本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是一種高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法。
背景技術(shù)：
：限制性內(nèi)切酶是當(dāng)代基因工程研究不可缺少的一類重要工具酶，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。自20世紀(jì)60年代末第一個限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)之后，越來越多的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)、提純并獲得應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的方法主要是將限制-修飾基因克隆入質(zhì)粒，使用與限制性內(nèi)切酶對應(yīng)的特異性甲基化酶制備限制性內(nèi)切酶，靠質(zhì)粒的高拷貝數(shù)實現(xiàn)目的蛋白高表達，這種方法的制備程序繁瑣、限制性內(nèi)切酶得率低、生產(chǎn)成本高，獲得的甲基化保護的菌株只能特異性保護宿主dna免于某一種限制性內(nèi)切酶的切割，應(yīng)用范圍狹窄。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種操作簡便、成本低、酶活力好的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的，一種高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法，其特點是，包括如下步驟：（1）先將限制性內(nèi)切酶基因插入，再將載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，篩選培養(yǎng)、測序，獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒；所述質(zhì)粒載體為利用乳糖操縱子和t7啟動子調(diào)控，iptg誘導(dǎo)的pet系列表達載體；（2）將限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21（de3）plyss感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株；（3）擴大培養(yǎng)限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株并誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法中，所述的限制性內(nèi)切酶選自：bcli，dpni，dpnii，ecori，hindiii，kpni，mlui，msei，ncoi，ndei，nhei，noti，nsii，nspv，psti，sali，sbfi，sgei，sspi，stui，taqi，xbai，xhoi。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（1）中，所述的質(zhì)粒載體為pet-28b。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（1）中，將限制性內(nèi)切酶基因片段連接至質(zhì)粒載體上后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的lb平板上篩選克隆，測序獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒。進一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100ml，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/ml。進一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為1-1.5g/100ml，卡那霉素的濃度為50-120μg/ml。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（2）中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21（de3）plyss感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb平板上篩選培養(yǎng)，獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株。進一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為0.5-2g/100ml，卡那霉素的濃度為37.5-150μg/ml，氯霉素的濃度為17.5-70μg/ml。進一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖的濃度為1-1.5g/100ml，卡那霉素的濃度為50-120μg/ml，氯霉素的濃度為20-50μg/ml。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（3）中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物接種于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)液中，搖動培養(yǎng)一段時間，加入iptg誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進一步實現(xiàn)。以上所述的方法的步驟（3）中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含0.5-2g/100ml葡萄糖、37.5-150μg/ml卡那霉素和17.5-70μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2-5%接種于含0.5-2g/100ml葡萄糖、37.5-150μg/ml卡那霉素和17.5-70μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3×108-4×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.2-0.5mm，并在15-18℃下以200-250rpm搖動培養(yǎng)12-18h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。