本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，用于檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶三種細(xì)菌耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌藥物是臨床應(yīng)用最廣泛的一類藥物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素濫用，耐藥菌帶來(lái)的用藥困難。我國(guó)是抗生素濫用情況最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，然而隨著抗生素使用量的加大，細(xì)菌耐藥情況也越發(fā)嚴(yán)重。

抗生素種類繁多，作用機(jī)制多樣，其中β-內(nèi)酰胺類抗生素是指其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類，包括青霉素類、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、單環(huán)內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類等，可通過(guò)結(jié)合在青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)上，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁合成已達(dá)到抑菌滅菌的目的。

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，主要分為產(chǎn)生滅活酶、抗菌藥物作用靶位改變、改變細(xì)菌外膜通透性、影響主動(dòng)泵出系統(tǒng)、影響細(xì)菌被膜的形成及交叉耐藥性等六方面。

部分細(xì)菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，即細(xì)菌產(chǎn)生的能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的滅活酶，它是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。根據(jù)《產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌感染防治專家共識(shí)》中所述，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Sperctrumβ-Lactamases,ESBLs)是一類主要由大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌由于體內(nèi)相關(guān)耐藥基因的存在，而產(chǎn)生的一類耐藥形式。即細(xì)菌在持續(xù)的各種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的選擇壓力下，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的及不斷變異的β-內(nèi)酰胺酶，它擴(kuò)展了其耐受頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟等第3代及第4帶頭孢菌素，以及氨曲南等單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的能力。

目前關(guān)于對(duì)細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)主要有以下幾種方法：細(xì)菌耐藥表型的檢測(cè)(包括耐藥篩選試驗(yàn)、折點(diǎn)敏感試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)的儀器化和自動(dòng)化等)，β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)，特殊耐藥菌檢測(cè)和耐藥基因檢測(cè)等。其中最為直觀的檢測(cè)方法是以體外培養(yǎng)的藥物檢測(cè)，但仍存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等缺陷。隨著耐藥機(jī)理的研究逐步深入，分子生物學(xué)方法檢測(cè)細(xì)菌耐藥逐漸被臨床接受。常見(jiàn)檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的方法主要有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、生物芯片技術(shù)(gene chip)、自動(dòng)DNA測(cè)序(DNA sequencing)等。傳統(tǒng)的基因鑒定方法為PCR法和DNA測(cè)序法，其中傳統(tǒng)的PCR法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，通常需要3-4個(gè)小時(shí)；SangerDNA測(cè)序法對(duì)引物特異性要求較高，且價(jià)格較昂貴，后期數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，不適合臨床推廣使用。近年新發(fā)展起來(lái)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，無(wú)論是在反應(yīng)時(shí)間還是儀器要求方面，都比PCR技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)。在這些眾多等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，又以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的應(yīng)用最為成熟、最為廣泛，其高靈敏度、高特異性、快速的擴(kuò)增得到了市場(chǎng)的檢驗(yàn)和認(rèn)可。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)產(chǎn)ESBL酶的三種耐藥基因LAMP引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ組成；

(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ和所述引物組Ⅲ中的任意兩個(gè)組成；

(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ或所述引物組Ⅲ；

所述引物組Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成；

所述引物Ⅰ-F3為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3為如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-FIP為如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(b6)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-BIP為如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(b8)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LF為如下(b9)或(b10)；

(b9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；

(b10)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LB為如下(b11)或(b12)；

(b11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；

(b12)將序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB組成；

所述引物Ⅱ-F3為如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(c2)將序列7經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-B3為如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(c4)將序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-FIP為如下(c5)或(c6)；

(c5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；

(c6)將序列9經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-BIP為如下(c7)或(c8)；

(c7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；

(c8)將序列10經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LF為如下(c9)或(c 10)；

(c9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；

(c10)將序列11經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LB為如下(c11)或(c12)；

(c11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；

(c12)將序列12經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB組成；

所述引物Ⅲ-F3為如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；

(d2)將序列13經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-B3為如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子；

(d4)將序列14經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-FIP為如下(d5)或(d6)；

(d5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；

(d6)將序列15經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-BIP為如下(d7)或(d8)；

(d7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；

(d8)將序列16經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LF為如下(d9)或(d10)；

(d9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子；

(d10)將序列17經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LB為如下(d11)或(d12)；

