本發(fā)明涉及細胞的分離方法，具體涉及一種鱘魚外周血淋巴細胞的分離方法。

背景技術：

淋巴細胞參與特異性免疫反應，在免疫應答中起主要作用。魚類的淋巴細胞是白細胞中數量最多的一類，通常占白細胞總量的90％左右，其個體小，含有較大的細胞核。與哺乳動物類似，魚類淋巴細胞包括t淋巴細胞和b淋巴細胞兩種，其中，t淋巴細胞主要介導細胞免疫并在免疫應答中起調節(jié)作用，而b淋巴細胞在體液免疫中參與抗體的合成。對淋巴細胞功能及活化機制等方面的研究一直是免疫學研究的熱點，而制備高活性和高純度的淋巴細胞是進行這些研究的先決條件。

密度梯度離心法是利用不同細胞沉降系數有差異的原理，使細胞在一定離心力作用下以各自的速度沉降，從而形成區(qū)帶，使得不同類型的細胞得以分離和純化。淋巴細胞分離液是基于密度梯度離心原理設計的淋巴細胞分離試劑，利用淋巴細胞分離液能夠獲得高純度的淋巴細胞。但是分離不同種屬外周血中的淋巴細胞要求使用不同質量濃度的分離液。

根據文獻報道，針對鱘魚的淋巴細胞分離液及淋巴細胞分離方法尚未建立。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種鱘魚外周血淋巴細胞的分離方法。

本發(fā)明提供的鱘魚外周血淋巴細胞的分離方法包括如下步驟：將鱘魚外周血加入淋巴細胞分離液中，離心，離心管內液體出現分層，由上至下分別為血漿層、淋巴細胞富集層、淋巴細胞分離液層和紅細胞堆積層；收集所述淋巴細胞富集層，得到鱘魚外周血淋巴細胞；

所述淋巴細胞分離液的制備方法如下：將percoll原液與質量分數為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，得到100％percoll液，再將所述質量分數為0.85％的nacl水溶液與所述100％percoll液按照體積比為3:7的比例混勻，得到淋巴細胞分離液。

上述方法中，所述鱘魚外周血與所述淋巴細胞分離液的體積比為2:1。所述鱘魚外周血為抗凝鱘魚外周血，所述抗凝鱘魚外周血是將鱘魚外周血與抗凝劑混勻得到的，所述抗凝鱘魚外周血中的鱘魚外周血與抗凝劑的體積比為1:1，所述抗凝劑具體為肝素鈉溶液。

上述方法中，所述收集淋巴細胞富集層的方法為用移液器逐層吸取。具體方法如下：使用移液器吸取最上層的血漿層，棄血漿層，然后吸取淋巴細胞富集層。

上述方法中，所述離心的條件為500g離心40min。

上述方法中，所述鱘魚為小體鱘。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法在提高鱘魚外周血淋巴細胞的回收率中的應用。

本發(fā)明還提供了上述方法在提高鱘魚外周血淋巴細胞的存活率中的應用。

本發(fā)明還有一個目的是提供上述淋巴細胞分離液。

上述淋巴細胞分離液在鱘魚外周血淋巴細胞的分離中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種分離鱘魚外周血淋巴細胞的產品。

本發(fā)明提供的分離鱘魚外周血淋巴細胞的產品其包括上述淋巴細胞分離液。

本發(fā)明的方法包括如下步驟：將鱘魚外周血加入淋巴細胞分離液中，離心，離心管內液體出現分層，由上至下分別為血漿層、淋巴細胞富集層、淋巴細胞分離液層和紅細胞堆積層；收集所述淋巴細胞富集層，得到鱘魚外周血淋巴細胞；所述淋巴細胞分離液的濃度為1.092g/ml。本發(fā)明的方法具有操作簡便、回收率高和淋巴細胞存活率高的特點。