進一步優(yōu)選地，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含1-1.5g/100ml葡萄糖、50-120μg/ml卡那霉素和20-50μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2-3%接種于含1-1.5g/100ml葡萄糖、50-90μg/ml卡那霉素和20-50μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于35-37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3.2×108-3.8×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.3-0.4mm，并在16-17℃下以210-240rpm搖動培養(yǎng)14-16h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明方法將限制酶基因克隆至利用乳糖操縱子和t7啟動子調(diào)控、iptg誘導(dǎo)的pet系列表達載體上，通過乳糖操縱子和t7啟動子調(diào)控重組蛋白的表達。由于重組蛋白基因在乳糖或乳糖類似物（如iptg）存在的情況下大量表達，而在無乳糖或乳糖類似物存在的情況下則不表達，因此使用iptg可以人為控制重組蛋白的表達，而在細(xì)菌培養(yǎng)基中可能含有的少量乳糖，會造成重組蛋白的基因在乳糖或乳糖類似物加入前微量表達，即本底表達，如果重組蛋白毒性較強，就會殺死宿主細(xì)胞，使細(xì)胞不能繁殖到適合誘導(dǎo)的濃度。本發(fā)明方法結(jié)合大腸桿菌自身的特點，在培養(yǎng)基中添加了葡萄糖，使宿主細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖不利用乳糖，從而使加入誘導(dǎo)劑iptg前限制性內(nèi)切酶的本底表達受到抑制，保護宿主dna不被限制性內(nèi)切酶切割，保證了宿主細(xì)胞能夠繁殖到適合誘導(dǎo)的細(xì)胞濃度；當(dāng)宿主細(xì)胞的濃度達到適合誘導(dǎo)時，培養(yǎng)基中的葡萄糖已被消耗，且iptg的加入量相對于培養(yǎng)基中的葡萄糖或乳糖都是極大量，加入iptg即誘導(dǎo)限制性內(nèi)切酶開始大量表達。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法利用葡萄糖對乳糖操縱子表達系統(tǒng)本底表達的抑制作用，以及bl21（de3）plyss菌株自身對乳糖操縱子表達系統(tǒng)本底表達的嚴(yán)苛控制作用，省略了對宿主dna的甲基化保護步驟，無需針對某一限制性內(nèi)切酶進行繁瑣的甲基化酶基因篩選，不僅大大簡化了重組表達過程，還可以應(yīng)用于多種限制酶的重組表達，具有較高的應(yīng)用推廣價值。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例22中kpni重組表達質(zhì)粒圖譜；圖2為本發(fā)明實施例22中kpni重組表達的檢測電泳圖；其中：1：蛋白粗酶液特異性酶切條帶；2：λdna（hindiiidigest）（未酶切）；m：dnamarker。圖3為本發(fā)明實施例22中kpni經(jīng)鎳親和柱純化后的電泳圖；其中：1：5mm咪唑；2-3：20mm咪唑；4：400mm咪唑；m：蛋白marker。圖4為本發(fā)明實施例22中kpni經(jīng)陰離子交換層析住純化后的電泳圖；其中：1：100mmkcl；2：300mmkcl；3：500mmkcl；4：700mmkcl；5：1mkcl；m：蛋白marker。圖5為本發(fā)明實施例22中kpni酶活力檢測電泳圖；其中：1：kpni原液稀釋16倍；2：kpni原液稀釋32倍；3：kpni原液稀釋64倍；4：kpni原液稀釋128倍；5：kpni原液稀釋256倍；6：kpni原液稀釋512倍；7：λdna（hindiiidigest）；m：dnamarker。圖6為本發(fā)明實施例22中kpni星號活性及非特異性dna酶污染檢測電泳圖；其中：1-6為kpni酶切底物1h的電泳圖，7-12為kpni酶切底物16h的電泳圖；1、7：kpni原液稀釋16倍；2、8：kpni原液稀釋32倍；3、9：kpni原液稀釋64倍；4、10：kpni原液稀釋128倍；5、11：kpni原液稀釋256倍；6、12：kpni原液稀釋512倍；13：λdna（hindiiidigest）；m：dnamarker。圖7為本發(fā)明實施例22中酶切-連接-再酶切檢測電泳圖；其中：1：kpni酶切commonfragment；2：t4dna連接酶連接后片段；4：kpni再次酶切連接片段；m：dnamarker。具體實施方式以下參照附圖，進一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實施例1，一種高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法，包括如下步驟：（1）先將限制性內(nèi)切酶基因插入，再將載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，篩選培養(yǎng)、測序，獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒；所述質(zhì)粒載體為利用乳糖操縱子和t7啟動子調(diào)控，iptg誘導(dǎo)的pet系列表達載體；（2）將限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21（de3）plyss感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株；（3）擴大培養(yǎng)限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株并誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例2，實施例1所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法，所述的限制性內(nèi)切酶選自：bcli，dpni，dpnii，ecori，hindiii，kpni，mlui，msei，ncoi，ndei，nhei，noti，nsii，nspv，psti，sali，sbfi，sgei，sspi，stui，taqi，xbai，xhoi。實施例3，實施例1所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法，所述的質(zhì)粒載體為pet-28b。實施例4，實施例1所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（1）中，將限制性內(nèi)切酶基因片段連接至質(zhì)粒載體上后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，再涂布于含葡萄糖和卡那霉素的lb平板上篩選克隆，測序獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒。實施例5，實施例4所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為0.5g/100ml，卡那霉素的濃度為37.5μg/ml。實施例6，實施例4所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為2g/100ml，卡那霉素的濃度為150μg/ml。