(d11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子；

(d12)將序列18經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅰ中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩爾比可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅱ中，所述引物Ⅱ-F3、所述引物Ⅱ-B3、所述引物Ⅱ-FIP、所述引物Ⅱ-BIP、所述引物Ⅱ-LF和所述引物Ⅱ-LB的摩爾比可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅲ中，所述引物Ⅲ-F3、所述引物Ⅲ-B3、所述引物Ⅲ-FIP、所述引物Ⅲ-BIP、所述引物Ⅲ-LF和所述引物Ⅲ-LB的摩爾比可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅰ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅰ-F3、0.5μmol所述引物Ⅰ-B3、2.0μmol所述引物Ⅰ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅰ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅰ-LF和1.0μmol所述引物Ⅰ-LB；

所述引物組Ⅱ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅱ-F3、0.5μmol所述引物Ⅱ-B3、2.0μmol所述引物Ⅱ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅱ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅱ-LF和1.0μmol所述引物Ⅱ-LB；

所述引物組Ⅲ中，各引物的量如下：0.5μmol所述引物Ⅲ-F3、0.5μmol所述引物Ⅲ-B3、2.0μmol所述引物Ⅲ-FIP、2.0μmol所述引物Ⅲ-BIP、1.0μmol所述引物Ⅲ-LF和1.0μmol所述引物Ⅲ-LB。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)檢測(cè)待測(cè)菌是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e2)鑒定產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e3)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)檢測(cè)待測(cè)菌是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e2)鑒定產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因；

(e3)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因。

所述試劑盒還可包括反應(yīng)液，所述反應(yīng)液具體可為博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440020。

本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)菌是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因的方法，包括：

(1)提取待測(cè)菌的基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，分別采用所述引物組合中的每個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：

如果采用所述引物組Ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌含有或候選含有耐藥基因CTX-M-1基因；

如果采用所述引物組Ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌含有或候選含有耐藥基因CTX-M-9基因；

如果采用所述引物組Ⅲ可以實(shí)現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)菌含有或候選含有耐藥基因GES-1基因。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因的方法，包括：

(1)提取待測(cè)樣本的總DNA；

(2)以步驟(1)提取的總DNA為模板，分別采用所述引物組合中的每個(gè)引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行如下判斷：

如果采用所述引物組Ⅰ可以實(shí)現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有耐藥基因CTX-M-1基因；

如果采用所述引物組Ⅱ可以實(shí)現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有耐藥基因CTX-M-9基因；

如果采用所述引物組Ⅲ可以實(shí)現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)樣本中含有或疑似含有耐藥基因GES-1基因。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅰ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅱ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅲ時(shí)，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為：65℃恒溫50min。

所述待測(cè)樣本可為人(Homo sapiens)的膿液。

上文中，所述實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增具體可體現(xiàn)為：在利用熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可出現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增曲線。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增曲線可為為典型的“S型”擴(kuò)增曲線。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在檢測(cè)待測(cè)菌是否含有耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES基因中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在鑒定產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和/或GES-1基因中的應(yīng)用。

上文中，耐藥基因CTX-M-1基因的Genebank號(hào)為KT459487.1。耐藥基因CTX-M-9基因的Genebank號(hào)為KP128034.1。耐藥基因GES-1基因的Genebank號(hào)為GU831563.1。耐藥基因CTX-M-1基因、CTX-M-9基因和GES-1基因均屬產(chǎn)ESBL酶的三種細(xì)菌耐藥基因，這三種基因均耐含β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated i sothermal ampl ificat ion,LAMP)是近年來(lái)發(fā)展出的一種敏感、特異、簡(jiǎn)便、快捷的核酸擴(kuò)增技術(shù),其原理是在一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，識(shí)別6-8個(gè)區(qū)域的4-6條引物，在等溫條件下快速、特異地?cái)U(kuò)增目的基因，可推廣應(yīng)用于快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)常見(jiàn)的碳青霉烯類耐藥基因。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時(shí)間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明提供的引物組合鑒定用于檢測(cè)常見(jiàn)的三種超廣譜β-內(nèi)酰胺耐藥基因，具有高特異性和高靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。本發(fā)明具有重大的推廣價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中采用引物組Ⅰ的檢測(cè)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例2中采用引物組Ⅱ的檢測(cè)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例2中采用引物組Ⅲ的檢測(cè)結(jié)果。