附圖說明

圖1為不同比重淋巴細胞分離液分離鱘魚淋巴細胞的效果對比圖。

圖2為淋巴細胞分離液分離鱘魚淋巴細胞結果。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

下述實施例中的全部試劑均需進行滅菌處理，試劑混合需在無菌操作環(huán)境下進行。

下述實施例中的percoll原液購自寶如億(北京)生物技術有限公司，貨號為ge17-0891-01。

下述實施例中的肝素鈉溶液由溶質和溶劑組成，溶劑為質量分數為0.85％的nacl水溶液，溶質為肝素鈉，肝素鈉的質量分數為1％。

下述實施例中的濃度為1.075g/ml、1.080g/ml、1.086g/ml和1.092g/ml的淋巴細胞分離液中的濃度是指實際密度。

實施例1、一種鱘魚外周血淋巴細胞的分離方法

一、不同比重的percoll工作液的配制

配制不同比重的percoll工作液，并置于無菌尖頭離心管中。具體步驟如下：

(1)55％的percoll工作液(濃度為1.075g/ml的淋巴細胞分離液)

55％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液(percoll原液的密度為1.131g/ml)與質量分數為8.5％的nacl水溶液(質量分數為8.5％的nacl水溶液的密度為1.099g/ml)按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質量分數為0.85％的nacl水溶液(質量分數為0.85％的nacl水溶液的密度為1.0099g/ml)與100％percoll液按照體積比為9:11的比例混勻，配制成55％的percoll工作液。

(2)60％的percoll工作液(濃度為1.080g/ml的淋巴細胞分離液)

60％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質量分數為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質量分數為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為4:6的比例混勻，配制成60％的percoll工作液。

(3)65％的percoll工作液(濃度為1.086g/ml的淋巴細胞分離液)

65％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質量分數為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質量分數為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為7:13的比例混勻，配制成65％的percoll工作液。

(4)70％的percoll工作液(濃度為1.092g/ml的淋巴細胞分離液)

70％的percoll工作液的具體配制方法如下：將percoll原液與質量分數為8.5％的nacl水溶液按照體積比為9:1的比例混勻，配制成100％percoll液，再將質量分數為0.85％的nacl水溶液與100％percoll液按照體積比為3:7的比例混勻，配制成70％的percoll工作液。

二、鱘魚外周血淋巴細胞的分離

1、實驗材料

以3尾小體鱘外周血為實驗材料，外周血均為抗凝外周血，抗凝外周血中小體鱘外周血和抗凝劑(肝素鈉水溶液)的體積比為1:1。

2、外周血淋巴細胞的分離

將1.2ml抗凝外周血沿管壁分別緩慢加入到含有0.6ml不同比重(55％、60％、65％和70％)的percoll工作液的無菌尖頭離心管中，擰緊離心管蓋，使用水平轉子(eppendorf5804r臺式高速冷凍離心機，a-4-44水平轉子)500g離心40min。

水平離心后觀察發(fā)現，離心管內液體明顯分為4層(圖1和圖2)，由上至下依次如下：最上層略偏黃色的血漿層、第2層灰白呈膜狀的淋巴細胞富集層、第3層無色透明的淋巴細胞分離液層以及最下層紅色的紅細胞堆積層。

2、外周血淋巴細胞的收集

使用移液器吸取最上層的血漿層，棄血漿層，然后吸取淋巴細胞富集層。

3、淋巴細胞回收率的統(tǒng)計

利用血球計數板對淋巴細胞富集層中的淋巴細胞進行計數，并計算淋巴細胞回收率。淋巴細胞回收率＝從外周血中回收的淋巴細胞數量/同體積外周血中淋巴細胞數量×100％，即表1中的分離的淋巴細胞數量與血液中淋巴細胞數量的比值。

結果如表1所示。從表1中結果可知，70％的percoll工作液，即濃度為1.092g/ml的淋巴細胞分離液，可以從鱘魚外周血中分離出較多的淋巴細胞，平均回收率為89.62+8.08％。

表1、不同密度淋巴細胞分離液的分離效果

4、淋巴細胞存活率的統(tǒng)計

臺盼藍拒染法檢測淋巴細胞存活率。具體步驟如下：將淋巴細胞液(步驟2中吸取的淋巴細胞富集層)與0.4％臺盼藍染液(碧云天，貨號c0011)按照體積比1:1混勻，在3-5min內使用血球計數板進行計數，被染成藍色的是死細胞，無色的為活細胞，并計算回收后的淋巴細胞的存活率。

結果表明：回收后的淋巴細胞存活率均大于99％。