實施例7，實施例4所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1g/100ml，卡那霉素的濃度為75μg/ml。實施例8，實施例4所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1.5g/100ml，卡那霉素的濃度為120μg/ml。實施例9，實施例4所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1g/100ml，卡那霉素的濃度為50μg/ml。實施例10，實施例1所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（2）中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至bl21（de3）plyss感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb平板上篩選培養(yǎng)，獲得限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株。實施例11，實施例10所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為0.5g/100ml，卡那霉素的濃度為37.5μg/ml，氯霉素的濃度為17.5μg/ml。實施例12，實施例10所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為2g/100ml，卡那霉素的濃度為150μg/ml，氯霉素的濃度為70μg/ml。實施例13，實施例10所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1g/100ml，卡那霉素的濃度為75μg/ml，氯霉素的濃度為35μg/ml。實施例14，實施例10所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1g/100ml，卡那霉素的濃度為50μg/ml，氯霉素的濃度為20μg/ml。實施例15，實施例10所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的葡萄糖的濃度為1.5g/100ml，卡那霉素的濃度為120μg/ml，氯霉素的濃度為50μg/ml。實施例16，實施例1所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（3）中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物接種于葡萄糖、卡那霉素和氯霉素的lb培養(yǎng)液中，搖動培養(yǎng)一段時間，加入iptg誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例17，實施例14所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含0.5g/100ml葡萄糖、37.5μg/ml卡那霉素和17.5μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2%接種于含0.5g/100ml葡萄糖、37.5μg/ml卡那霉素和17.5μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于35℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.2mm，并在15℃下以200rpm搖動培養(yǎng)12h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例18，實施例14所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含2g/100ml葡萄糖、150μg/ml卡那霉素和70μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量5%接種于含2g/100ml葡萄糖、150μg/ml卡那霉素和70μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到4×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.5mm，并在18℃下以250rpm搖動培養(yǎng)18h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例19，實施例14所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含1g/100ml葡萄糖、75μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2%接種于含1g/100ml葡萄糖、75μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3.5×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.5mm，并在16℃下以230rpm搖動培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例20，實施例14所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含1g/100ml葡萄糖、50μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2%接種于含1g/100ml葡萄糖、50μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于36℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3.2×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.3mm，并在16℃下以210rpm搖動培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例21，實施例14所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法中，將限制性內(nèi)切酶的重組表達菌株劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含1.5g/100ml葡萄糖、120μg/ml卡那霉素和50μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量3%接種于含1.5g/100ml葡萄糖、120μg/ml卡那霉素和50μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3.8×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.4mm，并在17℃下以240rpm搖動培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達限制性內(nèi)切酶。