圖4為實(shí)施例4中樣本一的檢測(cè)結(jié)果。

圖5為實(shí)施例4中樣本二的檢測(cè)結(jié)果。

圖6為實(shí)施例4中樣本三的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

反應(yīng)液為博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440020。

DNA拷貝數(shù)的計(jì)算方法如下：

1A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；

核酸濃度＝(OD260)×(稀釋倍數(shù))×(50)＝x ng/μl；

平均分子量(MW)代表克/摩爾，單位道爾頓(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩爾＝6.02×10²³；

平均分子量(MW):dsDNA＝(堿基數(shù))×(660道爾頓/堿基)；

拷貝數(shù)計(jì)算公式:

(6.02×10²³copies/摩爾)×(x ng/μl×10^-9)/(DNA長(zhǎng)度×660)＝copies/μl。

實(shí)施例1、引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ的制備

試劑盒由三個(gè)LAMP引物組組成，每個(gè)引物組用于檢測(cè)一種產(chǎn)ESBL酶耐藥基因。

用于檢測(cè)耐藥基因CTX-M-1引物組如下(5’→3’)：

外引物F3(序列1)：TGATTTCTCACGTTGGC；

外引物B3(序列2)：CAGCCTGAATGCTCGCT；

內(nèi)引物FIP(序列3)：TATCACGCGGATCGCCCGTCCGTCTCGACCGTACC；

內(nèi)引物BIP(序列4)：TGGCGCAAACTCTGCGGAATTTTCATCCATGTCACCAGC；

環(huán)引物L(fēng)F(序列5)：TGTTTAACGTCGGCTC；

環(huán)引物L(fēng)B(序列6)：CTGGGTAAAGCATTGGG。

用于檢測(cè)耐藥基因CTX-M-9引物組如下(5’→3’)：

外引物F3(序列7)：CCTGTCGAGATCAAGCCT；

外引物B3(序列8)：ACGTCTCATCGCCGATC；

內(nèi)引物FIP(序列9)：AGCGTCATTGTGCCGTTGAGCCGATCTGGTTAACTACAATCC；

內(nèi)引物BIP(序列10)：CCGCGTTGCAGTACAGCGACAAAAGCCGTCACGCCTC；

環(huán)引物L(fēng)F(序列11)：CGTGTTTTTCGGCAATC；

環(huán)引物L(fēng)B(序列12)：TACCGCCATGAACAAATT。

用于檢測(cè)耐藥基因GES-1引物組如下(5’→3’)：

外引物F3(序列13)：ACCTCAGAGATACAACTACG；

外引物B3(序列14)：TGGCGCAGGTACCAGTT；

內(nèi)引物FIP(序列15)：CGAGGTGGACGTCAGTGCCCTATTGCTATGGCACGTACT；

內(nèi)引物BIP(序列16)：ACCCACACCATTGAGAGGTGGAACCCAATCTTTAGGAAAACCCG；

環(huán)引物L(fēng)F(序列17)：CGCCATAGAGGACTTTAGCCAC；

環(huán)引物L(fēng)B(序列18)：CTGATCGGAAACCAAACGGGA。

用于檢測(cè)耐藥基因CTX-M-1的引物組命名為引物組Ⅰ。用于檢測(cè)耐藥基因CTX-M-9的引物組命名為引物組Ⅱ。用于檢測(cè)耐藥基因GES的引物組命名為引物組Ⅲ。

檢測(cè)產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ組成，該引物組合中，各單鏈DNA各自獨(dú)立包裝。

引物組Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾比為0.5：0.5：2：2：1：1；

引物組Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾比為0.5：0.5：2：2：1：1；

引物組Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾比為0.5：0.5：2：2：1：1。

實(shí)施例2、產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合的特異性

一、待測(cè)樣本的制備

待測(cè)樣本1：耐藥基因CTX-M-1基因質(zhì)粒。

待測(cè)樣本2：耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒。

待測(cè)樣本3：耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒。

各質(zhì)粒的制備方法如下：

耐藥基因CTX-M-1基因質(zhì)粒：將-T Easy質(zhì)粒(Promega)的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號(hào)為KT459487.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為耐藥基因CTX-M-1基因質(zhì)粒。

耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒：將-T Easy質(zhì)粒(Promega)的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號(hào)為KP128034.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒。

耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒：在pUC57質(zhì)粒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的MCS間插入Genebank號(hào)為GU831563.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒。

二、待測(cè)樣本的檢測(cè)

各個(gè)待測(cè)樣本分別進(jìn)行如下步驟進(jìn)行檢測(cè)：

以步驟一的質(zhì)粒DNA為模板，分別采用實(shí)施例1制備的引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ對(duì)步驟一制備的三個(gè)質(zhì)?！退幓駽TX-M-1基因質(zhì)粒、耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒和耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，每個(gè)引物組合均檢測(cè)三種質(zhì)粒。

反應(yīng)體系(10μL)：7.0μL反應(yīng)液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440020)、1μL引物混合物、1μL模板DNA(5pg-50pg)，補(bǔ)水至10μL。引物混合物即引物組Ⅰ、引物組Ⅱ或引物組Ⅲ中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物F3和外引物B3的終濃度均為0.5μM，內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP的終濃度均為2μM，環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的終濃度均為1μM。

反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。

反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

采用引物組Ⅰ的結(jié)果見(jiàn)圖1。只有當(dāng)待測(cè)樣本為耐藥基因CTX-M-1基因質(zhì)粒的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(即擴(kuò)增曲線為典型的“S型”擴(kuò)增曲線)。當(dāng)待測(cè)樣本為待測(cè)樣本2、3的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。圖1中“S型”擴(kuò)增曲線為待測(cè)樣本1的結(jié)果；圖1中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為待測(cè)樣本2和待測(cè)樣本3的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

采用引物組Ⅱ的結(jié)果見(jiàn)圖2。只有當(dāng)待測(cè)樣本為耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(即擴(kuò)增曲線為典型的“S型”擴(kuò)增曲線)。當(dāng)待測(cè)樣本為待測(cè)樣本1、3的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。圖2中“S型”擴(kuò)增曲線為待測(cè)樣本2的結(jié)果；圖2中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為待測(cè)樣本1和待測(cè)樣本3的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

采用引物組Ⅲ的結(jié)果見(jiàn)圖3。只有當(dāng)待測(cè)樣本為耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(即擴(kuò)增曲線為典型的“S型”擴(kuò)增曲線)。當(dāng)待測(cè)樣本為待測(cè)樣本1、2的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。圖3中“S型”擴(kuò)增曲線為待測(cè)樣本3的結(jié)果；圖3中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為待測(cè)樣本1和待測(cè)樣本2的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合中的三個(gè)引物組分別對(duì)其靶標(biāo)基因和有很高的特異性。

實(shí)施例3、產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合的靈敏性

待測(cè)樣本1：實(shí)施例2的耐藥基因CTX-M-1基因質(zhì)粒。

待測(cè)樣本2：實(shí)施例2的耐藥基因CTX-M-9基因質(zhì)粒。

待測(cè)樣本3：實(shí)施例2的耐藥基因GES-1基因質(zhì)粒。

1、提取待測(cè)樣本的質(zhì)粒DNA，用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，得到各個(gè)稀釋液。

2、以步驟1得到的稀釋液為模板，分別采用實(shí)施例1制備的引物組Ⅰ、引物組Ⅱ和引物組Ⅲ進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

待測(cè)樣本為待測(cè)樣本1時(shí)，采用引物組Ⅰ進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。待測(cè)樣本為待測(cè)樣本2時(shí)，采用引物組Ⅱ進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。待測(cè)樣本為待測(cè)樣本3時(shí)，采用引物組Ⅲ進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

反應(yīng)體系(10μL)：7.0μL反應(yīng)液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440020)、1μL引物混合物、1μL稀釋液(1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數(shù)分別為10³、5×10²、10²或10¹)，補(bǔ)水至10μL。引物混合物即引物組Ⅰ、引物組Ⅱ或引物組Ⅲ中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物F3和外引物B3的終濃度均為0.5μM，內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP的終濃度均為2μM，環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的終濃度均為1μM。

