì)胞分離液加入到離心管中，然后把所述上清白膜層平鋪于粒細(xì)胞分離液的液面上；5103、室溫500g離心30分鐘；5104、用吸管吸出上層血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞，和吸出管底第1層至第2層粒細(xì)胞分離液的液面之間的粒細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟S102中， 所述粒細(xì)胞分離液設(shè)置5個(gè)密度梯度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟S102中， 所述粒細(xì)胞分離液設(shè)置的5個(gè)密度梯度，按Percoll比重為:1.208,1. 195,1. 179,1. 167和 1. 155。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟S200具體包括以下步驟5201、在培養(yǎng)板上，設(shè)置只加粒細(xì)胞的粒細(xì)胞對(duì)照孔、只加靶細(xì)胞的靶細(xì)胞對(duì)照孔和只加CM的空白對(duì)照孔，還有加有粒細(xì)胞和靶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)孔，在所述靶細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔中分別加入腫瘤靶細(xì)胞；5202、分別向粒細(xì)胞對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔的培養(yǎng)孔中加入粒細(xì)胞；5203、混勻，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5204、每孔加入CCK-8試劑；5205、在飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；5206、在酶標(biāo)儀上用450-490nm波長測(cè)各孔吸光度，計(jì)算粒細(xì)胞的殺傷率。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，其特征在于，所述步驟S203和 S205中，都是在37°C、5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種粒細(xì)胞分離液及其粒細(xì)胞分離及活性測(cè)定方法，所述粒細(xì)胞分離液是由percoll、10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水配置而成，所述percoll、10倍磷酸鹽緩沖溶液和生理鹽水體積比為3~8:1:1~5。本發(fā)明主要利用特殊的粒細(xì)胞分離液進(jìn)行分離粒細(xì)胞，進(jìn)而測(cè)定粒細(xì)胞的活性，達(dá)到篩選出高效的粒細(xì)胞的目的，提高粒細(xì)胞治療腫瘤的效果，有利于針對(duì)性選擇供體。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102321582SQ20111025083
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者李曉祥 申請(qǐng)人:深圳市中美康士生物科技有限公司