實施例22，實驗例，本實施例以限制性內(nèi)切酶kpni和pet-28b載體為例來描述本發(fā)明所述的高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法。1、材料1.1菌株與質(zhì)粒肺炎克雷伯氏菌（klebsiellapneumoniae0k8）菌株：購自美國菌種保藏中心（atcc）；bl21（de3）plyss菌株、λdna（hindiiidigest）：購自賽默飛世爾科技有限公司；pet-28b、puc19和共同片段（commonfragment）（大小為894bp的dna片段，核苷酸序列見seqidno.3）：購自江蘇愚公生命科技有限公司。1.2儀器與試劑細(xì)胞高壓破碎儀：購自廣州聚能納米生物科技股份有限公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)：購自金斯瑞生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、kod高保真dna聚合酶、t4dna連接酶和1×cutonebuffer（51mm乙酸鉀（potassiumacetate）、22mm三（羥甲基）氨基甲烷-乙酸（tris-acetate）、10mm鎂離子（magnesium）、0.1mg/mlbsa、ph8.0@25℃）：購自江蘇愚公生命科技有限公司；ni親和層析純化柱（toyopearlaf-chelate-650m）和陰離子交換層析柱（toyopearlgigacapq-650m）：購自日本tosohcorporation；b-per細(xì)菌蛋白提試劑：購自賽默飛世爾科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2、實驗方法2.1kpni基因的pcr擴增根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫上肺炎克雷伯氏菌菌株的kpni基因序列（genbank：wp_004176755.1）設(shè)計一對引物，在上游引物的5’端引入bamhi酶切識別序列和保護堿基，在下游引物的5’端引入xhoi酶切識別序列和保護堿基，上游引物設(shè)計為kpni基因的表達框與質(zhì)粒載體上的n-端6×his純化標(biāo)簽的表達框一致：引物f：5’-ccgcggatccatggatgtgtttgataaagt-3’（下劃線部分為bamhi識別序列）；引物r：5’-tatgctcgagttaacgtttcaggccatagtagt-3’（下劃線部分為xhoi識別序列）。將肺炎克雷伯氏菌菌株平板培養(yǎng)菌落以去離子水重懸后，95℃溫育10min，作為pcr模板，用上述引物pcr擴增kpni基因，獲得了與理論值大小一致的kpni基因dna片段，pcr擴增反應(yīng)使用了kod高保真dna聚合酶。2.2限制性內(nèi)切酶kpni的重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建kpni的pcr產(chǎn)物純化后用bamhi和xhoi雙酶切，酶切產(chǎn)物用t4連接酶連接至由bamhi和xhoi雙酶切后的pet-28b載體上，得到環(huán)狀dna連接產(chǎn)物，其中，kpni基因dna的插入部位處于t7啟動子的調(diào)控之下；通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含1g/100ml葡萄糖和75μg/ml卡那霉素的lb平板上篩選克隆，經(jīng)測序獲得kpni的重組表達質(zhì)粒，并將其命名為pet-kpni（見附圖1）。2.3限制性內(nèi)切酶kpni的重組表達菌株的構(gòu)建用pet-kpni轉(zhuǎn)化bl21（de3）plyss感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含1g/100ml葡萄糖、75μg/ml卡那霉素、35μg/ml氯霉素的lb平板上篩選培養(yǎng)，獲得kpni的重組表達菌株，將該菌株命名為plyss-kpni。2.4目的蛋白的誘導(dǎo)表達及瓊脂糖凝膠電泳檢測將plyss-kpni劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含1g/100ml葡萄糖、75μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)過夜，將得到的培養(yǎng)物按接種量2%接種于含1g/100ml葡萄糖、75μg/ml卡那霉素和35μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)液中，于37℃搖動培養(yǎng)，至菌密度達到3×108-4×108/ml時，加入iptg至終濃度為0.5mm，并在16℃下以200-250rpm搖動培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達kpni。為了驗證目的蛋白是否存在，進行了瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測過程如下：取1ml蛋白表達后的菌液，以4000g離心10min，棄去上清，收集菌體，然后用b-per細(xì)菌蛋白提取試劑對菌體總蛋白進行提取，得細(xì)菌蛋白粗體液；取1-3μl細(xì)菌蛋白粗提液，在1×cutonebuffer緩沖條件下、20μl反應(yīng)體系中，與底物λdna（hindiiidigest）在37℃溫育15min，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測底物λdna（hindiiidigest）被細(xì)菌蛋白粗提液消化的情況（見附圖2）。結(jié)果顯示，底物λdna（hindiiidigest）被細(xì)菌蛋白粗提液消化后形成了限制性內(nèi)切酶kpni的特異性酶切條帶，即大小為1700bp的片段（以λdna（hindiiidigest）為底物時，該條帶只能由kpni酶切獲得），與理論值一致，表明細(xì)菌蛋白粗提液具有限制酶kpni的活性，限制酶kpni的重組表達成功。2.5目的蛋白的純化取適量蛋白表達后的plyss-kpni菌液，以4000g離心10min收集菌體，菌體以緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，50mmkcl，5%甘油，5mm咪唑）充分重懸后，以細(xì)胞高壓破碎儀破碎，以43000g4℃離心30min，收集上清液。上清液分別通過ni親和層析柱、陰離子交換層析柱進行純化，整個純化過程在4?c或冰浴上進行。2.5.1ni親和層析純化取上清液過ni親和層析純化柱，分步收集洗脫液，將單管收集的洗脫液進行sds-page電泳檢測（見附圖3）。其中，ni親和層析過程中使用的緩沖液為：平衡緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，50mmkcl，5%甘油，5mm咪唑）、漂洗緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，50mmkcl，5%甘油，20mm咪唑）（漂洗2次）和洗脫緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，50mmkcl，5%甘油，400mm咪唑）。