反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。

反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

如果在50min內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(即擴(kuò)增曲線為典型的“S型”擴(kuò)增曲線)，表明反應(yīng)體系中的相應(yīng)基因組含量可以被檢測(cè)出來(lái)。如果在50min內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(即擴(kuò)增曲線為典型的“S型”擴(kuò)增曲線)，表明反應(yīng)體系中的相應(yīng)基因組含量不能被檢測(cè)出來(lái)。

引物組Ⅰ檢測(cè)靶標(biāo)基因的靈敏度為5×10²個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅱ檢測(cè)靶標(biāo)基因的靈敏度為5×10²個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅲ檢測(cè)靶標(biāo)基因的靈敏度為5×10²個(gè)拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。

實(shí)施例4、利用產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合檢測(cè)臨床樣本

待測(cè)樣本為如下樣本一、樣本二或樣本三：

樣本一：已通過(guò)藥敏鑒定及PCR測(cè)序鑒定確認(rèn)含有CTX-M-1基因的人的膿液；

樣本二：已通過(guò)藥敏鑒定及PCR測(cè)序鑒定確認(rèn)含有CTX-M-9基因的人的膿液；

樣本三：已通過(guò)藥敏鑒定及PCR測(cè)序鑒定確認(rèn)含有GES-1基因的人的膿液。

1、提取待測(cè)樣本的總DNA。

2、以步驟1提取的總DNA為模板，分別采用實(shí)施例1制備的各個(gè)引物組對(duì)這三個(gè)樣本進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，每個(gè)引物組合均檢測(cè)三種樣本。

反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均同實(shí)施例2。

反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

樣本一的結(jié)果見(jiàn)圖4。只有采用引物組Ⅰ檢測(cè)的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。當(dāng)采用引物組Ⅰ以外的其它兩個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，與實(shí)際情況一致。圖4“S型”擴(kuò)增曲線為引物組Ⅰ的結(jié)果；圖4中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為引物組Ⅱ和引物組Ⅲ的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

樣本二的結(jié)果見(jiàn)圖5。只有采用引物組Ⅱ檢測(cè)的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。當(dāng)采用引物組Ⅱ以外的其它兩個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，與實(shí)際情況一致。圖5中“S型”擴(kuò)增曲線為引物組Ⅱ的結(jié)果；圖5中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為引物組Ⅰ和引物組Ⅲ的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

樣本三的結(jié)果見(jiàn)圖6。只有采用引物組Ⅲ檢測(cè)的時(shí)候顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線。當(dāng)采用引物組Ⅲ以外的其它兩個(gè)引物組的時(shí)候均不顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，與實(shí)際情況一致。圖6中“S型”擴(kuò)增曲線為引物組Ⅲ的結(jié)果；圖6中非“S型”擴(kuò)增曲線中有各有一條分別為引物組Ⅰ和引物組Ⅱ的結(jié)果，其余均為未添加模板的結(jié)果。

以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的產(chǎn)ESBL酶的耐藥基因的引物組合可以進(jìn)行三種常見(jiàn)產(chǎn)ESBL酶耐藥基因的檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

<110> 博奧生物集團(tuán)有限公司

<120> 用于檢測(cè)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶三種細(xì)菌耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tgatttctca cgttggc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

cagcctgaat gctcgct 17

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tatcacgcgg atcgcccgtc cgtctcgacc gtacc 35

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tggcgcaaac tctgcggaat tttcatccat gtcaccagc 39

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tgtttaacgt cggctc 16

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

ctgggtaaag cattggg 17

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

cctgtcgaga tcaagcct 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

acgtctcatc gccgatc 17

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

agcgtcattg tgccgttgag ccgatctggt taactacaat cc 42

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

ccgcgttgca gtacagcgac aaaagccgtc acgcctc 37

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

cgtgtttttc ggcaatc 17

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

taccgccatg aacaaatt 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

acctcagaga tacaactacg 20

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

tggcgcaggt accagtt 17

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

cgaggtggac gtcagtgccc tattgctatg gcacgtact 39

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

acccacacca ttgagaggtg gaacccaatc tttaggaaaa cccg 44

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

cgccatagag gactttagcc ac 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

ctgatcggaa accaaacggg a 21