由圖3可知，泳道4的蛋白量要普遍高于其他泳道，因此將該泳道對應(yīng)的緩沖液洗脫下的幾管洗脫液混合、透析。2.5.2陰離子交換層析純化將上一步透析后的洗脫液過陰離子交換層析柱進一步純化，梯度洗脫，分步收集，對不同濃度洗脫液洗脫到的樣液進行sds-page電泳檢測（見附圖4）。其中，陰離子交換層析過程中使用的緩沖液為：平衡緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，100mmkcl，5%甘油，1mmdtt，0.1mmedta）和梯度洗脫液（10mmtris-hclph7.4@25℃，5%甘油，1mmdtt，0.1mmedta及kcl，其中，kcl的濃度自100mm→300mm→500mm→700mm→1m，呈梯度變化）。由圖4可知，泳道1和2，即通過含100mmkcl和300mmkcl的洗脫液洗脫得到的樣液中蛋白含量和純度要高于其他濃度洗脫得到的樣液，將這兩種濃度的洗脫液洗脫下的樣液合并后，透析至貯存緩沖液（10mmtris-hclph7.4@25℃，50mmkcl，50%甘油，1mmdtt，0.1mmedta），并添加bsa至終濃度0.2mg/ml，得到kpni原液，保存于-20℃。2.6酶活性檢測限制酶kpni的酶活定義為：37℃下，在20μl反應(yīng)體系中，1μl酶能夠在15min內(nèi)完全消化1μgλdna（hindiiidigest）。對得到的kpni原液進行梯度稀釋后，在1×cutonebuffer緩沖條件下、20μl反應(yīng)體系中，與底物λdna（hindiiidigest）在37℃溫育15min，然后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測底物λdna（hindiiidigest）的酶切情況（見附圖5）。由檢測結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明方法純化獲得的限制性內(nèi)切酶kpni具有良好的酶切活力，比活力為128000u/mg，產(chǎn)率為128000u/l誘導(dǎo)菌液。2.7限制性內(nèi)切酶kpni的質(zhì)量檢測2.7.1星號活性/非特異性dna酶污染檢測對kpni原液進行梯度稀釋后，在1×cutonebuffer緩沖條件下、20μl反應(yīng)體系中，底物λdna（hindiiidigest）在37?c溫育60min及16h，然后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測底物λdna（hindiiidigest）的酶切情況（見附圖6）。結(jié)果顯示，高酶量（8u）1h及超長時間（16h）酶切均未觀察到底物λdna產(chǎn)生非特異性降解條帶，說明測試的酶中不存在非特異性的dna酶，表明根據(jù)本實施例生產(chǎn)的酶合格。2.7.2酶切-連接-再酶切檢測20倍酶量的kpni在1×cutonebuffer緩沖條件下、20μl反應(yīng)體系中，與底物commonfragment（見seqidno.3）在37℃溫育15min獲得酶切片段，將這些片段用t4dna連接酶連接，所得連接產(chǎn)物超過95%可以被限制性內(nèi)切酶kpni再次切開，再酶切結(jié)果中無雜帶、無拖尾，表明本實施例所純化的kpni完全達到了限制性內(nèi)切酶的分子生物學(xué)實驗要求（見附圖7），2.7.3藍白斑篩選鑒定使用8倍或16倍酶量的限制酶kpni線性化puc19載體后，連接并轉(zhuǎn)化該載體進入表達laczbetafragment的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并涂x-gal/iptg/amp平板，結(jié)果見表1。在藍白斑鑒定中，本發(fā)明實施例生產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的白斑（白色菌落）比例僅為0.1-0.34%，結(jié)果合格。表1.藍白斑篩選鑒定數(shù)據(jù)統(tǒng)計表編號酶量白斑數(shù)總斑數(shù)白斑比例背景藍斑18u3396330.340%19136216u27251790.107%3904sequencelisting<110>淮海工學(xué)院<120>一種高效重組表達限制性內(nèi)切酶的方法<130>2017<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物f<400>1ccgcggatccatggatgtgtttgataaagt30<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物r<400>2tatgctcgagttaacgtttcaggccatagtagt33<210>3<211>894<212>dna<213>人工序列<400>3ggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtt60atcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg120cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacg180caaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcc240cgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggc300accccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggata360acaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcgcggccgc420tgcaggctagcgtcgactctagagatatcccatggggatccccgggtacccatatggagc480tcctcgaggaattctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcg540ttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaag600aggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctga660tgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatttggtgcactctca720gtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctg780acgcgccctgaccaggtcgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtga840ccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcg894當(dāng)前第1頁12